Nosso laboratório na Johns Hopkins tem realizado pequenos transplantes de rim animal e fígado com mais de duas décadas de experiência. Este protocolo específico descreve etapas críticas necessárias para a realização com sucesso do transplante de rim ortotópico em ratos. Para aumentar a probabilidade e a reprodutibilidade do sucesso, nosso protocolo inclui três passos distintos, perfusão do rim doador através da veia portal e o uso de um sistema de manguito para anastomose as veias renais e ureteres.
Demonstrando este procedimento será o Dr.Le Qi, um estudante de pós-graduação em nosso laboratório. Para iniciar esse procedimento, anestesia o rato doador, conforme descrito no protocolo de texto. Coloque o rato em uma posição supina e imobilize os membros com fita adesiva estéril.
Aplique um lubrificante ocular e esterilize o campo cirúrgico conforme descrito no protocolo de texto. Antes da primeira incisão, certifique-se de que o rato está adequadamente anestesiado, verificando a ausência do reflexo de retirada do dedo do dedo do dedo. Usando uma tesoura, comece fazendo uma grande pele longitudinal e incisão muscular da púbica da sífilis púbica até o xifoide e entre na cavidade peritoneal.
Cubra o intestino com uma gaze úmida e estéril e mude-o para o lado direito do abdômen expondo a aorta, vena cava e rim esquerdo. Aplique um mililitro de soro fisiológico pré-aquecido com uma seringa de um cc para manter os intestinos e os órgãos abdominais úmidos e em uma temperatura normal. Aplique uma segunda gaze úmida para cobrir e mobilizar o estômago e o baço cranial ao rim.
Em seguida, adicione uma pequena gaze úmida para cobrir o rim exposto. Use fórceps de dissecação microcirúrgica para isolar e mobilizar a artéria renal esquerda e a veia do tecido conjuntivo e uns dos outros. Agora isole a veia renal esquerda cauterizando a veia gonadal esquerda e isole a artéria renal esquerda cauterizando a artéria adrenal.
Depois disso, mobilize a aorta e vena cava superior e inferior ao pediculo renal esquerdo dissecando o tecido conjuntivo com fórceps dissecando. Divida e mobilize o ureter do tecido conjuntivo usando fórceps dissecando, em seguida, use micro tesoura para fazer uma incisão diagonal a um comprimento de aproximadamente dois centímetros medido a partir da pelve renal. Insira um manguito de poliamida no meio do ureter e fixe a braçadeira colocando um nó com 8-0 sutura de seda.
Mobilize o rim esquerdo separando-o da gordura perinefirica usando fórceps dissecando ou micro tesoura. Deixe a cápsula adiposa do rim presa e use esse local para manusear o rim. Agora administre 200 unidades de heparina usando uma seringa com uma agulha calibre 27 através da veia peniana.
Pressione o local da injeção com um cotonete por pelo menos um minuto para evitar sangramento. Identifique a veia portal e a veia cava inferior. Exponha a veia cava inferior.
Prepare-se para lavar o rim injetando 50 mililitros de soro fisiológico frio misturado com 500 unidades de heparina na veia portal usando uma agulha de calibre 16. Antes de lavar, corte a veia cava inferior no nível infrahético e corte a veia portal caudal no local de inserção da agulha para permitir que o sangue saia da circulação. Comece a lavar o rim infundindo gradualmente a solução salina.
Observe uma mudança de cor do rim de vermelho escuro para uma cor cinza uniforme ou pálida. Após a descarga, liga a artéria renal e a veia proximal à aorta e vena cava. Coloque o rim corado em uma placa de Petri contendo soro fisiológico frio no gelo antes de remover o corpo do doador do campo cirúrgico.
Uma vez que o rim esteja em soro fisiológico frio, conserte e imobilize a alça do manguito e puxe suavemente a veia renal através da braçadeira. Em seguida, fixar a veia renal sobre a braçadeira colocando três nós usando 8-0 sutura de seda. Para iniciar o procedimento do receptor, repita as etapas do procedimento de doador até a administração da heparina.
Em seguida, coloque dois grampos de microvessel atrauáticos na artéria renal esquerda e veia proximal à aorta e vena cava. Ligate a veia renal receptora proximal à entrada do rim. Lave a veia renal com soro fisiológico heparinizado para remover todo o sangue restante do vaso.
Deslize a veia renal ligada sobre a veia renal algemada previamente posicionada no rim doador. Em seguida, fixar a veia com um 8-0 sutura de seda. Mantenha a mesma orientação posicional ao fixar a veia renal sobre a braçadeira.
Ligate a artéria renal proximal à entrada do rim receptor. Lave-o com soro fisiológico heparinizado para remover qualquer excesso de sangue no vaso. Agora liga o ureter ao nível do polo inferior do rim esquerdo.
Mobilize o rim da gordura perinefirica e remova o rim nativo. Realize uma anastomose de ponta a ponta da artéria renal com suturas interrompidas 8-10 usando uma sutura de nylon 10-0. Manobrem a artéria usando a camada aventurária.
Remova os grampos do vaso para reiniciar a re-perfusão do rim. Comece removendo o grampo na veia seguido pelo grampo na artéria. Use um cotonete estéril para adicionar pressão leve a qualquer área escorrendo ao redor da região da anastomose.
Alguns minutos devem ser suficientes para alcançar uma anastomose patente. Observe brevemente o rim para avaliar a perfusão adequada. Imediatamente após a refusão, o rim deve mudar de cor e gradualmente recuperar sua cor natural vermelho escuro após alguns minutos.
As peristis visíveis da produção de urina ureter e no local são às vezes observadas. Finalize inserindo a ponta exposta do manguito ureteral no ureter receptor e fixe o ureter receptor com um 8-0 gravata de seda. Para manter os doadores e receptores em posição, amarre as extremidades de cada lado ureter um ao outro.
Opcionalmente, nephrectomizar o rim direito amarrando o pedículo renal com uma sutura de seda 3-0. Remova todas as gazes da cavidade abdominal e devolva todos os órgãos à sua posição natural. Em seguida, esguichar um mililitro de soro fisiológico sobre os intestinos para mantê-los úmidos.
Feche o abdômen usando uma sutura absorvível de 4-0 no músculo reto e uma sutura de seda 4-0 para fechar a camada da pele de forma interrompida. Coloque o animal em uma gaiola limpa com acesso a água e alimentos ad libitum e permita a recuperação em uma almofada de aquecimento Celsius de 37 graus. Observe a recuperação por uma a duas horas antes de devolver o animal de volta à instalação animal.
Animais com transplante de rim sintérico alcançaram sobrevida a longo prazo sem qualquer tratamento imunossupressor. Por outro lado, animais que receberam transplante de rim aogenuólico sem imunossupressão rejeitaram o enxerto e sucumbiram à insuficiência renal com uma sobrevida mediana de oito dias. A creatinina média do soro aumentou modestamente no grupo sinténico, enquanto aumentou 14 vezes no grupo aogenético.
Após a explantação, a visão macroscópica do alusão renal sinténica não mostrou anormalidades. A cor dos rins e as estruturas internas permaneceram intactas. Em contraste, alusões renais de animais rejeitados apresentaram manchas hemorrágicas vermelhas com a destruição das estruturas internas.
As manchas de hematoxilina e eosina de enxertos síngênicos mostraram finas alças capilares glomerulares com números normais de células endoteliais e mesangiais. Alógrafos rejeitados exibiam estruturas glomerulares destruídas com sinais de inflamação e tubulite. A coloração positiva do CD8 foi realizada para confirmar a rejeição mediada por células T.
Enquanto as alusões sinténicas mostraram pouquíssimas células T positivas CD8, os alógrafos rejeitados mostraram um número significativamente maior de células positivas CD8 dentro e ao redor do glomeruli e tubuli confirmando a rejeição mediada por células T. Este modelo fornece uma visão significativa dos fenômenos imunológicos de rejeição, tolerância e interações doador-host, abrindo caminho para o desenvolvimento de intervenções clínicas terapêuticas no transplante de órgãos sólidos.
