Este trabalho foi financiado pelo National Institutes of Health Grants NS-38849 e DK-076160, o Juvenile Diabetes Research Foundation Centro para o Estudo das Complicações em Diabetes, o Programa de Neurologia Pesquisa e Descoberta e A. Alfred Taubman O Instituto de Pesquisa Médica no Universidade de Michigan. Este trabalho utilizou a Morfologia e Core Image Analysis do Centro de Pesquisa e Treinamento Michigan Diabetes, financiado pelo National Institutes of Health Grant 5P60 DK-20572 do Instituto Nacional de Diabetes e Doenças Digestivas e Renais. Os autores agradecem Scott T. Clarke da Molecular Probes / Invitrogen pelos seus conselhos valiosos sobre as várias Click-iT Edu rotulagem kits ea generosa doação de reagentes para apoiar o desenvolvimento inicial da técnica de amplificação de Edu.

1. Preparação de Neurônios <ol><li> Gânglio da raiz dorsal (DRG) os neurônios são cultivadas em estéril (autoclavada) 12 milímetros lamínulas de vidro em uma placa de cultura de 24 poços. </li><li> O estoque de 10 mM de Edu (em DMSO, Click-iT Edu Microplate Assay Kit) é tipicamente diluído 1:100 em meio de cultura para fazer uma solução Edu 10X (100 mM) e depois diluído 1:10 na cultura poços (por exemplo, 30 mL da solução 10X Edu em um total de 300 mL de meio de cultura). Neurônios DRG são incubados com uma concentração final de 10 mM Edu a 37 ° C e 5% CO 2 entre 24/02 horas. A duração do tempo depende de como os tratamentos afetam a taxa de síntese de mtDNA. </li><li> Em um exaustor, os neurônios DRG são fixadas em paraformaldeído 2% por 10-15 min em temperatura ambiente, lavados duas vezes em 1X PBS 2-5 minutos cada lavagem e armazenadas em 1X PBS fresco por até um mês a 4 ° C. </li><li> Lamínulas são transferidos com pinças de ponta fina para uma câmara úmida preparada (Corning prato Bioensaio com fundo forrado preto para contraste, envolto em papel alumínio para proteger componentes sensíveis a luz e umedecido com água saturada Kimwipes) e colocados em uma folha de Parafilm M que fornece uma superfície hidrofóbica para confinar as soluções para as lamelas. O protocolo a seguir é projetado para 28 lamínulas e soluções são preparadas para 32 lamínulas (cerca de 14% do volume extra). Soluções com componentes caros ou limitados são feitas de modo que 75-80 mL são usados ​​em cada lamela. Caso contrário, 200-300 mL são usadas para soluções de lavagem e bloco para lavar as soluções anteriores. </li><li> Recandidatar-se 1X PBS para cobrir a superfície de cada lamela (200-300 mL). Prepare o ensaio Click-lo e kits de amplificação de sinal tiramida como descrito abaixo e nas instruções do fabricante. </li></ol> Preparação de Click-iT Edu Microplate Assay Kit A maioria dos componentes do Click-iT Kit de Ensaio Edu Microplate vêm pré-fabricados e armazenados a 4 ° C [2x Click-iT Tampão de reacção (E Component 10x), CuSO4 (100 mM, Componente F), Click-iT Edu fixador ( componente D) e Tampão de bloqueio (2x componente H)]. Click-iT Aditivo buffer Edu (10x Component G) é armazenada a -20 ° C para evitar que ele gire amarelo-castanho ao longo do tempo. Este componente tolera repetidos ciclos de congelamento e descongelamento. O Oregon 488 azida Verde (Componente B) deve ser dividida em pequenas alíquotas (10-20 mL) para minimizar os ciclos de congelamento e descongelamento e armazenadas a -20 ° C. Para preparar uma solução estoque do anti-Oregon Verde HRP (Componente I), adicionar 75 mL de Milli Q dH 2 O para o frasco. Mix pipetando suave ou por inversão para evitar a formação de espuma e armazenar a 4 ° C. Não vortex. Preparação de TSA Kit # 12, com a cabra HRP Anti-IgG de coelho e Alexa Fluor 488 Kit tiramida Para preparar a solução estoque tiramida, dissolver o material sólido (Alexa Fluor 488 tiramida Componente, A) em 150 mL de DMSO (Componente B). Inverter o frasco várias vezes para dissolver qualquer revestimento tiramida os lados do frasco. Solução de armazenamento de estoque em pequenas alíquotas (10-20 mL) a ≤ -20 ° C, desidratado e protegido da luz. 2. Click-iT 5 ethynyl-2-deoxiuridina (Edu) Rotulagem NOTA: Todas as soluções são retirados com uma pipeta de bulbo com uma ponta de 200 mL aposta no fim para remover suavemente as células líquidos sem perder. Evitar o uso de uma linha de vácuo, que geralmente remove soluções muito vigorosamente. Uma pipeta de lâmpada é usado para suavemente inundação lamínulas com 200-300 mL de soluções de lavagem para lavar a solução anterior. <ol><li> Células são permeabilizadas com 0,1% Triton-X-100 em 1X solução PBS por 10 minutos em temperatura ambiente em câmara úmida coberta. Use 1% Triton-X-100 soluções estoque. <ul><li> Fazer 3000 mL de 0,1% Triton-X-100, adicionando 300% 1 mL de Triton-X-100 ações para 2700μL 1X PBS. </li><li> Use 75-80 mL por lamínula. </li></ul></li><li> Remover o Triton X-100 da solução e enxaguar duas vezes com PBS 1X. </li><li> Atividade da peroxidase endógena se apaga por um 1% H 2 O 2 em 1X solução PBS por 30 minutos em temperatura ambiente. Diluir 30% H 2 O 2 com solução de 1X PBS. Esta solução deve ser feita fresco, mas pode ser feito durante a etapa de permeabilização 10 minutos acima (passo 3.1). <ul><li> Fazer 3000 mL de 1% H 2 O 2 pela adição de 100% 30 mL H 2 O 2-2900 mL 1X PBS. </li><li> Use 75-80 mL por lamínula. </li><li> Remover a solução peroxidase e enxaguar duas vezes com PBS 1X. </li></ul></li><li> Click-iT Reação Edu <ul><li> Para 32 lamelas (32 x 80 mL =2560 mL) um total de 2560 mL é necessário. A reação é feita 2x em 1280 mL, que é a metade do volume total da reação. </li><li> Recém preparar o Cocktail Reação Click-lo antes de iniciar a correção pós 5 minutos (passo 3.5). </li><li> Misture o cocktail pipetando cima e para baixo. Não vortex ao fazer essa reação. <table border="1" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> 2 Cocktail x Reação Componentes são de Click-iT Edu Microplate Assay Kit </td><td> Metade Volume: 1280 mL </td></tr><tr><td> Milli Q dH 2 O </td><td> 1132,8 mL </td></tr><tr><td> Tampão de reacção 2x Click-iT (E Component 10x) </td><td> 100,3 mL </td></tr><tr><td> Click-iT Aditivo buffer Edu (G Component 10x) </td><td> 25,6 mL </td></tr><tr><td> CuSO 4 (100 mM, F Component) </td><td> 25,6 mL </td></tr><tr><td> Oregon Verde Azida (um componente) </td><td> 6,4 mL </td></tr><tr><td> Total </td><td> 1290,7 mL </td></tr></tbody></table> NOTA: Os volumes utilizados acima são proporcionais aos volumes constantes do Click-iT Edu Microplate direções kit de Ensaio. O volume final de Cocktail de reação é um pouco mais de 1.280 mL. </li><li> O Click-iT 2X reação é diluído com igual volume de Click-iT Edu fixador (Componente D) o direito antes de usar. Mistura-los juntos faz uma solução de reação uniforme para todas as lamelas. </li><li> Adicionar 1290,7 mL Click-iT Edu fixador (Componente D) para o coquetel de reação 1290,7 mL. Use 75-80 mL por lamínula. </li></ul></li><li> Pós-fix os neurônios com Click-iT Edu fixador (Componente D) por 5 minutos em temperatura ambiente. </li><li> Remover corrigir e adicionar cocktail reação acima (passo 3.4). Cobertura para proteger da luz e incubar por 25 minutos em temperatura ambiente. Remova cuidadosamente a Cocktail de Reação. Lavar duas vezes com tampão 1X diluído Blocking (2X componente H). <ul><li> Fazer 5200 mL de 1X tampão de bloqueio por diluindo 2600 mL tampão de bloqueio (2x componente H) com um volume igual de MilliQ d H 2 O (2600 mL). Use 75-80 mL por lamínula. </li></ul></li><li> Sob um microscópio epi-fluorescente, verifique se há Oregon coloração verde em núcleos de células controle mitoticamente ativo. </li></ol> 3. Tiramida amplificação de sinal (TSA) de Edu Signal <ol><li> Adicionar solução de bloco 1% TSA a cada lamela e incubar por 30 minutos em temperatura ambiente. <ul><li> Faça mL de solução 6,000 1% bloco TSA, pesando 0,06 g de TSA reagente de bloqueio (TSA kit # 12, Componente D) e adicioná-lo a 6000 mL 1X PBS. Vortex para misturar. Adição de soro de cabra 5% na solução de um bloco% TSA, muitas vezes, ajudar a reduzir a ligação não específica. </li></ul></li><li> Brevemente girar o anti-Oregon Verde peroxidase estoque anticorpo conjugado (Componente I do Click-iT Assay Microplate Edu), elaborado 24/02 horas de antecedência da TSA. Diluir o anticorpo primário 1:300 em solução a 1% TSA bloqueio e inverter ou pipeta cima e para baixo cuidadosamente para misturar. Não vortex para evitar interromper o anticorpo HRP-conjugado. Remoção da solução de bloco 1% TSA, adicionar 75 mL de cada lamela e incubar durante a 4 ° C. <ul><li> O anticorpo pode ser utilizado mais concentrada, como 1:150, mas é fornecido em quantidades limitadas, para usá-lo com moderação. Mais uma vez, a adição de soro de cabra 5% na solução de um bloco% TSA, muitas vezes, ajudar a reduzir a ligação não específica do anticorpo anti-Oregon peroxidase horseradish Verde conjugados. </li><li> Faça 2,560 mL de uma solução de anticorpo 1:300, adicionando 8,53 mL do Coelho de ações anti-Oregon Green-HRP (Click-iT Edu Microplate Assay) para 2560 mL 1% TSA bloqueio. Mix pipetando suave ou inversão. </li></ul></li><li> No dia seguinte, retire a solução de anticorpos e lavar três vezes com 1X PBS. Incubar as lamelas na lavagem final por mais 30-60 minutos em temperatura ambiente para garantir que os anticorpos não ligados primário é removido. </li><li> Prepare reação tiramida para 2560 mL (32 mL lamínulas x 80). <ul><li> Fazer 400 mL de um 0,15% H 2 O 2 solução (100X), adicionando 2 mL dos 30% H 2 O 2 (TSA kit # 12, Componente F) a 398 mL de buffer de amplificação (TSA kit # 12, E Component) . Isto deve ser feito logo antes necessário. </li><li> Para um volume final de 2560 mL combinar: <ul><li> 25,6 tiramida-488 mL (TSA kit componente A) </li><li> 2508,8 mL tampão de amplificação (TSA E Component kit) </li><li> 25,6 mL 0,15% H 2 O 2 (de cima para 0,0015% finais H 2 O 2) </li><li> Remover 1X PBS e incubar com a reação tiramida por 15 minutos em temperatura ambiente. </li></ul></li></ul></li><li> Remover reação tiramida e enxaguar três vezes com 1X PBS, incubando na lavagem final por 30-60 minutos em temperatura ambiente como antes. </li><li> Verifique se há mtDNA rotulagem sob um microscópio epi-fluorescente. <ul><li> Lamínulas montagem em lâminas de vidro para microscópio com um meio Antifade montagem, tais como Prolongar ouro com DAPI. Alternativamente, a rotulagem Edu e amplificação pode ser seguido por imunocitoquímica fluorescentes padrão para rotular outros marcadores celulares. </li></ul></li></ol> 4. Resultados Representante: Visualização de replicação do DNA mitocondrial como um marcador para Biogênese Mitocondrial Estamos interessados ​​em como os neurônios sensoriais (Figura 1) regular o número de mitocôndrias. Este protocolo irá rótulo mtDNA recém-sintetizado com um marcador fluorescente como uma forma de medir as mitocôndrias novo. A incorporação do Edu sintéticos nucleotídeo seguida pela química do clique da amplificação Oregon Green-azida e posterior com a Alexa Fluor-488 resultados tiramida na rotulagem de mtDNA com o sinal verde fluorescente (Figura 2). Se feito corretamente, o sinal amplificado verde é suficientemente maior que a fluorescência de fundo (como autofluorescência celular ou um efeito colateral da reação HRP-TSA). Esta técnica destina-se a etiqueta de mtDNA recém-replicado, a fim de visualizar e quantificar biogênese mtDNA dentro de compartimentos subcelulares de neurônios (Figura 3). A rotulagem Edu permite imunocitoquímica fluorescentes subseqüente para rotular outros marcadores celulares, tais como neurofilamentos (Figura 3D). A reação TSA também pode ser feito com outras fluorescentes tyramides Alexa Fluor, como Alexa Fluor 594 tiramida. Isso resulta em um sinal verde fluorescente nuclear a partir da reação clique em Oregon Green-azida no núcleo, mas nenhum sinal verde no mtDNA, que é indetectável antes do TSA. A amplificação com Alexa Fluor 594-tiramida intensifica o rótulo nuclear e revela a Edu incorporadas no mtDNA com um sinal vermelho fluorescente (Figura 4). Um procedimento de amplificação semelhante é usado para visualizar BrdU incorporação mtDNA recém-sintetizado (Figura 5), ​​no entanto, este método requer um passo adicional para recuperar o epítopo BrdU por qualquer um ácido duro (HCl) ou digerir enzimas, que não é necessário para Edu rotulagem. <img src="/files/ftp_upload/2147/2147fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Representante contraste de interferência diferencial (DIC) de imagens embrionário (esquerda) e adulto (direita) gânglio da raiz dorsal (DRG) neurônios que são normalmente utilizados para análise. Bares = 10 mM. <img src="/files/ftp_upload/2147/2147fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. Esquema representando o processo de rotulagem Edu no mtDNA com o sinal verde fluorescente. O esquema representa o protocolo de três passos para a rotulagem Edu no mtDNA com o sinal verde fluorescente. Mitoticamente ativo F11 células de neuroblastoma servir como um controle positivo e ilustrar o padrão de rotulagem de Edu, que foi incorporada no DNA nuclear e mitocondrial. O primeiro passo (P1) é a incorporação de um análogo da timidina em mtDNA recém-sintetizado pela incubação de células na presença de Edu. A segunda etapa (P2) é baseada na química do clique para rotular Edu incorporado com uma Oregon Green-azida. Sinal verde é visível em núcleos de células que replicadas seu DNA nuclear. A etapa final (P3) é ampliar a Gr Oregoneen azida de sinal através da incubação com um anticorpo de coelho conjugada contra o HRP-Oregon Verde seguido de incubação com Alexa Fluor 488 tiramida rotulados na presença de peróxido de hidrogênio (H 2 O 2) para visualizar sinal verde no mtDNA. <img src="/files/ftp_upload/2147/2147fig3.jpg" alt="Figura 3" /> Figura 3. Edu rotulagem de mtDNA no gânglio da raiz dorsal (DRG) neurônios. Neurônios são incubadas com o Edu eo sinal é amplificado posteriormente a revelar mtDNA que incorporou Edu. Representante imagens de fluorescência sobrepostos em luz transmitida mostrando sinais verdes puntiformes de Edu amplificado (Edu-OG-TSA, verde) incorporados mtDNA recém-sintetizada de ambos embrionárias (A) e neurônios de adultos (BD) DRG. O procedimento de rotulagem Edu permite imunofluorescência subseqüente de marcadores neuronais, como neurofilamento (D, αNF, em vermelho). Barra de escala = 10 mM. <img src="/files/ftp_upload/2147/2147fig4.jpg" alt="Figura 4" /> Figura 4. Esquema representando o processo de rotulagem Edu no mtDNA com um sinal vermelho fluorescente. O esquema representa o protocolo de três passos para a rotulagem Edu no mtDNA com um sinal vermelho fluorescente. Mitoticamente ativo F11 células de neuroblastoma servir como um controle positivo e ilustrar o padrão de rotulagem de Edu, que foi incorporada no DNA nuclear e mitocondrial. O primeiro passo (P1) é a incorporação de um análogo da timidina em mtDNA recém-sintetizado pela incubação de células na presença de Edu. A segunda etapa (P2) é baseada na química do clique para rotular Edu incorporado com uma Oregon Green-azida. Sinal verde é visível em núcleos de células que replicadas seu DNA nuclear. A etapa final (P3) é ampliar a Oregon sinal de Green-azida pela incubação com um anticorpo de coelho conjugada contra o HRP-Oregon Verde seguido de incubação com Alexa Fluor 594 tiramida rotulados na presença de peróxido de hidrogênio (H 2 O 2) para visualizar vermelho em sinal de mtDNA. <img src="/files/ftp_upload/2147/2147fig5.jpg" alt="Figura 5" /> Figura 5. BrdU rotulagem e amplificação do sinal tiramida com um sinal verde ou vermelho fluorescente no mtDNA. O esquema representa o processo de rotulagem BrdU no mtDNA recém-sintetizado com um sinal verde ou vermelho fluorescente. Um passo inicial é necessária para recuperar o epítopo BrdU por um ácido (HCl) ou digerir enzimas, que não é necessário para a rotulagem Edu. O próximo passo é incubada com um rato de anticorpos anti-BrdU primária. Isto é seguido pela incubação com peroxidase (HRP)-cabra conjugado anticorpo anti-rato. Finalmente, o sinal é amplificado com um tiramida verde ou vermelho fluorescente etiquetado na presença de peróxido de hidrogênio (H 2 O 2) para visualizar sinal no mtDNA.

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Não há conflitos de interesse declarados.

Desenvolvemos um ensaio sensível para rotular mtDNA recém-sintetizado em células individuais usando uma amplificação de sinal tiramida de Edu. Um dos maiores problemas durante a otimização deste protocolo foi a resultados inconsistentes entre lamínulas. Alterações foram feitas para os protocolos Invitrogen kit para evitar a mistura de pequenos volumes em lamínulas individuais e tornando as soluções mestre de usar para todas as lamelas. O mL 75-80 utilizada para cada 12 milímetros de vidro circular lamela é um volume ideal para cobrir completamente a área de superfície, proporcionando solução suficiente para dar resultados consistentes entre as amostras. Tempos de incubação e concentração de reagentes foram otimizados mas as melhorias pode ser visto com os ajustes para eles. O protocolo é projetado para executar cada processo uma vez. No entanto, alguns dos passos foram repetidos com novas soluções para recuperar amostras que falharam após a primeira tentativa. Em particular, o Edu passos clique em reação (3,4-3,6) foram repetidas sem um aumento significativo na fluorescência de fundo. O anti-Oregon incubação do anticorpo Green-HRP (4,1-4,3) ea ampliação tiramida (4,4-4,5), foram igualmente repetida, mas mais frequentemente resulta em um mau sinal-ruído por causa do aumento da fluorescência de fundo. Os reagentes mais sensíveis são o Click-iT Aditivo buffer Edu (Componente G) eo coelho anti-Oregon anticorpos Green-HRP (Componente I) a partir do Click-iT kit Assay Edu microplaca. O Click-iT Aditivo buffer Edu gradualmente ao longo do tempo fica amarelo quando armazenado a 4 ° C e entre 6-12 meses escurece consideravelmente. Armazenamento do aditivo tampão Click-iT Edu a -20 ° C irá aliviar este problema. A rotulagem e as etapas de amplificação tiramida funcionam melhor quando o coelho anti-Oregon anticorpos Green-HRP é usado dentro de 4-6 meses de reconstituir em MilliQ dH 2 O. A rotulagem leve de Edu no mtDNA permite comparações diretas com mais marcadores celulares 11/09 e aumenta a utilidade desta técnica sobre os análogos da timidina, tais como 5-bromo-2-deoxiuridina (BrdU), que requer um tratamento duro para se recuperar seu epítopo dentro de DNA. Nosso laboratório 11-12 e 13-15 os outros têm usado com sucesso BrdU para rotular mtDNA. A técnica de rotulagem BrdU é similar ao utilizado para o Edu, mas tem algumas diferenças importantes (Figura 5). Após a etapa de permeabilização listados acima (3,1-3,2), o epítopo BrdU é recuperado com uma etapa de desnaturação (2 N de HCl por 30 min a 37 ° C seguido de três lavagens em PBS 1X). O BrdU é, então, marcado com um anticorpo primário contra BrdU (Vector Laboratories diluída 1:50 em solução de bloqueio de 1% a partir do kit TSA e incubadas overnight a 4 ° C). Um passo anticorpo secundário é necessária para amplificar o sinal BrdU (cabra anti-IgG de rato conjugado com HRP da TSA kits # 2 e # 5, diluído 1:100 em 1% solução de bloqueio e incubado por 45 min à temperatura ambiente) antes de os passos TSA (4,3-4,5 acima). Ter dois análogos da timidina, Edu e BrdU, para mtDNA etiqueta é vantajoso para a realização de experimentos etiqueta dupla onde mtDNA podem ser rotulados sequencialmente no pulso rotulagem paradigmas 11. Nosso laboratório está usando o Edu e BrdU rotulagem de mtDNA para analisar a regulamentação da biogênese mitocondrial no contexto da neuropatia diabética, uma complicação comum da diabetes. Temos utilizado com sucesso a amplificação de sinal para medir as mudanças no mtDNA biogênese em neurônios individuais 11-12. Esta técnica será útil em outros experimentos projetados para explorar os mecanismos de replicação e mtDNA volume de negócios ou para a identificação de drogas que inibem a síntese de mtDNA. Além disso, os princípios básicos de sinais ampliando Edu e BrdU pode ser aplicada a outros estudos que a replicação do DNA ou medida de reparação.

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		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>12 mm coverslips</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>12-545-82</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>245 mm x 245 mm BioAssay Dish</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Corning</td>
<td>431111</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Parafilm M</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>PM-996</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>paraformaldehye</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>P6148</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Triton X-100</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>T-8532</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Phosphate buffered saline 10X solution</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>BP399</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Transfer Pipet</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>13-711-7M</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Hydrogen peroxide, 30% in water</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>BP2633</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Click-iT EdU Microplate Assay Kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>C10214</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>TSA Kit #12, with HRP&#x2014;goat anti-rabbit IgG and Alexa Fluor 488 tyramide</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>T20922</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>TSA Kit #15, with HRP&#x2013;goat anti-rabbit IgG and Alexa Fluor 594 tyramide</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>T20925</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>ProLong Gold antifade reagent with DAPI</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>P-36931</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Polyclonal rabbit Neurofilament antibody</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Chemicon</td>
<td>AB1981</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Mouse monoclonal anti-BrdU antibody</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Vector Laboratories</td>
<td>VP-B209</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>TSA Kit #2, with HRP&#x2014;goat anti-mouse IgG and Alexa Fluor 488 tyramide</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>T20912</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>TSA Kit #5, with HRP&#x2014;goat anti-mouse IgG and Alexa Fluor 594 tyramide</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>T20915</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

visualization of mitochondrial dna replication in individual cells by edu signal amplification

As mitocôndrias são reguladores chave da energia celular e biogênese mitocondrial é um componente essencial de regular os números mitocôndrias nas células saudáveis ​​1-3. Uma abordagem para o monitoramento biogênese mitocondrial é medir a taxa de DNA mitocondrial (mtDNA) de replicação 4. Nós desenvolvemos uma técnica sensível para rotular mtDNA recém-sintetizado em células individuais, a fim de estudar a biogênese mtDNA. A técnica combina a incorporação de 5-ethynyl-2&#39;-deoxiuridina (Edu) 5-7 com uma amplificação de sinal tiramida (TSA) 8 protocolo para visualizar a replicação do mtDNA em compartimentos subcelulares dos neurônios. Edu é superior a outros análogos da timidina, como 5-bromo-2-deoxiuridina (BrdU), porque a reação inicial clique para Edu rótulo 07/05 não exige a tratamentos ácida ou enzimática digere que são necessários para expor o epítopo BrdU . O mais suave rotulagem de Edu permite a comparação direta de sua incorporação com outros marcadores celulares 9-10. A capacidade de visualizar e quantificar biogênese mtDNA fornece uma ferramenta essencial para investigar os mecanismos utilizados para regular biogênese mitocondrial e iria dar uma ideia da patogênese associada com a toxicidade dos medicamentos, envelhecimento, câncer e doenças neurodegenerativas. Nossa técnica é aplicável aos neurônios sensoriais, assim como outros tipos celulares. O uso desta técnica para medir a biogênese mtDNA tem implicações significativas para aprofundar a compreensão de ambos os fisiologia normal celular, bem como estados de doença prejudicada.

Watch this Scientific Journal Video about Visualization of Mitochondrial DNA Replication in Individual Cells by EdU Signal Amplification at JoVE.com

Visualization of Mitochondrial DNA Replication in Individual Cells by EdU Signal Amplification

Nós desenvolvemos uma técnica sensível para identificar recém-sintetizado DNA mitocondrial (mtDNA) em células individuais, a fim de estudar a biogênese mtDNA. A técnica combina a incorporação de Edu, juntamente com um sinal de protocolo de amplificação tiramida (TSA) para visualizar a replicação do mtDNA em compartimentos subcelulares dos neurônios.

Visualização de replicação do DNA mitocondrial em células individuais por Edu amplificação de sinal

Mitochondria are key regulators of cellular energy and mitochondrial biogenesis is an essential component of regulating mitochondria numbers in healthy ...

visualization-mitochondrial-dna-replication-individual-cells-edu

Research

JoVE Journal

Neuroscience

22.8K visualizações.  University of Michigan. Nós desenvolvemos uma técnica sensível para identificar recém-sintetizado DNA mitocondrial (mtDNA) em células individuais, a fim de estudar a biogênese mtDNA. A técnica combina a incorporação de Edu, juntamente com um sinal de protocolo de amplificação tiramida (TSA) para visualizar a replicação do mtDNA em compartimentos subcelulares dos neurônios.

Vídeo: Visualization of Mitochondrial DNA Replication in Individual Cells by EdU Signal Amplification

Automated Interactive Video Playback for Studies of Animal Communication

Video playback is a widely-used technique for the controlled manipulation and presentation of visual signals in animal communication. In particular, parameter-based computer animation offers the opportunity to independently manipulate any number of behavioral, morphological, or spectral characteristics in the context of realistic, moving images of animals on screen. A major limitation of conventional playback, however, is that the visual stimulus lacks the ability to interact with the live animal. Borrowing from video-game technology, we have created an automated, interactive system for video playback that controls animations in response to real-time signals from a video tracking system. We demonstrated this method by conducting mate-choice trials on female swordtail fish, Xiphophorus birchmanni. Females were given a simultaneous choice between a courting male conspecific and a courting male heterospecific (X. malinche) on opposite sides of an aquarium. The virtual male stimulus was programmed to track the horizontal position of the female, as courting males do in the wild. Mate-choice trials on wild-caught X. birchmanni females were used to validate the prototype's ability to effectively generate a realistic visual stimulus.

Video playback is a widely used technique in animal behavior. We created and evaluated a program that applies rules-based, interactive playback of 3-D computer animations in response to real-time, automated data on subject behavior.

Reprodução de vídeo automatizada interativo para estudos da comunicação animal

Video playback is a widely-used technique for the controlled manipulation and presentation of visual signals in animal communication. In particular, ...

Neurociência

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

The targeting and refinement of RGC projections to the midbrain is a popular and powerful model system for studying how precise patterns of neural connectivity form during development. In mice, retinofugal projections are arranged in a topographic manner and form eye-specific layers in the Lateral Geniculate Nucleus (dLGN) of the thalamus and the Superior Colliculus (SC). The development of these precise patterns of retinofugal projections has typically been studied by labeling populations of RGCs with fluorescent dyes and tracers, such as horseradish peroxidase1-4. However, these methods are too coarse to provide insight into developmental changes in individual RGC axonal arbor morphology that are the basis of retinotopic map formation. They also do not allow for the genetic manipulation of RGCs.
Recently, electroporation has become an effective method for providing precise spatial and temporal control for delivery of charged molecules into the retina5-11. Current retinal electroporation protocols do not allow for genetic manipulation and tracing of retinofugal projections of a single or small cluster of RGCs in postnatal mice. It has been argued that postnatal in vivo electroporation is not a viable method for transfecting RGCs since the labeling efficiency is extremely low and hence requires targeting at embryonic ages when RGC progenitors are undergoing differentiation and proliferation6. 
In this video we describe an in vivo electroporation protocol for targeted delivery of genes, shRNA, and fluorescent dextrans to murine RGCs postnatally. This technique provides a cost effective, fast and relatively easy platform for efficient screening of candidate genes involved in several aspects of neural development including axon retraction, branching, lamination, regeneration and synapse formation at various stages of circuit development. In summary we describe here a valuable tool which will provide further insights into the molecular mechanisms underlying sensory map development.

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

We demonstrate an in vivo electroporation protocol for transfecting single or small clusters of retinal ganglion cells (RGCs) and other retinal cell types in postnatal mice over a wide range of ages. The ability to label and genetically manipulate postnatal RGCs in vivo is a powerful tool for developmental studies.

Transfecção de células de camundongo por Ganglionares da Retina In vivo Eletroporação

The targeting and refinement of RGC projections to the midbrain is a popular and powerful model system for studying how precise patterns of neural ...

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

Since the discovery of Green Fluorescent Protein (GFP), there has been a revolutionary change in the use of live-cell imaging as a tool for understanding fundamental biological mechanisms. Striking progress has been particularly evident in Drosophila, whose extensive toolkit of mutants and transgenic lines provides a convenient model to study evolutionarily-conserved developmental and cell biological mechanisms. We are interested in understanding the mechanisms that control cell fate specification in the adult peripheral nervous system (PNS) in Drosophila. Bristles that cover the head, thorax, abdomen, legs and wings of the adult fly are individual mechanosensory organs, and have been studied as a model system for understanding mechanisms of Notch-dependent cell fate decisions. Sensory organ precursor (SOP) cells of the microchaetes (or small bristles), are distributed throughout the epithelium of the pupal thorax, and are specified during the first 12 hours after the onset of pupariation. After specification, the SOP cells begin to divide, segregating the cell fate determinant Numb to one daughter cell during mitosis. Numb functions as a cell-autonomous inhibitor of the Notch signaling pathway.
Here, we show a method to follow protein dynamics in SOP cell and its progeny within the intact pupal thorax using a combination of tissue-specific Gal4 drivers and GFP-tagged fusion proteins 1,2.This technique has the advantage over fixed tissue or cultured explants because it allows us to follow the entire development of an organ from specification of the neural precursor to growth and terminal differentiation of the organ. We can therefore directly correlate changes in cell behavior to changes in terminal differentiation. Moreover, we can combine the live imaging technique with mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM) system to assess the dynamics of tagged proteins in mitotic SOPs under mutant or wildtype conditions. Using this technique, we and others have revealed novel insights into regulation of asymmetric cell division and the control of Notch signaling activation in SOP cells (examples include references 1-6,7 ,8).

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

In this video, we describe a method for live cell imaging of asymmetrically dividing sensory organ progenitor cells and epidermal cells in intact Drosophila pupae

Em células vivas, imagens de células precursoras de órgãos sensoriais na Intact Drosophila As pupas

Since the discovery of Green Fluorescent Protein (GFP), there has been a revolutionary change in the use of live-cell imaging as a tool for understanding ...

Visualization of Proprioceptors in Drosophila Larvae and Pupae

Proprioception is the ability to sense the motion, or position, of body parts by responding to stimuli arising within the body. In fruitflies and other insects proprioception is provided by specialized sensory organs termed chordotonal organs (ChOs) 2. Like many other organs in Drosophila, ChOs develop twice during the life cycle of the fly. First, the larval ChOs develop during embryogenesis. Then, the adult ChOs start to develop in the larval imaginal discs and continue to differentiate during metamorphosis.
The development of larval ChOs during embryogenesis has been studied extensively 10,11,13,15,16. The centerpiece of each ChO is a sensory unit composed of a neuron and a scolopale cell. The sensory unit is stretched between two types of accessory cells that attach to the cuticle via specialized epidermal attachment cells 1,9,14. When a fly larva moves, the relative displacement of the epidermal attachment cells leads to stretching of the sensory unit and consequent opening of specific transient receptor potential vanilloid (TRPV) channels at the outer segment of the dendrite 8,12. The elicited signal is then transferred to the locomotor central pattern generator circuit in the central nervous system.
Multiple ChOs have been described in the adult fly 7. These are located near the joints of the adult fly appendages (legs, wings and halters) and in the thorax and abdomen. In addition, several hundreds of ChOs collectively form the Johnston's organ in the adult antenna that transduce acoustic to mechanical energy 3,5,17,4.
In contrast to the extensive knowledge about the development of ChOs in embryonic stages, very little is known about the morphology of these organs during larval stages. Moreover, with the exception of femoral ChOs 18 and Johnston's organ, our knowledge about the development and structure of ChOs in the adult fly is very fragmentary.
Here we describe a method for staining and visualizing ChOs in third instar larvae and pupae. This method can be applied together with genetic tools to better characterize the morphology and understand the development of the various ChOs in the fly.

Visualization of Proprioceptors in Drosophila Larvae and Pupae

A method to immunostain and visualize chordotonal organs in larvae and pupae of Drosophila melanogaster is described.

Visualização de Propriocepção em<em&gt; Drosophila</em&gt; As larvas e pupas

Proprioception is the ability to sense the motion, or position, of body parts by responding to stimuli arising within the body. In fruitflies and other ...

Targeted Labeling of Neurons in a Specific Functional Micro-domain of the Neocortex by Combining Intrinsic Signal and Two-photon Imaging

In the primary visual cortex of non-rodent mammals, neurons are clustered according to their preference for stimulus features such as orientation1-4, direction5-7, ocular dominance8,9 and binocular disparity9. Orientation selectivity is the most widely studied feature and a continuous map with a quasi-periodic layout for preferred orientation is present across the entire primary visual cortex10,11. Integrating the synaptic, cellular and network contributions that lead to stimulus selective responses in these functional maps requires the hybridization of imaging techniques that span sub-micron to millimeter spatial scales. With conventional intrinsic signal optical imaging, the overall layout of functional maps across the entire surface of the visual cortex can be determined12. The development of in vivo two-photon microscopy using calcium sensitive dyes enables one to determine the synaptic input arriving at individual dendritic spines13 or record activity simultaneously from hundreds of individual neuronal cell bodies6,14. Consequently, combining intrinsic signal imaging with the sub-micron spatial resolution of two-photon microscopy offers the possibility of determining exactly which dendritic segments and cells contribute to the micro-domain of any functional map in the neocortex. Here we demonstrate a high-yield method for rapidly obtaining a cortical orientation map and targeting a specific micro-domain in this functional map for labeling neurons with fluorescent dyes in a non-rodent mammal. With the same microscope used for two-photon imaging, we first generate an orientation map using intrinsic signal optical imaging. Then we show how to target a micro-domain of interest using a micropipette loaded with dye to either label a population of neuronal cell bodies or label a single neuron such that dendrites, spines and axons are visible in vivo. Our refinements over previous methods facilitate an examination of neuronal structure-function relationships with sub-cellular resolution in the framework of neocortical functional architectures.

A method is described for labeling neurons with fluorescent dyes in predetermined functional micro-domains of the neocortex. First, intrinsic signal optical imaging is used to obtain a functional map. Then two-photon microscopy is used to label and image neurons within a micro-domain of the map.

Rotulagem alvo de neurônios em um específico domínio funcional de Micro-do neocórtex por Combinando sinal intrínseco e dois fótons de imagem

In the primary visual cortex of non-rodent mammals, neurons are clustered according to their preference for stimulus features such as orientation1-4, ...

A Method for High Fidelity Optogenetic Control of Individual Pyramidal Neurons In vivo

Optogenetic methods have emerged as a powerful tool for elucidating neural circuit activity underlying a diverse set of behaviors across a broad range of species. Optogenetic tools of microbial origin consist of light-sensitive membrane proteins that are able to activate (e.g., channelrhodopsin-2, ChR2) or silence (e.g., halorhodopsin, NpHR) neural activity ingenetically-defined cell types over behaviorally-relevant timescales. We first demonstrate a simple approach for adeno-associated virus-mediated delivery of ChR2 and NpHR transgenes to the dorsal subiculum and prelimbic region of the prefrontal cortex in rat. Because ChR2 and NpHR are genetically targetable, we describe the use of this technology to control the electrical activity of specific populations of neurons (i.e., pyramidal neurons) embedded in heterogeneous tissue with high temporal precision. We describe herein the hardware, custom software user interface, and procedures that allow for simultaneous light delivery and electrical recording from transduced pyramidal neurons in an anesthetized in vivo preparation. These light-responsive tools provide the opportunity for identifying the causal contributions of different cell types to information processing and behavior.

A Method for High Fidelity Optogenetic Control of Individual Pyramidal Neurons In vivo

The recent development of neuroscience tools that combine genetics and optics, termed "optogenetics", enables control over neural circuit activity with an unprecedented level of spatial and temporal resolution. Here we provide a protocol for integrating in vivo recording with optogenetic manipulation of genetically-defined subsets of prefrontal cortical and subicular pyramidal neurons.

Um Método para High Fidelity Optogenetic Controle de Individual Piramidal neurônios<em&gt; In vivo</em

Optogenetic methods  have emerged as a powerful tool for elucidating neural circuit activity  underlying a diverse set of behaviors across a broad range ...

Evaluation of Bioenergetic Function in Cerebral Vascular Endothelial Cells

The integrity of the blood-brain-barrier (BBB) is critical to prevent brain injury. Cerebral vascular endothelial (CVE) cells are one of the cell types that comprise the BBB; these cells have a very high-energy demand, which requires optimal mitochondrial function. In the case of disease or injury, the mitochondrial function in these cells can be altered, resulting in disease or&#160;the opening of the BBB. In this manuscript, we introduce a method to measure mitochondrial function in CVE cells by using whole, intact cells and a bioanalyzer. A mito-stress assay is used to challenge the cells that have been perturbed, either physically or chemically, and evaluate their bioenergetic function. Additionally, this method also provides a useful way to screen new therapeutics that have direct effects on mitochondrial function. We have optimized the cell density necessary to yield oxygen consumption rates that allow for the calculation of a variety of mitochondrial parameters, including ATP production, maximal respiration, and spare capacity. We also show the sensitivity of the assay by demonstrating that the introduction of the&#160;microRNA, miR-34a, leads to a pronounced and detectable decrease in mitochondrial activity. While the data shown in this paper is optimized for the bEnd.3 cell line, we have also optimized the protocol for primary CVE cells, further suggesting the utility in preclinical and clinical models.

Endothelial cell mitochondria are critical to maintain blood-brain-barrier integrity. We introduce a protocol to measure bioenergetic function in cerebral vascular endothelial cells.

Avaliação da função bioenergética em células endoteliais Vascular Cerebral

The integrity of the blood-brain-barrier (BBB) is critical to prevent brain injury. Cerebral vascular endothelial (CVE) cells are one of the cell types ...

Ratiometric Calcium Imaging of Individual Neurons in Behaving Caenorhabditis Elegans

It has become increasingly clear that neural circuit activity in behaving animals differs substantially from that seen in anesthetized or immobilized animals. Highly sensitive, genetically encoded fluorescent reporters of Ca2+ have revolutionized the recording of cell and synaptic activity using non-invasive optical approaches in behaving animals. When combined with genetic and optogenetic techniques, the molecular mechanisms that modulate cell and circuit activity during different behavior states can be identified.
Here we describe methods for ratiometric Ca2+ imaging of single neurons in freely behaving Caenorhabditis elegans worms. We demonstrate a simple mounting technique that gently overlays worms growing on a standard Nematode Growth Media (NGM) agar block with a glass coverslip, permitting animals to be recorded at high-resolution during unrestricted movement and behavior. With this technique, we use the sensitive Ca2+ reporter GCaMP5 to record changes in intracellular Ca2+ in the serotonergic Hermaphrodite Specific Neurons (HSNs) as they drive egg-laying behavior. By co-expressing mCherry, a Ca2+-insensitive fluorescent protein, we can track the position of the HSN within ~ 1 &#181;m and correct for fluctuations in fluorescence caused by changes in focus or movement. Simultaneous, infrared brightfield imaging allows for behavior recording and animal tracking using a motorized stage. By integrating these microscopic techniques and data streams, we can record Ca2+ activity in the C. elegans egg-laying circuit as it progresses between inactive and active behavior states over tens of minutes.

Ratiometric Calcium Imaging of Individual Neurons in Behaving Caenorhabditis Elegans

This protocol describes the use of genetically encoded Ca2+ reporters to record changes in neural activity in behaving Caenorhabditis elegans worms. &#8195;

Imagem de cálcio Ratiometric de neurônios individuais se comportando Caenorhabditis Elegans

It has become increasingly clear that neural circuit activity in behaving animals differs substantially from that seen in anesthetized or immobilized ...

Visualization of Cortical Modules in Flattened Mammalian Cortices

The cortex of mammalian brains is parcellated into distinct substructures or modules. Cortical modules typically lie parallel to the cortical sheet, and can be delineated by certain histochemical and immunohistochemical methods. In this study, we highlight a method to isolate the cortex from mammalian brains and flatten them to obtain sections parallel to the cortical sheet. We further highlight selected histochemical and immunohistochemical methods to process these flattened tangential sections to visualize cortical modules. In the somatosensory cortex of various mammals, we perform cytochrome oxidase histochemistry to reveal body maps or cortical modules representing different parts of the body of the animal. In the medial entorhinal cortex, an area where grid cells are generated, we utilize immunohistochemical methods to highlight modules of genetically determined neurons which are arranged in a grid-pattern in the cortical sheet across several species. Overall, we provide a framework to isolate and prepare layer-wise flattened cortical sections, and visualize cortical modules using histochemical and immunohistochemical methods in a wide variety of mammalian brains.

This article describes a detailed methodology to obtain flattened tangential sections from mammalian cortices and visualize cortical modules using histochemical and immunohistochemical methods.

Visualização de módulos corticais em córtices mamíferos achatadas

The cortex of mammalian brains is parcellated into distinct substructures or modules. Cortical modules typically lie parallel to the cortical sheet, and ...

Advanced Diffusion Imaging in The Hippocampus of Rats with Mild Traumatic Brain Injury

Mild traumatic brain injury (mTBI) is the most common type of acquired brain injury. Since patients with traumatic brain injury show a tremendous variability and heterogeneity (age, gender, type of trauma, other possible pathologies, etc.), animal models play a key role in unraveling factors that are limitations in clinical research. They provide a standardized and controlled setting to investigate the biological mechanisms of injury and repair following TBI. However, not all animal models mimic the diffuse and subtle nature of mTBI effectively. For example, the commonly used controlled cortical impact (CCI) and lateral fluid percussion injury (LFPI) models make use of a craniotomy to expose the brain and induce widespread focal trauma, which are not commonly seen in mTBI. Therefore, these experimental models are not valid to mimic mTBI. Thus, an appropriate model should be used to investigate mTBI. The Marmarou weight drop model for rats induces similar microstructural alterations and cognitive impairments as seen in patients who sustain mild trauma; therefore, this model was selected for this protocol. Conventional computed tomography and magnetic resonance imaging (MRI) scans commonly show no damage following a mild injury, because mTBI induces often only subtle and diffuse injuries. With diffusion weighted MRI, it is possible to investigate microstructural properties of brain tissue, which can provide more insight into the microscopic alterations following mild trauma. Therefore, the goal of this study is to obtain quantitative information of a selected region-of-interest (i.e., hippocampus) to follow up disease progression after obtaining a mild and diffuse brain injury.

The overall goal of this procedure is to obtain quantitative microstructural information of the hippocampus in a rat with mild traumatic brain injury. This is done using an advanced diffusion-weighted magnetic resonance imaging protocol and region-of-interest based analysis of parametric diffusion maps.