Este trabalho foi apoiado pela Coligação Cancer Georgia conceder-R9028.

Fundamentação Explorando o uso da Thermo Scientific Dharmacon oligos, 50 a 80-mers, aqui apresentamos um procedimento, baseado em um ensaio de gene de correção, pelo qual oligos podem transferir informações genéticas de DNA genômico de células de levedura, seguindo annealing para o DNA-alvo cromossômicas. Bem sucedida segmentação por oligos é marcado pelo aparecimento de colônias de leveduras exibir o fenótipo esperado. Se a modificação genética desejada é realizada dentro de um ou mais ribonucleotídeos incorporadas na seqüência oligo, a informação genética flui diretamente do trato RNA para o DNA-alvo cromossômicas, assim, uma forma de RNA / DNA híbrido em nível cromossômico durante o processo de segmentação. O ribonucleotídeo / s de um Thermo Scientific Dharmacon RNA contendo oligo pode servir como modelo para gene targeting via síntese de reparação do DNA, ou podem ser incorporados ao DNA e servir como modelo durante a replicação do DNA. Nestes experimentos utilizamos o fermento / Saccharomyces cerevisiae / eucariótica sistema modelo, no entanto, uma abordagem semelhante também pode ser aplicado em outros organismos ou tipos de células. Neste vídeo, nós usamos um Thermo Scientific Dharmacon oligo projetado com homologia a um gene-alvo genômico de levedura e contendo um ribonucleotídeo no meio para corrigir uma mutação no gene alvo. Depois de transformação com o oligo-RNA contendo, observa-se a correção do site orientado para uma determinada freqüência, o que indica que o trato RNA do oligo poderia ser incorporada no DNA cromossômico e servir como modelo para a síntese de DNA durante a replicação do DNA. A informação genética realizada no trato RNA é estável transmitida às gerações seguintes celular. Aqui, descrevemos as etapas de transformação de células de levedura pela Thermo Scientific Dharmacon RNA contendo oligo ea abordagem para detectar as informações RNA transferência no DNA cromossômico. A. Estrutura da RNA Oligo contendo utilizadas neste experimento Nós projetamos um oligo-RNA contendo para corrigir um defeito genético na levedura S. DNA cromossômico cerevisiae no locus trp5. A cepa de levedura utilizada no protocolo contém um gene mutante trp5 com uma deleção de dois de base e uma mutação nonsense (Figura 1A). Cepa de levedura como é um mutante auxotróficas triptofano e não formam colônias na mídia sem triptofano. A seqüência de DNA do gene TRP5 está disponível no Banco de Dados do Genoma cerevisiae (http://www.yeastgenome.org/). A Thermo Scientific Dharmacon oligo-RNA contendo utilizado neste protocolo é um 65-mer com uma inserção de DNA 2-base, concebidos para corrigir a mutação exclusão e um ribonucleotídeo concebidos para corrigir a mutação nonsense do alelo trp5 (Figura 1A). A seqüência dos oligo é concebido como segue: 5&#39;-AAAAGGGTTTTGATGAAGCTGTCG-CG-GATCCCACATTCTG-rG GAAGACTTCAAATCCTTGTATTCT. Este oligo é sintetizada pela Thermo Scientific Dharmacon (Lafayette, CO), 200 nM escala, e é dessalinizada, deprotected e usados ​​sem purificação PAGE. B. Preparação do RNA Oligo contendo fermento para a Transformação (modificado de Storici et al., 2007 1) <ol><li> Limpe os materiais que serão utilizados para o experimento, incluindo tubos de oligo, pipetas, vortex, racks, área experimental e as luvas usadas pelo investigador com RNase solução de descontaminação para remover a contaminação RNase potencial antes do início de tudo. Use RNase água, reagentes químicos, tubos e ponteiras em todas as etapas. Cada passo neste experimento deve ser RNase-free. </li><li> Ressuspender o Thermo Scientific Dharmacon RNA contendo oligo recebeu da empresa a 250 pmoles / mL solução estoque com RNase água e vortex vigorosamente para dissolver o sedimento. Armazenar a -80 ° C. </li><li> Imediatamente antes da transformação, descongelar o oligo-RNA contendo no gelo e diluir para 50 pmoles / mL com RNase água livre de RNase em tubos. Cada transformação exige uma nmole dos oligos RNA contendo. </li><li> Desnaturar uma quantidade escolhida do oligos RNA contendo no bloco de aquecimento 100 ° C por 2 min para eliminar as estruturas secundárias do oligos. </li><li> Imediatamente após a desnaturação colocar o tubo no gelo. Manter em gelo até a transformação. </li><li> Como controle no experimento um DNA somente correspondente oligo é usado. Este oligo é descongelado de -20 ° C e preparados para a transformação como a oligo-RNA que contenham, como descrito acima. </li></ol> C. Transformação de células de levedura usando o RNA Oligo contendo <ol><li> Inocular 5 ml de meio líquido rico YPD com o trp5 células de levedura mutante e crescer a 30 ° C durante a noite (veja Materiais). </li><li> Transferência de 1,5 ml da cultura durante a noite em 50 ml de meio líquido YPD. </li><li> Incubar as células em um shaker 30 ° C (225 rpm) por 4h. </li><li> Preparar a solução de umSolução 2 e imediatamente antes da transformação em RNase tubos (veja Materiais). </li><li> Transferir a cultura de células em um tubo de 50 ml RNase-free e girar a 3000 rpm, correspondente a 1.562 g, durante 2 min. O pellet de células a precipitação é de aprox. 0,3 cm 3. </li><li> Remover as células sobrenadante e lavar com 50 ml de RNase água e giram a 3000 rpm por 2 min. </li><li> Repita o passo 6 para 5 vezes para se livrar do meio de cultura e RNases que podem estar presentes no meio, tanto quanto possível. </li><li> Remover o sobrenadante e ressuspender as células em 5 ml de solução 1 e girar a 3000 rpm por 2 min. </li><li> Remover as células sobrenadante e ressuspender em 250 ml de solução 1. Esta quantidade de células é suficiente para 7-8 transformações. </li><li> Alíquota de 50 mL da suspensão de células em tubos de microcentrífuga RNase-free, adicionar 20 mL de RNA contendo oligo solução de trabalho (1 nmole), ou 20 l de DNA somente oligo solução de trabalho (1 nmole), ou 20 l de água estéril sem oligo para o controle negativo. Em seguida, adicione 300 ml de solução 2 para cada reação de transformação. Não há necessidade de acrescentar DNA de esperma de salmão no processo de transformação, como o ato oligos como portador si. </li><li> Vortex vigorosamente para misturar os componentes de forma homogênea. </li><li> Incubar reações de transformação a 30 ° C por 30 min em um agitador. </li><li> Choque térmico a 42 ° C por 15 min. </li><li> Spin down células a 5000 rpm, correspondente a 2.236 g, durante 4 min. </li><li> Remover as células sobrenadante e ressuspender em 100 ul de água estéril. </li><li> Tomar uma alíquota desta suspensão de células e dilui-lo com água estéril por 100.000 vezes e as células da placa em uma placa YPD usando aprox. 15 contas de vidro estéril e incubar a 30 ° C por 2 dias. </li><li> Placa de todas as células ressuspendidas de cada reação de transformação em uma placa de Petri de meio completo sintética sólida sem triptofano (Trp-SC), usando aprox. 15 contas de vidro estéril e incubar a 30 ° C por 4-5 dias (Figura 2). </li></ol> D. Análise de Correção Gene pela RNA Oligo contendo <ol><li> Contar o número de colônias crescidas no meio seletivo (Figura 2), bem como em meio YPD para calcular a freqüência de correção gene para o RNA-oligo contendo, o DNA oligo-only e para o controle não-oligo. Compare o número obtido. Taxa de reversão espontânea do trp5 alelos com as exclusões dois-base ea mutação nonsense é inferior a 09/10 na cepa de levedura utilizada, portanto, esperamos que nenhuma formação colónias no meio seletivo quando não oligos são adicionadas às células. </li><li> Expelido vários escolhido aleatoriamente colônias transformantes em meio YPD obter isolados única colônia. Esperar dois dias para o crescimento da colônia, em seguida, tomar várias (pelo menos 5) colônias única e fazer correções em YPD e em meio seletivo. </li><li> Projetar um par de primers para amplificar a região (250-1,000 pb) alvo do oligo-RNA, contendo, em colônia PCR (Figura 1B). O procedimento para a colônia PCR é a seguinte (modificado de Storici e Resnick, 2006 2). <ol><li> Ressuspender as células (aproximadamente 1 mm3) retirado os patches individuais em 50 ul de água e adicionar uma unidade de lyticase. Incubar a temperatura ambiente por 10 min seguido de incubação em um bloco de aquecimento a 100 ° C por 5 min para quebrar as células e DNA genômico de liberação em solução., </li><li> Condições de PCR: A reação de PCR inclui 10 ml da solução de ressuspensão de células, 50 pmoles cada um dos primers frente e verso, 1 ml de 10 mM dNTPs, 1 unidade de Taq polimerase, 5 mL de tampão 10x e é ajustado com água estéril a um volume final de 50 l. O programa de PCR é de 3 min a 95 ° C, 30 ciclos de 30 s em 95 ° C, 30 s, a 55 ° C e 1 min a 72 ° C; um tempo de extensão final de 7 min a 72 ° C, em seguida, amostras são mantidos a 4 ° C. Uma extensão de tempo de 1 min / kb é assumida por esta reação. </li><li> Após PCR, as amostras são executados em um gel de agarose 1% ou 2% (dependendo do tamanho esperado do produto da PCR) para a observação do produto da PCR (Figura 3). </li></ol></li><li> Se a informação genética transferidos pelo oligo-RNA contendo um sítio de restrição gera novos na região-alvo do genoma de leveduras (Figura 1B), é possível verificar a correta transferência de informação através da digestão do produto da PCR com a enzima de restrição apropriada. Se nenhum sítio de restrição é gerada pelo oligo-RNA contendo, vá para a etapa 6. Produtos Digest PCR usando uma enzima de restrição específica. A reação de digestão inclui 6 mL de PCR produto, buffer, BSA (pode não ser necessário para algumas enzimas, ver instruções para a enzima usada), 0,5 l da enzima de restrição, e água estéril a 15 mL. As amostras são incubadas por 1 h na temperatura específica para a enzima utilizada. </li><li> Executar uma amostra não digerida juntamente com as amostras digeridas na mesma linha de um gel de agarose 2% aobservar a modificação genética transferidos pelo trato RNA do oligo-RNA que contém (Figura 3). </li><li> Purificar produtos de PCR usando um kit de purificação de PCR e prepará-los para o seqüenciamento de DNA. Enviar amostras para seqüenciamento com a mesma primers utilizados para amplificar o produto. </li><li> Analisar os resultados de seqüenciamento de DNA usando um software que permite o alinhamento de várias seqüências com uma seqüência de referência escolhido (Figura 4). </li></ol> E. Tratamento Alkali do oligo-RNA contendo (Figura 5) <ol><li> Para cada reação, adicionar 1 nmole (4 mL de 250 pmoles / solução estoque mL) do oligo-RNA que contenham ou DNA-oligo em um tubo de 1,5 ml. </li><li> Adicionar 4 mL de NaOH 1 M de hidrólise, ou, alternativamente, adicionar 4 mL H 2 O como controle negativo, e incubar a 65 ° C em banho-maria por 1 h. Então mover-se do banho de água em gelo. </li><li> Neutralize com 2 mL de 1,2 M HCl, 4 mL de 1 ml M Tris-HCl, e 4 de H 2 O, ou, alternativamente, 6 mL de H 2 O e 4 mL de 1 M Tris-HCl para o controle negativo. Manter em gelo até a transformação. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/2152/2152fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Diagrama esquemático do gene defeituoso e trp5 do alelo TRP5 corrigido pelo oligo-RNA que contém. A) O gene mutante trp5 contém uma deleção 2-base (triângulos pretos) e 1-base mutação nonsense (asterisco). A única fita de RNA contendo oligo com 2 base de inserção (azul loop) e 1-RNA substituição de base (retângulo vermelho) gerando um Van91 Eu site da enzima de restrição (indicado por um suporte) é transformado em células de levedura para corrigir os defeitos genéticos do gene trp5. B) Após o gene TRP5 é reparado pela oligo-RNA contendo (bases corrigidas são indicados como retângulos azuis), o Van91 site que é gerado no gene TRP5. Um fragmento de 278 pb, incluindo apenas um sítio de restrição Van91 I em TRP5 gene é amplificado PCR por um par de primers (P1 e P2). O bp 177 e bp 101 fragmentos gerados após a digestão da P1 e P2 produto PCR por Van91 eu também são mostrados. <img src="/files/ftp_upload/2152/2152fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. Resultado de transformação com o oligo-RNA que contém. A) As células de levedura transformada sem oligo não fazem qualquer colônia no meio SC-Trp, ver placas ab. B) Placas cg colônias de leveduras mostram que crescem em SC-Trp depois que as células são transformadas com um nmole do oligo-RNA que contém. C) Placas hl colônias de leveduras mostram que crescem em SC-Trp depois que as células são transformadas com um nmole do DNA somente correspondente oligo controle. <img src="/files/ftp_upload/2152/2152fig3.jpg" alt="Figura 3" /> Figura 3. Detecção de transferência de informação genética do RNA contendo oligo de DNA cromossômico de leveduras por digestão de restrição do produto da PCR de amplificação da região genômica alvo. Eletroforese em gel de agarose 2% das amostras de PCR amplificados por P1 e P2 e digerido com enzima de restrição Van91 I. Raias 1, 8 e 15, escada de DNA com tamanhos de 100, 200, 300, 400 e 500 bp indicado à esquerda; pista 2, produto de PCR amplificado a partir de trp5 lócus do DNA genômico da cepa mutante trp5; pista 3, PCR produto amplificado do DNA genômico derivado de uma colônia + Trp alvo do DNA oligo-only; lane 4-7, produtos de PCR amplificados a partir de DNA genômico derivado de Trp + colônias alvo do oligo-RNA contendo; lane 9-14, Van91 eu digestão de restrição dos produtos de PCR de faixas 2-7. A presença do uncut bandas produto de PCR em pistas 10-14 pode ser explicado pela digestão parcial por Van91 eu no locus TRP5 (CCACATTCTGG). Considerando que o local de corte para Van91 I (CCANNNN NTGG) pode ter várias seqüências, o site gerada em TRP5 pode não ser o alvo mais ideal para a enzima. De fato, o DNA seguinte seqüência de todos os produtos acima PCR não detectamos nenhuma alteração adicional além daquelas realizadas pela oligos (ver Figura 4). O 278 bp banda PCR amplificado por P1 e P2 primers e as bandas produto da digestão por Van91 I de 177 bp e 101 bp são mostrados pelas setas à direita. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/2152/2152fig4.jpg"><img src="/files/ftp_upload/2152/2152fig4tmb.jpg" border="0" alt="Figura 4Thumb" /></a> Figura 4. Resultados de seqüenciamento de DNA mostrando correção gene pela RNA-oligo contendo. Electrofograma A DNA) da região genômica alvo do oligo-RNA que contém. O G na seqüência do DNA (azul caixa) deriva do rG na oligo-RNA que contém. Também em caixa é a inserção das bases CG. Resultados de sequenciamento de todos os outros produtos da PCR são também como clear como este, com sinais fluorescentes bem acima do fundo. B) Seqüências da região TRP5 do + Trp transformantes alvo do oligo DNA-only (T1) e os oligo RNA contendo (T2-T5) correspondem na seqüência consenso no topo e são comparados com o do trp5 células mutantes antes de segmentação pela oligos (DNA genômico, vermelho sombreado). A reparação RNA contendo oligo no fundo tem dois-base de inserção de DNA e uma base (G) RNA substituição marcados em vermelho. As regiões em caixa no azul com sombra amarela mostram que o RNA que contêm oligo, bem como os oligo DNA somente precisamente corrigido a mutação deleção e mutação nonsense em todas as amostras testadas. As linhas tracejadas marcar a posição da seqüência de RNA contendo oligo. <img src="/files/ftp_upload/2152/2152fig5.jpg" alt="Figura 5" /> Figura 5. Tratamento alcalino impede a correção gene pela RNA-oligo contendo. A freqüência de transformação pelo oligo-RNA contendo (R) é mostrado na barra vermelha e que pelo DNA oligo-only (D) é mostrado nas barras azuis. As barras de erro representam o erro padrão da média para três transformações independentes para cada oligo. O DNA somente oligo exibe freqüência transformação semelhante sem e com tratamento NaOH. Diferentemente, a freqüência de transformação pela oligo-RNA contendo cai para 0 após o tratamento com NaOH. Portanto, a preparação, com o oligo-RNA contendo não está contaminado com DNA somente oligo, assim, a freqüência de transformação observada é específica para o oligo-RNA que contém.

<ol>
	<li>Storici, F., Bebenek, K., Kunkel, T. A., Gordenin, D. A., Resnick, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-templated+DNA+repair.">RNA-templated DNA repair.</a> Nature. 447, 338-3341 (2007).</li><li>Storici, F., Resnick, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+delitto+perfetto+approach+to+in+vivo+site-directed+mutagenesis+and+chromosome+rearrangements+with+synthetic+oligonucleotides+in+yeast.">The delitto perfetto approach to in vivo site-directed mutagenesis and chromosome rearrangements with synthetic oligonucleotides in yeast.</a> Methods Enzymol. 409, 329-345 (2006).</li><li>Storici, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-mediated+DNA+modifications+and+RNA-templated+DNA+repair.">RNA-mediated DNA modifications and RNA-templated DNA repair.</a> Curr Opin Mol Ther. 10, 224-230 (2008).</li><li>Cerritelli, S. M., Crouch, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribonuclease+H:+the+enzymes+in+eukaryotes.">Ribonuclease H: the enzymes in eukaryotes.</a> FEBS J. 276, 1494-1505 (2009).</li></ol>

A produção de vídeo para este artigo foi patrocinado pela Thermo Fisher Scientific, que produz reagentes e instrumentos utilizados nesta publicação.

O fato de que RNA pode transferir informações genéticas diretamente ao DNA genômico em células foi descoberto explorando o uso de RNA sintético contendo oligos (oligos Dharmacon sintetizado) 1. Foi a prova do princípio de que as células podem usar RNA contendo moléculas de RNA ou somente seqüências como modelos para a síntese de DNA. O uso de RNA contendo oligos não só levou à demonstração de que a informação genética pode ser transferida diretamente de RNA para DNA genômico sem a necessidade de um reverso transcrito DNA cópia intermediária, mas também para a prova de que RNA pode ser usado como modelo no homólogo a reparação de um dano ao DNA 1,3. Os oligos podem ser feitas de RNA-only ou conter apenas uma única ribonucleotídeo incorporado em uma seqüência de DNA, como no exemplo que apresentamos aqui. Os oligo-RNA tem um ribonucleotídeo que contém embutidos projetados para corrigir a mutação nonsense no genômica trp5 alelo defeituoso. A transferência de informação genética da ribonucleotídeo para o DNA genômico é revelado por uma mudança no fenótipo (células que crescem em meio falta de triptofano) das células-alvo. A freqüência de correção gene obtido com o oligo-RNA contendo é medido e comparado com a de um DNA-somente o controle oligo. Ao realizar este ensaio correção gene em fundos de células diferentes, onde mutar genes de levedura vários, podemos detectar qual o fator / s afectam especificamente dirigida pelo oligos RNA contendo. Assim, podemos revelar os mecanismos de como as células regulam a estabilidade de RNA / DNA híbridos. Simplesmente projetar diferentes variantes do oligos RNA contendo podemos determinar a probabilidade de um trato especial RNA para servir como modelo na modificação do ADN e podemos determinar a estabilidade de seqüências específicas de RNA incorporadas ao DNA. Além disso, podemos identificar quais são os preferidos em substratos vivo para fatores de interação com RNA / DNA híbridos. Apesar de vários estudos in vitro, principalmente utilizando curtas de RNA contendo oligos, têm sido realizados para caracterizar a função de fatores que podem reconhecer RNA em um híbrido com o DNA, tais como as enzimas RNase H 4, a vivo em funções de RNases H bem como a identidade de outras proteínas que podem afetar RNA / DNA estabilidade híbrido permanecem quase desconhecidas. A possibilidade de utilizar RNA contendo oligos de um período significativo (50 a 80-mers) e ótima qualidade (como oligos RNA contendo Thermo Scientific Dharmacon) tem aberto o caminho para examinar uma ampla variedade de processos moleculares in vivo diretamente na células de interesse. Como mostra este vídeo de transformação, usando RNA contendo oligos exige, essencialmente, apenas alguns passos adicionais em relação à transformação usando moléculas de DNA, para prevenir a degradação de RNases. Assim, a transformação usando RNA contendo oligos não é limitado ao sistema de levedura, mas pode ser aplicado a qualquer tipo de célula ou organismo onde a transformação pelo DNA oligos é proficiente. Em conclusão, tendo como alvo as células de RNA contendo oligos fornece a oportunidade de gerar RNA / DNA híbridos e ribonucleotídeos embutido no DNA in vivo nas células. A estabilidade da função, e as conseqüências desses in vivo gerado RNA / DNA híbridos podem ser analisadas e caracterizadas, potencialmente descobrir mecanismos desconhecidos de reparo do DNA e revelando novas estratégias para o gene alvo.

Transformação A. reagentes e meios de comunicação (modificado de Storici e Resnick, 2006 <ol><li> YPD (Yeast peptonada Dextrose): Para 1 L, 10 g de extrato de levedura, peptona de soja 20 g, 20 g de dextrose. Adicionar 15 g de ágar para fazer YPD meios sólidos. Autoclave antes de usar. Conservar à temperatura ambiente. </li><li> Solução 1: 0,1 M de acetato de lítio. Preparar imediatamente antes da transformação. Solução 1 é uma solução de trabalho, portanto, é preparado diretamente a partir do pó. Sem solução é feita. Manter a temperatura ambiente. LiAc aumenta a permeabilidade da parede celular de levedura de DNA. </li><li> Solução 2: 0,1 M de acetato de lítio e 50% de polietileno glicol 4000. Também a solução 2 é uma solução de trabalho e é feita diretamente a partir do pó. Nenhuma solução estoque é preparada. Manter a temperatura ambiente. Depósitos PEG oligos em células de levedura. </li><li> RNA contendo oligos (Thermo Scientific Dharmacon), 50-80-mers, dessalinizada, deprotected e não purificada. Ressuspender a 250 pmoles / mL. Armazenar a -80 ° C. </li><li> DNA somente oligos, 50-80-mers, já dessalgado e não purificada. Ressuspender a 50 pmoles / mL. Armazenar a -20 ° C. </li><li> SC-Trp (Synthetic mídia completa falta de triptofano) meios sólidos. </li><li> 0,5 centímetros de diâmetro contas de vidro, esterilizados em autoclave. </li><li> RNase-off: RNase solução de descontaminação. </li><li> DNase / RNase-free, tubos de centrífuga estéreis. </li><li> DNase / RNase-free, tubos cônicos estéreis. </li><li> DNase / RNase-free, dicas aerosol estéril pipeta com ZAP: 100-200 ml, 100-1000 ml. </li></ol> Colony B. materiais PCR. <ol><li> Primers DNA, já dessalgado e não purificada. Dissolver em água estéril a 50 pmoles / mL. Armazenar a -20 ° C. </li><li> Taq DNA polimerase, tampão, dNTPs. </li><li> Tubos PCR. </li></ol> C. purificação PCR. <ol><li> PCR kit de purificação. </li></ol> D. eletroforese em gel. <ol><li> Agarose. </li><li> 1 x TBE execução (45 mM Tris-borato e um tetraacetate etilenodiamina mM) diluída a partir de TBE 10x. </li><li> Marcador de peso molecular Prestained. </li><li> DNA corante carregamento. </li></ol> E. digestão Restrição. <ol><li> Enzimas de restrição, buffers de 10x, BSA. </li></ol> F. tratamento alcalino para o oligo-RNA que contém. <ol><li> 1 M de NaOH. </li><li> 1,2 M de solução de HCl. </li><li> 1 M de Tris-HCl, solução de pH 7.4. </li></ol>

generation of rna/dna hybrids in genomic dna by transformation using rna-containing oligonucleotides

Sintéticos curto polímeros de ácido nucléico, oligonucleotides (oligos), são as ferramentas mais funcional e generalizada da biologia molecular. Oligos podem ser produzidos para conter qualquer DNA ou RNA desejada seqüência e pode ser preparado para incluir uma ampla variedade de base e modificações açúcar. Além disso, oligos podem ser projetados para imitar alterações específicas de ácidos nucléicos e, portanto, podem servir como importantes ferramentas para investigar os efeitos de danos no DNA e mecanismos de reparação. Descobrimos que Thermo Scientific Dharmacon RNA contendo oligos com um comprimento entre 50 e 80 nucleotídeos pode ser particularmente adequado para estudar, in vivo, as funções e conseqüências de RNA cromossômicas / híbridos de DNA e de ribonucleotídeos incorporadas ao DNA. RNA / DNA híbridos podem facilmente se formam durante o reparo do DNA, replicação e transcrição, no entanto, muito pouco se sabe sobre a estabilidade do RNA / DNA híbrido em células e em que medida estes híbridos podem afetar a integridade genética das células. RNA contendo oligos, portanto, representam um vetor perfeito para apresentar em ribonucleotídeos DNA cromossômico e gerar RNA / DNA híbridos de comprimento escolhido e composição base. Aqui apresentamos o protocolo para a incorporação de ribonucleotídeos no genoma da levedura eucariótica modelo de sistema / Saccharomyces cerevisiae /. No entanto, nosso laboratório utilizou Thermo Scientific Dharmacon RNA contendo oligos para gerar RNA / DNA híbridos ao nível cromossômico em sistemas de células diferentes, de bactérias a células humanas.

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Generation of RNA/DNA Hybrids in Genomic DNA by Transformation using RNA-containing Oligonucleotides

Este trabalho mostra como formar um híbrido RNA / DNA no nível cromossômico e revelar transferência de informação genética do RNA para DNA genômico em células de levedura.

Geração de RNA / DNA híbrido em DNA genômico por transformação por meio de RNA contendo Oligonucleotídeos

Synthetic short nucleic acid polymers, oligonucleotides (oligos), are the most functional and widespread tools of molecular biology. Oligos can be ...

generation-rnadna-hybrids-genomic-dna-transformation-using-rna

Research

JoVE Journal

Biology

26.7K visualizações.  Georgia Institute of Technology. Este trabalho mostra como formar um híbrido RNA / DNA no nível cromossômico e revelar transferência de informação genética do RNA para DNA genômico em células de levedura.

Vídeo: Generation of RNA/DNA Hybrids in Genomic DNA by Transformation using RNA-containing Oligonucleotides

Isolation of Genomic DNA from Mouse Tails

Isolamento de DNA genômico de Tails rato

Biologia

Transformation of Plasmid DNA into E. coli Using the Heat Shock Method

Transformation of plasmid DNA into E. coli using the heat shock method is a basic technique of molecular biology. It consists of inserting a foreign plasmid or ligation product into bacteria. This video protocol describes the traditional method of transformation using commercially available chemically competent bacteria from Genlantis. After a short incubation in ice, a mixture of chemically competent bacteria and DNA is placed at 42&deg;C for 45 seconds (heat shock) and then placed back in ice. SOC media is added and the transformed cells are incubated at 37&deg;C for 30 min with agitation. To be assured of isolating colonies irrespective of transformation efficiency, two quantities of transformed bacteria are plated. This traditional protocol can be used successfully to transform most commercially available competent bacteria. The turbocells from Genlantis can also be used in a novel 3-minute transformation protocol, described in the instruction manual.

Transformação do DNA plasmidial em E. coli Usando o método de choque térmico

Transformation of plasmid DNA into E. coli using the heat shock method is a basic technique of molecular biology. It consists of inserting a foreign ...

Extraction of High Molecular Weight Genomic DNA from Soils and Sediments

The soil microbiome is a vast and relatively unexplored reservoir of genomic diversity and metabolic innovation that is intimately associated with nutrient and energy flow within terrestrial ecosystems. Cultivation-independent environmental genomic, also known as metagenomic, approaches promise unprecedented access to this genetic information with respect to pathway reconstruction and functional screening for high value therapeutic and biomass conversion processes. However, the soil microbiome still remains a challenge largely due to the difficulty in obtaining high molecular weight DNA of sufficient quality for large insert library production. Here we introduce a protocol for extracting high molecular weight, microbial community genomic DNA from soils and sediments. The quality of isolated genomic DNA is ideal for constructing large insert environmental genomic libraries for downstream sequencing and screening applications. 
The procedure starts with cell lysis. Cell walls and membranes of microbes are lysed by both mechanical (grinding) and chemical forces (&beta;-mercaptoethanol). Genomic DNA is then isolated using extraction buffer, chloroform-isoamyl alcohol and isopropyl alcohol. The buffers employed for the lysis and extraction steps include guanidine isothiocyanate and hexadecyltrimethylammonium bromide (CTAB) to preserve the integrity of the high molecular weight genomic DNA. Depending on your downstream application, the isolated genomic DNA can be further purified using cesium chloride (CsCl) gradient ultracentrifugation, which reduces impurities including humic acids. The first procedure, extraction, takes approximately 8 hours, excluding DNA quantification step. The CsCl gradient ultracentrifugation, is a two days process. During the entire procedure, genomic DNA should be treated gently to prevent shearing, avoid severe vortexing, and repetitive harsh pipetting.

A methodology to isolate high molecular weight and high quality genomic DNA from soil microbial community is described.

Extração de DNA genômico de alto peso molecular de solos e sedimentos

The soil microbiome is a vast and relatively unexplored reservoir of genomic diversity and metabolic innovation that is intimately associated with ...

Generation of Transgenic C. elegans by Biolistic Transformation

The number of laboratories using the free living nematode C. elegans is rapidly growing. The popularity of this biological model is attributed to a rapid generation time and short life span, easy and inexpensive maintenance, fully sequenced genome, and array of RNAi resources and mutant animals. Additionally, analysis of the C. elegans genome revealed a great similarity between worms and higher vertebrates, which suggests that research in worms could be an important adjunct to studies performed in whole mice or cultured cells. A powerful and important part of worm research is the ability to use transgenic animals to study gene localization and function. Transgenic animals can be created either via microinjection of the worm germline or through the use of biolistic bombardment. Bombardment is a newer technique and is less familiar to a number of labs. Here we describe a simple protocol to generate transgenic worms by biolistic bombardment with gold particles using the Bio-Rad PDS-1000 system. Compared with DNA microinjection into hermaphrodite germline, this protocol has the advantage of not requiring special skills from the operator with regards to identifying worm anatomy or performing microinjection. Further multiple transgenic lines are usually obtained from a single bombardment. Also in contrast to microinjection, biolistic bombardment produces transgenic animals with both extrachromosomal arrays and integrated transgenes. The ability to obtain integrated transgenic lines can avoid the use of mutagenic protocols to integrate foreign DNA. In conclusion, biolistic bombardment can be an attractive method for the generation of transgenic animals, especially for investigators not interested in investing the time and effort needed to become skilled at microinjection.

Generation of Transgenic C. elegans by Biolistic Transformation

Transgenic worms are commonly used in C. elegans research. Described is a simple, yet effective, protocol to introduce transgenes into worms using biolistic bombardment with DNA-coated gold particles. The effort involved and results of bombardment compare favorably with microinjection for the generation of transgenic animals.

Geração de transgênicos C. elegans Por biobalística Transformação

The number of laboratories using the free living nematode C. elegans is rapidly growing. The popularity of this biological model is attributed to a rapid ...

Genomic MRI - a Public Resource for Studying Sequence Patterns within Genomic DNA

Non-coding genomic regions in complex eukaryotes, including intergenic areas, introns, and untranslated segments of exons, are profoundly non-random in their nucleotide composition and consist of a complex mosaic of sequence patterns. These patterns include so-called Mid-Range Inhomogeneity (MRI) regions -- sequences 30-10000 nucleotides in length that are enriched by a particular base or combination of bases (e.g. (G+T)-rich, purine-rich, etc.). MRI regions are associated with unusual (non-B-form) DNA structures that are often involved in regulation of gene expression, recombination, and other genetic processes (Fedorova &amp; Fedorov 2010). The existence of a strong fixation bias within MRI regions against mutations that tend to reduce their sequence inhomogeneity additionally supports the functionality and importance of these genomic sequences (Prakash et al. 2009).
Here we demonstrate a freely available Internet resource -- the Genomic MRI program package -- designed for computational analysis of genomic sequences in order to find and characterize various MRI patterns within them (Bechtel et al. 2008). This package also allows generation of randomized sequences with various properties and level of correspondence to the natural input DNA sequences. The main goal of this resource is to facilitate examination of vast regions of non-coding DNA that are still scarcely investigated and await thorough exploration and recognition.

We present a public computational web site for the analysis of genomic sequences. It detects DNA sequence patterns with various non-random nucleotide compositions. This resource also generates randomized sequences with diverse levels of complexity.

Genômica MRI - um recurso público para estudar os padrões de seqüência dentro de DNA genômico

Non-coding genomic regions in complex eukaryotes, including intergenic areas, introns, and untranslated segments of exons, are profoundly non-random in ...

Isolation and Characterization of RNA-Containing Exosomes

The field of exosome research is rapidly expanding, with a dramatic increase in publications in recent years. These small vesicles (30-100 nm) of endocytic origin were first proposed to function as a way for reticulocytes to eradicate the transferrin receptor while maturing into erythrocytes1, and were later named exosomes. Exosomes are formed by inward budding of late endosomes, producing multivesicular bodies (MVBs), and are released into the environment by fusion of the MVBs with the plasma membrane2. Since the first discovery of exosomes, a wide range of cells have been shown to release these vesicles. Exosomes have also been detected in several biological fluids, including plasma, nasal lavage fluid, saliva and breast milk3-6. Furthermore, it has been demonstrated that the content and function of exosomes depends on the originating cell and the conditions under which they are produced. A variety of functions have been demonstrated for exosomes, such as induction of tolerance against allergen7,8, eradication of established tumors in mice9, inhibition and activation of natural killer cells10-12, promotion of differentiation into T regulatory cells13, stimulation of T cell proliferation14 and induction of T cell apoptosis15. Year 2007 we demonstrated that exosomes released from mast cells contain messenger RNA (mRNA) and microRNA (miRNA), and that the RNA can be shuttled from one cell to another via exosomes. In the recipient cells, the mRNA shuttled by exosomes was shown to be translated into protein, suggesting a regulatory function of the transferred RNA16. Further, we have also shown that exosomes derived from cells grown under oxidative stress can induce tolerance against further stress in recipient cells and thus suggest a biological function of the exosomal shuttle RNA17. Cell culture media and biological fluids contain a mixture of vesicles and shed fragments. A high quality isolation method for exosomes, followed by characterization and identification of the exosomes and their content, is therefore crucial to distinguish exosomes from other vesicles and particles. Here, we present a method for the isolation of exosomes from both cell culture medium and body fluids. This isolation method is based on repeated centrifugation and filtration steps, followed by a final ultracentrifugation step in which the exosomes are pelleted. Important methods to identify the exosomes and characterize the exosomal morphology and protein content are highlighted, including electron microscopy, flow cytometry and Western blot. The purification of the total exosomal RNA is based on spin column chromatography and the exosomal RNA yield and size distribution is analyzed using a Bioanalyzer.

This paper demonstrates methods for the isolation, purification and detection of exosomes, as well as techniques for analysis of their molecular content. These methods are adaptable for exosome isolation from both cell culture media and biological fluids, and can beyond analysis of molecular content also be useful in functional studies.

Isolamento e Caracterização de RNA-Contendo exossomos

The field of exosome research is rapidly expanding, with a dramatic increase in publications in recent years. These small vesicles (30-100 nm) of ...

Genomic Transformation of the Picoeukaryote Ostreococcus tauri

Common problems hindering rapid progress in Plant Sciences include cellular, tissue and whole organism complexity, and notably the high level of genomic redundancy affecting simple genetics in higher plants. The novel model organism Ostreococcus tauri is the smallest free-living eukaryote known to date, and possesses a greatly reduced genome size and cellular complexity1,2, manifested by the presence of just one of most organelles (mitochondrion, chloroplast, golgi stack) per cell, and a genome containing only ~8000 genes. Furthermore, the combination of unicellularity and easy culture provides a platform amenable to chemical biology approaches. Recently, Ostreococcus has been successfully employed to study basic mechanisms underlying circadian timekeeping3-6. Results from this model organism have impacted not only plant science, but also mammalian biology7. This example highlights how rapid experimentation in a simple eukaryote from the green lineage can accelerate research in more complex organisms by generating testable hypotheses using methods technically feasible only in this background of reduced complexity. Knowledge of a genome and the possibility to modify genes are essential tools in any model species. Genomic1, Transcriptomic8, and Proteomic9 information for this species is freely available, whereas the previously reported methods6,10 to genetically transform Ostreococcus are known to few laboratories worldwide.
In this article, the experimental methods to genetically transform this novel model organism with an overexpression construct by means of electroporation are outlined in detail, as well as the method of inclusion of transformed cells in low percentage agarose to allow selection of transformed lines originating from a single transformed cell. Following the successful application of Ostreococcus to circadian research, growing interest in Ostreococcus can be expected from diverse research areas within and outside plant sciences, including biotechnological areas. Researchers from a broad range of biological and medical sciences that work on conserved biochemical pathways may consider pursuing research in Ostreococcus, free from the genomic and organismal complexity of larger model species.

Genomic Transformation of the Picoeukaryote Ostreococcus tauri

This article describes genetic transformation of the unicellular marine alga Ostreococcus tauri by electroporation. This eukaryotic organism is an effective model platform for higher plants, possesing greatly reduced genomic and cellular complexity and being readily amenable to both cell culture and chemical biology.

Transformação genômica do Picoeukaryote<em&gt; Ostreococcus tauri</em

Common problems hindering rapid progress in Plant Sciences include cellular, tissue and whole organism complexity, and notably the high level of genomic ...

Selective Capture of 5-hydroxymethylcytosine from Genomic DNA

5-methylcytosine (5-mC) constitutes ~2-8% of the total cytosines in human genomic DNA and impacts a broad range of biological functions, including gene expression, maintenance of genome integrity, parental imprinting, X-chromosome inactivation, regulation of development, aging, and cancer1. Recently, the presence of an oxidized 5-mC, 5-hydroxymethylcytosine (5-hmC), was discovered in mammalian cells, in particular in embryonic stem (ES) cells and neuronal cells2-4. 5-hmC is generated by oxidation of 5-mC catalyzed by TET family iron (II)/&alpha;-ketoglutarate-dependent dioxygenases2, 3. 5-hmC is proposed to be involved in the maintenance of embryonic stem (mES) cell, normal hematopoiesis and malignancies, and zygote development2, 5-10. To better understand the function of 5-hmC, a reliable and straightforward sequencing system is essential. Traditional bisulfite sequencing cannot distinguish 5-hmC from 5-mC11. To unravel the biology of 5-hmC, we have developed a highly efficient and selective chemical approach to label and capture 5-hmC, taking advantage of a bacteriophage enzyme that adds a glucose moiety to 5-hmC specifically12.
Here we describe a straightforward two-step procedure for selective chemical labeling of 5-hmC. In the first labeling step, 5-hmC in genomic DNA is labeled with a 6-azide-glucose catalyzed by &beta;-GT, a glucosyltransferase from T4 bacteriophage, in a way that transfers the 6-azide-glucose to 5-hmC from the modified cofactor, UDP-6-N3-Glc (6-N3UDPG). In the second step, biotinylation, a disulfide biotin linker is attached to the azide group by click chemistry. Both steps are highly specific and efficient, leading to complete labeling regardless of the abundance of 5-hmC in genomic regions and giving extremely low background. Following biotinylation of 5-hmC, the 5-hmC-containing DNA fragments are then selectively captured using streptavidin beads in a density-independent manner. The resulting 5-hmC-enriched DNA fragments could be used for downstream analyses, including next-generation sequencing.
Our selective labeling and capture protocol confers high sensitivity, applicable to any source of genomic DNA with variable/diverse 5-hmC abundances. Although the main purpose of this protocol is its downstream application (i.e., next-generation sequencing to map out the 5-hmC distribution in genome), it is compatible with single-molecule, real-time SMRT (DNA) sequencing, which is capable of delivering single-base resolution sequencing of 5-hmC.

Described is a two-step labeling process using &beta;-glucosyltransferase (&beta;-GT) to transfer an azide-glucose to 5-hmC, followed by click chemistry to transfer a biotin linker for easy and density-independent enrichment. This efficient and specific labeling method enables enrichment of 5-hmC with extremely low background and high-throughput epigenomic mapping via next-generation sequencing.

Captura selectivo de 5-hydroxymethylcytosine a partir de DNA genómico

5-methylcytosine (5-mC) constitutes ~2-8% of the total cytosines in human genomic DNA and impacts a broad range of biological functions, including gene ...

Real-time Imaging of Single Engineered RNA Transcripts in Living Cells Using Ratiometric Bimolecular Beacons

The growing realization that both the temporal and spatial regulation of gene expression can have important consequences on cell function has led to the development of diverse techniques to visualize individual RNA transcripts in single living cells. One promising technique that has recently been described utilizes an oligonucleotide-based optical probe, ratiometric bimolecular beacon (RBMB), to detect RNA transcripts that were engineered to contain at least four tandem repeats of the RBMB target sequence in the 3&#8217;-untranslated region. RBMBs are specifically designed to emit a bright fluorescent signal upon hybridization to complementary RNA, but otherwise remain quenched. The use of a synthetic probe in this approach allows photostable, red-shifted, and highly emissive organic dyes to be used for imaging. Binding of multiple RBMBs to the engineered RNA transcripts results in discrete fluorescence spots when viewed under a wide-field fluorescent microscope. Consequently, the movement of individual RNA transcripts can be readily visualized in real-time by taking a time series of fluorescent images. Here we describe the preparation and purification of RBMBs, delivery into cells by microporation and live-cell imaging of single RNA transcripts.

Ratiometric bimolecular beacons (RBMBs) can be used to image single engineered RNA transcripts in living cells. Here, we describe the preparation and purification of RBMBs, delivery of RBMBs into cells by microporation and fluorescent imaging of single RNA transcripts in real-time.

Imagens em tempo real de uma única Engineered RNA transcritos em células vivas usando raciométrica Bimolecular Beacons

The growing realization that both the temporal and spatial regulation of gene expression can have important consequences on cell function has led to the ...

Generation of Genomic Deletions in Mammalian Cell Lines via CRISPR/Cas9

The prokaryotic clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/CRISPR-associated (Cas) 9 system may be re-purposed for site-specific eukaryotic genome engineering. CRISPR/Cas9 is an inexpensive, facile, and efficient genome editing tool that allows genetic perturbation of genes and genetic elements. Here we present a simple methodology for CRISPR design, cloning, and delivery for the production of genomic deletions. In addition, we describe techniques for deletion, identification, and characterization. This strategy relies on cellular delivery of a pair of chimeric single guide RNAs (sgRNAs) to create two double strand breaks (DSBs) at a locus in order to delete the intervening DNA segment by non-homologous end joining (NHEJ) repair. Deletions have potential advantages as compared to single-site small indels given the efficiency of biallelic modification, ease of rapid identification by PCR, predictability of loss-of-function, and utility for the study of non-coding elements. This approach can be used for efficient loss-of-function studies of genes and genetic elements in mammalian cell lines.

CRISPR/Cas9 is a robust system to produce disruption of genes and genetic elements. Here we describe a protocol for the efficient creation of genomic deletions in mammalian cell lines using CRISPR/Cas9.

Geração de Genomic Eliminações em linhas celulares de mamíferos através CRISPR / Cas9

The prokaryotic clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/CRISPR-associated (Cas) 9 system may be re-purposed for site-specific ...