Name: implantation of fibrin gel on mouse lung to study lung-specific angiogenesis
Uploaded: 2014-12-21T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 52 s
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Este trabalho foi financiado por fundos da American Heart Association (AM), Departamento de Defesa dos EUA (BC074986), e do Boston Children Hospital Faculdade Career Development Fellowship (TM, AM). Os autores agradecem a Amanda Jiang e Elisabeth Jiang para assistência técnica.

NOTA: O estudo in vivo em animais foi realizado em estrita conformidade com as recomendações do Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório do Instituto Nacional de Saúde. O protocolo foi revisto e aprovado pelo Comitê de Cuidados e Uso Animal do Hospital Infantil de Boston (números de protocolo: 13-10-2526R, 14-02-2568R). Todos os medicamentos utilizados neste protocolo são de grau farmacêutico e esses medicamentos são preparados em condições estéreis. 1. Preparação de fibrina Gel <ol><li> Prepare gel de fibrina que contém o VEGF e bFGF. <ol><li> Descongelar as soluções estoque de fibrinogénio e trombina que são armazenadas a -80 ° C até à temperatura ambiente (25 ° C). </li><li> Adicionar trombina (concentração final: 2,5 U / ml), CaCl2 (concentração final: 45 mM), de VEGF (concentração final: 0-100 ng / ml) e bFGF (concentração final: 0-100 ng / ml) para o fibrinogénio solução (concentração final: 12,5 mg / ml em 0,9% sodium uma solução de cloreto 43-45) em um tubo de 1,5 ml. </li><li> Misture delicadamente por pipetagem. </li><li> Pipeta suavemente 200 ul da mistura num prato de plástico estéril de uma forma gota a gota, usando uma pipeta de ponta p200. </li><li> Incubar as gotas a 37 ° C durante 30-60 minutos até se solidificar. NOTA: O gel solidificado pode ser mantido no prato de plástico selado à temperatura ambiente (25 ° C) durante várias horas antes da implantação (Figura 1a). </li></ol></li><li> Apare o gel de fibrina em aproximadamente 3 x 3 x 3 cubos mm utilizando pequenas tesouras cirúrgicas antes da implantação. </li></ol> 2. Preparação do rato <ol><li> Anestesiar rato adulto (8-12 semanas) por injecção intraperitoneal (IP) de injecção de cetamina (100 mg / kg) e xilazina (10 mg / kg) e confirmam que o rato é adequadamente anestesiados por beliscar dedo do pé do rato. <ol><li> Use vet pomada nos olhos do mouse para prevenir o ressecamento durante o experimento. </li></ol></li><li> Shave fur sobre o lado esquerdo da caixa torácica do mouse. </li><li> Execute entubação endotraqueal do mouse. </li><li> Posicione o mouse sobre a intubação ficar em ângulo de 70 ° e segure o mouse no lugar ligando seus incisivos superiores ao longo de um pequeno anel de borracha localizado na parte superior do suporte. </li><li> Gentilmente retrair a língua de um lado usando uma pinça sem corte. </li><li> Visualizar a laringe, com o auxílio de um microscópio de pescoço de ganso iluminador de fibra óptica. </li><li> Insira endotraqueal cateter elástico (21 G) na traquéia. </li><li> Confirme se o mouse está respirando espontaneamente de uma forma suave (regular 100-150 ciclos / min, sem respiração paradoxal ou superficial). </li><li> Posicione o mouse em posição frontal sob o microscópio de dissecação. </li><li> Mecanicamente ventilar o mouse utilizando um ventilador de roedor (150 ciclos / min e 7 ml / kg volume corrente). </li><li> Contagem costelas para localizar espaço intercostal entre 4ª e 5ª costela. </li><li> Criar um campo estéril sobre a área by completamente limpando com álcool e iodopovidona. Cubra o campo cirúrgico adequadamente com um campo cirúrgico estéril. </li></ol> 3. Rato Cirurgia <ol><li> Após a injecção local de bupivacaína a 0,25% (200 ul) na pele, fazer uma incisão cutânea transversal (cerca de 1 cm de comprimento) sobre o espaço intercostal com tesouras de dissecção. </li><li> Após a injeção de bupivacaína a 0,25% (200 mL) no músculo intercostal, fazer uma incisão do músculo entre a 4ª e 5ª costela usando uma tesoura pequena multa. </li><li> Insira um afastador dissecando entre as costelas para visualizar totalmente o pulmão esquerdo. <ol><li> Raspe uma pequena área (1 x 1 mm quadrados) de pleura visceral do centro de pulmão esquerdo usando uma pinça fina. </li><li> Aplique uma leve pressão sobre a área usando um cotonete estéril até que o sangramento e vazamentos são totalmente controlados. </li><li> Coloque pequena quantidade de mistura fresca de fibrinogénio / trombina (cola de fibrina) (passo 1.1.2. 20 &amp; #181; l) sobre a área usando ponta p200 pipeta. </li></ol></li><li> Suavemente colocar um gel de fibrina (passo 1.2), utilizando pequenas pinças sobre a área (Figura 1b). <ol><li> Confirmar que o gel é bem fixo na área durante os movimentos respiratórios dos pulmões. </li></ol></li><li> Certifique-se de que não existe nem enorme vazamento de ar, nem hemorragia do pulmão. </li><li> Fechar incisões (camadas de músculo e pele) com sutura absorvível, que não tem de ser removido. </li><li> Aspirar a cavidade torácica com 27 G agulha e seringa de 1 ml para evitar pneumotórax. </li><li> Terminar ventilação mecânica. </li></ol> 4. Rato Recovery <ol><li> Verifique se o mouse está respirando espontaneamente de uma forma suave (regular 100-150 ciclos / min, sem respiração paradoxal ou superficial). </li><li> IP injectar 1 ml de pré-aquecido 0,9% de NaCl para evitar a desidratação. </li><li> Permitir mouse para recuperar na almofada de água quente circulante. </li><li> Remover o endotrachetubo al depois de confirmar que o rato tem respiração estável. </li><li> Injectar meloxicam (5 mg / kg, injecção subcutânea (SC), durante 3 dias como analgésico pós-operatório. </li><li> Monitorar os movimentos do mouse com cuidado em um mínimo de 15 minutos de intervalo até que seja esternal (capaz de rolar sua estômago e permanecer em pé) e consciente. </li><li> Após a recuperação, o retorno do mouse para uma nova gaiola isolada de ratos sem cirurgia. </li><li> Monitorar o local da cirurgia para sinais de infecção (vermelhidão, inchaço, secreção), funções biológicas básicas do animal (alimentos e água ingestão, urinar, defecar, ganho de peso corporal), bem como sinais clínicos de angústia (piloerection, reduziu a locomoção) diariamente após a procedimento cirúrgico. </li></ol> 5. A colheita do Pulmão <ol><li> 7 a 30 dias após a implantação, eutanásia do rato usando CO 2 através fonte de gás comprimido. </li><li> Faça uma incisão entre a ponta do apêndice xifóide eo esternoentalhe (esternotomia mediana) e toda a colheita de pulmão com o gel implantado para análise histológica e bioquímica, cortando a traqueia e dissecar todas as conexões com o coração, pulmões e traquéia. </li><li> Corrigir gel implantado com pulmão com solução de paraformaldeído a 4% durante a noite a 4 ºC, incorporar em composto OCT, e tomar seções passo em série de 30 mm de espessura. </li><li> Execute histológico (hematoxilina e eosina) e análises de imuno-histoquímica (marcador endotelial: CD31, marcador epitelial: aquaporin (AQP) 5 e surfactante proteína (SP) -B) usando microscópio confocal 22,37,40. </li><li> Compilar pilhas de secções ópticas (30 mm de espessura) para formar imagens tridimensionais de endotelial pulmão e células epiteliais utilizando imagem 3D software de análise de 37. </li><li> Quantificar áreas projectadas dos vasos sanguíneos recém-formados usando software de análise de imagem 46. </li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

Este artigo apresenta um novo método para implantar biomateriais na superfície do pulmão de vida do rato adulto. Com este sistema, a angiogénese derivados de pulmão hospedeiro com sucesso, se condensa no interior do material. Este sistema permite que os investigadores para explorar a interferência entre as células endoteliais, outras células (por exemplo, células epiteliais, células mesenquimais, células imunes), e vários componentes da matriz extracelular que são necessárias para a angiogénese l...

O objetivo geral deste protocolo é a introdução de um método para implantar gel de fibrina na superfície do pulmão de rato adulto, o que permite aos pesquisadores para caracterizar os mecanismos moleculares da vascular pulmonar e desenvolvimento alveolar, e para aproveitar esse conhecimento, a fim de desenvolver materiais biomiméticos capaz de recapitular vascular pulmonar fisiológico e formação alveolar para o tratamento de várias doenças pulmonares. Mais de 35 milhões de americanos sofrem de doenças pulmonares crônicas, incluindo doença pulmonar obstrutiva crônica e fibrose pulmonar. Esses pacientes têm sintomas crônicos de longa duração respiratórios, como falta de ar, aperto no peito, tosse persistente e cansaço, que prejudiquem significativamente a sua vida diária 1-3. Apesar de uma grande quantidade de esforço para desenvolver terapias eficazes para essas doenças pulmonares, atualmente não há cura; portanto, a qualidade de vida para estes pacientes é pobre e econômica e os custos humanos são oigh 4-7. Atualmente, o transplante de pulmão é a única maneira de salvar os pacientes em fase terminal de doenças pulmonares crônicas. No entanto, por causa da escassez de doadores de transplante, de alto custo, complicações graves, e baixa taxa de sobrevivência 11/08, o transplante não é uma abordagem ideal. Rápido progresso recente em técnicas de engenharia de tecidos tem possibilitado aos pesquisadores modificar geneticamente pulmão implantável por repovoamento todo descelulada pulmão com vários tipos de células progenitoras ou células-tronco pluripotentes induzidas (iPS) células 12,13. No entanto, esses pulmões bioengenharia são funcionais apenas em animais hospedeiros, por várias horas após a implantação 12,14,15. Utilizando biomateriais para regenerar as estruturas complexas e funções dos pulmões também tem sido bastante bem sucedida. Isso pode ser porque os processos biológicos fundamentais que regem a regeneração do pulmão adulto não têm sido bem explorado. No pulmão, a formação do sistema vascular é um dos acontecimentos mais precoces e mais importantes during desenvolvimento e regeneração 16-21. Vasculaturas recém-formados no pulmão não só fornecer oxigénio, nutrientes e os vários componentes celulares necessários para a formação de órgãos, mas também fornecem sinais reguladores instrutivos para células vizinhas 22-25. Assim, a angiogênese desempenha papel-chave na alveolarização regenerativo no pulmão adulto 24,26,27. Além disso, contribui para a angiogênese desregulamentado doenças pulmonares crônicas, como doença pulmonar obstrutiva crônica (DPOC) 28, displasia broncopulmonar (DBP) 21-23, e fibrose pulmonar 29. Assim, o desenvolvimento de estratégias mais eficientes para a engenharia pulmões ou o tratamento de doenças pulmonares crônicas, é necessário entender os mecanismos fundamentais da angiogênese específico do pulmão. Cada órgão apresenta propriedades mecânicas e químicas únicas, que podem diferir entre as condições fisiológicas e patológicas 30-33. Estes microenviron órgão-específicamentos regular comportamentos de células endoteliais e orquestrar a formação da rede vascular de forma específica do órgão 24,34-36. Assim, o desenvolvimento de estratégias mais eficazes para a regeneração do pulmão, o mecanismo subjacente a angiogênese específico do pulmão precisa ser entendido. Embora os ensaios de angiogénese in vivo convencionais, tais como implantação subcutânea de hidrogel têm sido amplamente utilizados para pesquisa da angiogênese 37-39, esses métodos não recapitular angiogénese específica de órgão. Recentemente, um novo método para implante de Matrigel em um molde elástico no pulmão do rato tem sido desenvolvido e mostrado para recrutar com sucesso os vasos sanguíneos e células epiteliais do pulmão em 22 géis. Esta abordagem única permitirá que os investigadores para explorar o mecanismo de angiogênese específico do pulmão, bem como as interações entre os vasos sanguíneos e células pulmonares não-vasculares em condições fisiológicas e patológicas. Desde 1) Matrigel não é adequado para a aplicação clínica; 2) o emolde lastic usado para lançar o gel pode afetar interações entre hidrogéis e tecido pulmonar de acolhimento e 3) o molde elástico no pulmão potencialmente causa comprometimento da função pulmonar e dor durante a respiração, como uma abordagem mais clinicamente relevante, uma matriz de fibrina 3D contendo fatores angiogênicos (factor de crescimento endotelial vascular (VEGF) / factor de crescimento de fibroblastos básico (bFGF)) foi implantado no pulmão do rato sem vazamento no molde elástico, e tem sucesso recapitulado hospedeiro angiogénese derivados de pulmão. Gel de fibrina, fibrilas de polímero gerados a partir de fibrinogénio clivada pela trombina, a armadilha é conhecida uma variedade de factores angiogénicos, tais como bFGF e VEGF para acelerar a angiogénese in vivo 40,41. Devido à sua capacidade regenerativa e natureza biodegradável 42, gel de fibrina é amplamente utilizada no campo da engenharia de tecidos. Este artigo apresenta uma abordagem inovadora e única para implantar gel de fibrina na superfície do pulmão de Adul vivot mouse e demonstra que o anfitrião angiogênese derivado do pulmão é recapitulada no interior dos géis in vivo. Este método, o qual permite aos investigadores a estudar angiogénese específica do pulmão, provavelmente irá levar ao desenvolvimento de novas abordagens terapêuticas para vários tipos de doenças pulmonares e avançar significativamente os esforços para regenerar com sucesso adulto pulmão.

<table><tbody><tr><td>Fibrinogen from human placenta</td><td>Sigma</td><td>F4883</td><td>For fabrication of fibrin gel</td></tr><tr><td>Thrombin from bovine plasma</td><td>Sigma</td><td>T9549</td><td>For fabrication of fibrin gel</td></tr><tr><td>Recombinant mouse VEGF 164</td><td>R&amp;amp;D</td><td>493-MV</td><td>For supplementation to fibrin gel</td></tr><tr><td>Recombinant mouse bFGF</td><td>R&amp;amp;D</td><td>3139-FB</td><td>For supplementation to fibrin gel</td></tr><tr><td>Rodent Intubation Stand</td><td>Braintree Scientific INC</td><td>RIS 100</td><td>For intubation</td></tr><tr><td>Fiber-Optic Light Source</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-565-35</td><td>For intubation</td></tr><tr><td>21 G Elastic catheter</td><td>B.Braun</td><td>4251652-02</td><td>For intubation</td></tr><tr><td>MiniVent Ventilator</td><td>Harvard Apparatus</td><td>CGS-8009</td><td>For ventilation</td></tr><tr><td>Stemi DV4 Steromicroscope</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-070-515</td><td>For surgey</td></tr><tr><td>Absobable suture</td><td>Ethicon</td><td>PDP304</td><td>Surgical suture</td></tr><tr><td>Antibody against CD31</td><td>BD Biosciences</td><td>553370</td><td>Immunohistochemistry</td></tr><tr><td>Antibody against AQP5</td><td>Abcam</td><td>AB78486</td><td>Immunohistochemistry</td></tr><tr><td>Antibody against SP-B</td><td>Abcam</td><td>AB40876</td><td>Immunohistochemistry</td></tr></tbody></table>

implantation of fibrin gel on mouse lung to study lung-specific angiogenesis

Os recentes avanços significativos nas técnicas de pesquisa com células-tronco e bioengenharia têm feito grandes progressos na utilização de biomateriais para regenerar e reparar danos em tecidos simples nas áreas de ortopedia e periodontais. No entanto, as tentativas para regenerar as estruturas e as funções dos órgãos (3D) mais complexas tridimensionais, tais como os pulmões não têm sido muito bem sucedida, porque os processos biológicos de regeneração de órgãos não foram bem exploradas. Torna-se claro que a angiogênese, a formação de novos vasos sanguíneos, desempenha papel fundamental na regeneração de órgãos. Recentemente formado vasculaturas não só fornecer oxigénio, nutrientes e os vários componentes celulares que são necessários para a regeneração de órgãos, mas também fornecem sinais instrutivos para os tecidos em regeneração locais. Portanto, para regenerar com sucesso em pulmões de um adulto, que é necessário para recapitular os microambientes específicos do pulmão em que a angiogénese unidades de regeneração dos tecidos pulmonares locais. Embora conventional ensaios in vivo da angiogénese, tais como a implantação subcutânea de matriz extracelular (ECM) rico em hidrogéis (por exemplo, colagénio ou fibrina géis ou Matrigel - mistura de proteínas de ECM segregado por células de sarcoma de Engelbreth-Holm-Swarm rato), são amplamente utilizados para explorar a mecanismos gerais de angiogénese, a angiogénese específica do pulmão não tem sido bem caracterizada porque os métodos para o implante ortotópico de biomateriais no pulmão não foram bem estabelecidos. O objetivo deste protocolo é a introdução de um método único para implantar gel de fibrina na superfície do pulmão de vida do rato adulto, permitindo a recapitulação bem sucedida de acolhimento angiogênese derivado do pulmão dentro do gel. Esta abordagem permite aos investigadores para explorar os mecanismos pelos quais o microambiente-pulmão específico controla a angiogénese e regeneração alveolar em condições normais e patológicas. Desde o lançamento biomateriais implantados e fornecer sinais físicos e químicos para adjacente ltecidos ung, implantação destes biomateriais no pulmão doente pode potencialmente normalizar os tecidos doentes adjacentes, permitindo que pesquisadores a desenvolver novas abordagens terapêuticas para vários tipos de doenças pulmonares.

Para examinar se a formação vascular pulmonar derivados do hospedeiro, se condensa no interior dos biomateriais implantados no pulmão, geles de fibrina suplementado com grandes factores angiogénicos de VEGF e bFGF (0, 10 e 100 ng / ml cada) foram implantados na superfície das que vivem nos pulmões de ratinho quanto relataram o uso de Matrigel 22. 47 geles de fibrina que contêm estes factores de crescimento angiogénicos foram fabricados como se mostra na Figura 1a. Após toracotomia, u...

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Implantation of Fibrin Gel on Mouse Lung to Study Lung-specific Angiogenesis

Recapitulation of the organ-specific microenvironment, which stimulates local angiogenesis, is indispensable for successful regeneration of damaged tissues. This report demonstrates a novel method to implant fibrin gels on the lung surface of living mouse in order to explore how the lung-specific microenvironment modulates angiogenesis and alveolar regeneration in adult mouse.

Implantação de fibrina Gel no tapete do pulmão para o Estudo de angiogênese Lung-specific

Recent significant advances in stem cell research and bioengineering techniques have made great progress in utilizing biomaterials to regenerate and ...

implantation-fibrin-gel-on-mouse-lung-to-study-lung-specific

Research

JoVE Journal

Medicine

10.0K visualizações.  Boston Children's Hospital and Harvard Medical School. Recapitulation of the organ-specific microenvironment, which stimulates local angiogenesis, is indispensable for successful regeneration of damaged tissues. This report demonstrates a novel method to implant fibrin gels on the lung surface of living mouse in order to explore how the lung-specific microenvironment modulates angiogenesis and alveolar regeneration in adult mouse. 

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A Mouse Model of the Cornea Pocket Assay for Angiogenesis Study

A normal cornea is clear of vascular tissues. However, blood vessels can be induced to grow and survive in the cornea when potent angiogenic factors are administered 1. This uniqueness has made the cornea pocket assay one of the most used models for angiogenesis studies. The cornea composes multiple layers of cells. It is therefore possible to embed a pellet containing the angiogenic factor of interest in the cornea to investigate its angiogenic effect 2,3. Here, we provide a step by step demonstration of how to (I) produce the angiogenic factor-containing pellet (II) embed the pellet into the cornea (III) analyze the angiogenesis induced by the angiogenic factor of interest. Since the basic fibroblast growth factor (bFGF) is known as one of the most potent angiogenic factors 4, it is used here to induce angiogenesis in the cornea.

The cornea is unique in that it lacks vascular tissues. However, robust blood vessel growth and survival can be induced in the cornea by potent angiogenic factors. Therefore, the cornea can provide with us a valuable tool for angiogenic studies. This protocol demonstrates how to perform the mouse model of cornea pocket assay and how to assess the angiogenesis induced by angiogenic factors using this model.

Um modelo do rato do Ensaio de bolso Córnea para o Estudo da angiogênese

A normal cornea is clear of vascular tissues. However, blood vessels can be induced to grow and survive in the cornea when potent angiogenic factors are ...

Medicina

Improved Visualization of Lung Metastases at Single Cell Resolution in Mice by Combined In-situ Perfusion of Lung Tissue and X-Gal Staining of lacZ-Tagged Tumor Cells

Metastasis is the main cause of death in the majority of cancer types and consequently a main focus in cancer research. However, the detection of micrometastases by radiologic imaging and the success in their therapeutic eradication remain limited.
While animal models have proven to be invaluable tools for cancer research1, the monitoring/visualization of micrometastases remains a challenge and inaccurate evaluation of metastatic spread in preclinical studies potentially leads to disappointing results in clinical trials2. Consequently, there is great interest in refining the methods to finally allow reproducible and reliable detection of metastases down to the single cell level in normal tissue. The main focus therefore is on techniques, which allow the detection of tumor cells in vivo, like micro-computer tomography (micro-CT), positron emission tomography (PET), bioluminescence or fluorescence imaging3,4. We are currently optimizing these techniques for in vivo monitoring of primary tumor growth and metastasis in different osteosarcoma models. Some of these techniques can also be used for ex vivo analysis of metastasis beside classical methods like qPCR5, FACS6 or different types of histological staining. As a benchmark, we have established in the present study the stable transfection or transduction of tumor cells with the lacZ gene encoding the bacterial enzyme &beta;-galactosidase that metabolizes the chromogenic substrate 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-beta-D-galactopyranoside (X-Gal) to an insoluble indigo blue dye7 and allows highly sensitive and selective histochemical blue staining of tumor cells in mouse tissue ex vivo down to the single cell level as shown here. This is a low-cost and not equipment-intensive tool, which allows precise validation of metastasis8 in studies assessing new anticancer therapies9-11. A limiting factor of X-gal staining is the low contrast to e.g. blood-related red staining of well vascularized tissues. In lung tissue this problem can be solved by in-situ lung perfusion, a technique that was recently established by Borsig et al.12 who perfused the lungs of mice under anesthesia to clear them from blood and to fix and embed them in-situ under inflation through the trachea. This method prevents also the collapse of the lung and thereby maintains the morphology of functional lung alveoli, which improves the quality of the tissue for histological analysis. In the present study, we describe a new protocol, which takes advantage of a combination of X-gal staining of lacZ-expressing tumor cells and in-situ perfusion and fixation of lung tissue. This refined protocol allows high-sensitivity detection of single metastatic cells in the lung and enabled us in a recent study to detect "dormant" lung micrometastases in a mouse model13, which was originally described to be non-metastatic14.

Improved Visualization of Lung Metastases at Single Cell Resolution in Mice by Combined In-situ Perfusion of Lung Tissue and X-Gal Staining of lacZ-Tagged Tumor Cells

The novel protocol reported in the present study allows selective detection of lung metastases at single cell resolution in mice by combined in-situ lung perfusion and fixation and X-Gal staining of lacZ-tagged tumor cells.

Visualização melhorada de metástases pulmonares em Resolução única célula em Ratos por Combinado<em&gt; In-situ</em&gt; Perfusão do tecido pulmonar e X-Gal coloração de<em&gt; LacZ</em&gt;-Tagged Células Tumorais

Metastasis is the main cause of death in the majority of cancer types and consequently a main focus in cancer research. However, the detection of ...

A Novel Mammary Fat Pad Transplantation Technique to Visualize the Vessel Generation of Vascular Endothelial Stem Cells

Endothelial cells (ECs) are the fundamental building blocks of the vascular architecture and mediate vascular growth and remodeling to ensure proper vessel development and homeostasis. However, studies on endothelial lineage hierarchy remain elusive due to the lack of tools to gain access as well as to directly evaluate their behavior in vivo. To address this shortcoming, a new tissue model to study angiogenesis using the mammary fat pad has been developed. The mammary gland develops mostly in the postnatal stages, including puberty and pregnancy, during which robust epithelium proliferation is accompanied by extensive vascular remodeling. Mammary fat pads provide space, matrix, and rich angiogenic stimuli from the growing mammary epithelium. Furthermore, mammary fat pads are located outside the peritoneal cavity, making them an easily accessible grafting site for assessing the angiogenic potential of exogenous cells. This work also describes an efficient tracing approach using fluorescent reporter mice to specifically label the targeted population of vascular endothelial stem cells (VESCs) in vivo. This lineage tracing method, coupled with subsequent tissue whole-mount microscopy, enable the direct visualization of targeted cells and their descendants, through which the proliferation capability can be quantified and the differentiation commitment can be fate-mapped. Using these methods, a population of bipotent protein C receptor (Procr) expressing VESCs has recently been identified in multiple vascular systems. Procr+ VESCs, giving rise to both new ECs and pericytes, actively contribute to angiogenesis during development, homeostasis, and injury repair. Overall, this manuscript describes a new mammary fat pad transplantation and in vivo lineage tracing techniques that can be used to evaluate the stem cell properties of VESCs.

This work demonstrates a novel approach to assess the proliferation, differentiation, and vessel-forming potential of vascular endothelial stem cells (VESCs) through mammary fat pad transplantation followed by whole-mount tissue preparation for microscopic observation. A lineage tracing strategy to investigate the behavior of VESCs in vivo is also presented.

Uma nova técnica de transplante de almofada de gordura mamária para visualizar a geração de vasos de células vasculares endoteliais vasculares

Endothelial cells (ECs) are the fundamental building blocks of the vascular architecture and mediate vascular growth and remodeling to ensure proper ...

Biologia do Desenvolvimento

Angiogenesis in the Ischemic Rat Lung

The adult lung is perfused by both the systemic bronchial artery and the entire venous return flowing through the pulmonary arteries. In most lung pathologies, it is the smaller systemic vasculature that responds to a need for enhanced lung perfusion and shows robust neovascularization. Pulmonary vascular ischemia induced by pulmonary artery obstruction has been shown to result in rapid systemic arterial angiogenesis in man as well as in several animal models. Although the histologic assessment of the time course of bronchial artery proliferation in rats was carefully described by Weibel 1, mechanisms responsible for this organized growth of new vessels are not clear. We provide surgical details of inducing left pulmonary artery ischemia in the rat that leads to bronchial neovascularization. Quantification of the extent of angiogenesis presents an additional challenge due to the presence of the two vascular beds within the lung. Methods to determine functional angiogenesis based on labeled microsphere injections are provided.

The lung is perfused by both the systemic bronchial artery and pulmonary arteries. In most lung pathologies, it is the smaller systemic vasculature that shows robust neovascularization. Cessation of pulmonary blood flow promotes brisk bronchial angiogenesis. We provide surgical details of inducing left pulmonary artery ischemia that promotes bronchial neovascularization.

Angiogênese no pulmão de rato Isquêmica

The  adult lung is perfused by both the systemic bronchial artery and the entire  venous return flowing through the pulmonary arteries. In most lung ...

In vivo Measurement of the Mouse Pulmonary Endothelial Surface Layer

The endothelial glycocalyx is a layer of proteoglycans and associated glycosaminoglycans lining the vascular lumen. In vivo, the glycocalyx is highly hydrated, forming a substantial endothelial surface layer (ESL) that contributes to the maintenance of endothelial function. As the endothelial glycocalyx is often aberrant in vitro and is lost during standard tissue fixation techniques, study of the ESL requires use of intravital microscopy. To best approximate the complex physiology of the alveolar microvasculature, pulmonary intravital imaging is ideally performed on a freely-moving lung. These preparations, however, typically suffer from extensive motion artifact. We demonstrate how closed-chest intravital microscopy of a freely-moving mouse lung can be used to measure glycocalyx integrity via ESL exclusion of fluorescently-labeled high molecular weight dextrans from the endothelial surface. This non-recovery surgical technique, which requires simultaneous brightfield and fluorescent imaging of the mouse lung, allows for longitudinal observation of the subpleural microvasculature without evidence of inducing confounding lung injury.

In vivo Measurement of the Mouse Pulmonary Endothelial Surface Layer

The endothelial glycocalyx/endothelial surface layer is ideally studied using intravital microscopy. Intravital microscopy is technically challenging in a moving organ such as the lung. We demonstrate how simultaneous brightfield and fluorescent microscopy may be used to estimate endothelial surface layer thickness in a freely-moving in vivo mouse lung.

Na medição in vivo da camada superficial do rato pulmonar endotelial

The endothelial glycocalyx is a layer of proteoglycans and associated glycosaminoglycans lining the vascular lumen. In vivo, the glycocalyx is highly ...

A Permanent Window for Investigating Cancer Metastasis to the Lung

Metastasis, accounting for ~90% of cancer-related mortality, involves the systemic spread of cancer cells from primary tumors to secondary sites such as the bone, brain, and lung. Although extensively studied, the mechanistic details of this process remain poorly understood. While common imaging modalities, including computed tomography (CT), positron emission tomography (PET), and magnetic resonance imaging (MRI), offer varying degrees of gross visualization, each lacks the temporal and spatial resolution necessary to detect the dynamics of individual tumor cells. To address this, numerous techniques have been described for intravital imaging of common metastatic sites. Of these sites, the lung has proven especially challenging to access for intravital imaging owing to its delicacy and critical role in sustaining life. Although several approaches have previously been described for single-cell intravital imaging of the intact lung, all involve highly invasive and terminal procedures, limiting the maximum possible imaging duration to 6-12 h. Described here is an improved technique for the permanent implantation of a minimally invasive thoracic optical Window for High-Resolution Imaging of the Lung (WHRIL). Combined with an adapted approach to microcartography, the innovative optical window facilitates serial intravital imaging of the intact lung at single-cell resolution across multiple imaging sessions and spanning multiple weeks. Given the unprecedented duration of time over which imaging data can be gathered, the WHRIL can facilitate the accelerated discovery of the dynamic mechanisms underlying metastatic progression and numerous additional biologic processes within the lung.

Here, we present a protocol for the surgical implantation of a permanently indwelling optical window for the murine thorax, which enables high-resolution, intravital imaging of the lung. The permanence of the window makes it well-suited to the study of dynamic cellular processes in the lung, especially those that are slowly evolving, such as metastatic progression of disseminated tumor cells.

Uma janela permanente para investigar metástase do câncer no pulmão

Metastasis, accounting for ~90% of cancer-related mortality, involves the systemic spread of cancer cells from primary tumors to secondary sites such as ...

Pesquisa do câncer

Implantation of Inferior Vena Cava Interposition Graft in Mouse Model

Biodegradable scaffolds seeded with bone marrow mononuclear cells (BMCs) are often used for reconstructive surgery to treat congenital cardiac anomalies. The long-term clinical results showed excellent patency rates, however, with significant incidence of stenosis. To investigate the cellular and molecular mechanisms of vascular neotissue formation and prevent stenosis development in tissue engineered vascular grafts (TEVGs), we developed a mouse model of the graft with approximately 1 mm internal diameter. First, the TEVGs were assembled from biodegradable tubular scaffolds fabricated from a polyglycolic acid nonwoven felt mesh coated with &#949;-caprolactone and L-lactide copolymer. The scaffolds were then placed in a lyophilizer, vacuumed for 24 hr, and stored in a desiccator until cell seeding. Second, bone marrow was collected from donor mice and mononuclear cells were isolated by density gradient centrifugation. Third, approximately one million cells were seeded on a scaffold and incubated O/N. Finally, the seeded scaffolds were then implanted as infrarenal vena cava interposition grafts in C57BL/6 mice. The implanted grafts demonstrated excellent patency (&#62;90%) without evidence of thromboembolic complications or aneurysmal formation. This murine model will aid us in understanding and quantifying the cellular and molecular mechanisms of neotissue formation in the TEVG.

To improve our knowledge of cellular and molecular neotissue formation, a murine model of the TEVG was recently developed. The grafts were implanted as infrarenal vena cava interposition grafts in C57BL/6 mice. This model achieves similar results to those achieved in our clinical investigation, but over a far shortened time-course.

Implantação de Veia Cava Inferior interposição de enxerto no Rato Modelo

Biodegradable scaffolds seeded with bone marrow mononuclear cells (BMCs) are often used for reconstructive surgery to treat congenital cardiac anomalies. ...

Induction of Mouse Lung Injury by Endotracheal Injection of Bleomycin

Pulmonary fibrosis is a hallmark of several human lung diseases with a different etiology. Since current therapies are rather limited, mouse models continue to be an essential tool for developing new antifibrotic strategies. Here we provide an effective method to investigate in vivo antifibrotic activity of human mesenchymal stromal cells obtained from whole umbilical cord (hUC-MSC) in attenuating bleomycin-induced lung injury. C57BL/6 mice receive a single endotracheal injection of bleomycin (1.5 U/kg body weight) followed by a double infusion of hUC-MSC (2.5 x 105) into the tail vein, 24 h and 7 days after the bleomycin administration. Upon sacrifice at days 8, 14, or 21, inflammatory and fibrotic changes, collagen content, and hUC-MSC presence in explanted lung tissue are analyzed. The injection of bleomycin into the mouse&#160;trachea allows the direct targeting of the lungs, leading to extensive pulmonary inflammation and fibrosis. The systemic administration of a double dose of hUC-MSC results in the early blunting of the bleomycin-induced lung injury. Intravenously infused hUC-MSC are transiently engrafted into the mouse lungs, where they exert their anti-inflammatory and antifibrotic activity. In conclusion, this protocol has been successfully applied for the preclinical testing of hUC-MSC in an experimental mouse model of human pulmonary fibrosis. However, this technique can be easily extended both to study the effect of different endotracheally administered substances on the pathophysiology of the lungs and to validate new anti-inflammatory and antifibrotic systemic therapies.

Here we present an effective method to investigate the antifibrotic activity of intravenously infused human mesenchymal stromal cells obtained from the whole umbilical cord following the induction of lung injury by an endotracheal injection of bleomycin in C57BL/6 mice. This protocol can be easily extended to the preclinical testing of other therapeutics.

Indução de lesão de pulmão de camundongo por injeção endotraqueal de bleomicina

Pulmonary fibrosis is a hallmark of several human lung diseases with a different etiology. Since current therapies are rather limited, mouse models ...

Imunologia e Infecção

Transplantation of Bioengineered Lung Using Decellularized Mouse Lungs and Primary Human Endothelial Cells

Lung transplantation is a critical treatment for patients with end-stage lung diseases like idiopathic pulmonary fibrosis, but challenges such as donor shortages and posttransplant complications persist. Bioengineered lungs, integrating patient-specific cells into decellularized animal scaffolds, present a promising alternative. Despite progress in using bioengineered lungs in animal models, functionality and structure remain immature. This protocol addresses a critical barrier in organ bioengineering: the need for a cost-effective experimental platform. By using mouse models instead of larger animals like rats or swine, researchers can significantly reduce the resources required for each experiment, accelerating research progress. 
The protocol outlines a detailed procedure for lung bioengineering using mouse heart-lung blocks and human primary cells, focusing on isolation strategy for the mouse heart-lung block, decellularization, bioreactor setup, perfusion-based organ culture, and orthotopic transplantation of bioengineered lungs. This mouse-scale platform not only reduces experimental costs but also provides a viable framework for optimizing cell types and numbers for recellularization, testing different cell types using histological and molecular methods, and ensuring blood flow post-transplantation. The method holds potential for broad applications, including studying cell interactions in three-dimensional culture conditions, cell-matrix interactions, and ex vivo cancer modeling, thereby advancing the field of organ bioengineering.

This paper describes how to create bioengineered mouse lungs using decellularization and recellularization methods. It also details subsequent orthotopic lung transplantation.

Transplante de Pulmão de Bioengenharia Usando Pulmões de Camundongos Descelularizados e Células Endoteliais Humanas Primárias

Lung transplantation is a critical treatment for patients with end-stage lung diseases like idiopathic pulmonary fibrosis, but challenges such as donor ...

Bioengenharia

Multiphoton Intravital Imaging for Monitoring Leukocyte Recruitment during Arteriogenesis in a Murine Hindlimb Model

Arteriogenesis strongly depends on leukocyte and platelet recruitment to the perivascular space of growing collateral vessels. The standard approach for analyzing collateral arteries and leukocytes in arteriogenesis is ex vivo (immuno-) histological methodology. However, this technique does not allow the measurement of dynamic processes such as blood flow, shear stress, cell-cell interactions, and particle velocity. This paper presents a protocol to monitor in vivo processes in growing collateral arteries during arteriogenesis utilizing intravital imaging. The method described here is a reliable tool for dynamics measurement and offers a high-contrast analysis with minimal photo-cytotoxicity, provided by multiphoton excitation microscopy. Prior to analyzing growing collateral arteries, arteriogenesis was induced in the adductor muscle of mice by unilateral ligation of the femoral artery.
After the ligation, the preexisting collateral arteries started to grow due to increased shear stress. Twenty-four hours after surgery, the skin and subcutaneous fat above the collateral arteries were removed, constructing a pocket for further analyses. To visualize blood flow and immune cells during in vivo imaging, CD41-fluorescein isothiocyanate (FITC) (platelets) and CD45-phycoerythrin (PE) (leukocytes) antibodies were injected intravenously (i.v.) via a catheter placed in the tail vein of a mouse. This article introduces intravital multiphoton imaging as an alternative or in vivo complementation to the commonly used static ex vivo (immuno-) histological analyses to study processes relevant for arteriogenesis. In summary, this paper describes a novel and dynamic in vivo method to investigate immune cell trafficking, blood flow, and shear stress in a hindlimb model of arteriogenesis, which enhances evaluation possibilities notably.

The recruitment of leukocytes and platelets constitutes an essential component necessary for the effective growth of collateral arteries during arteriogenesis. Multiphoton microscopy is an efficient tool for tracking cell dynamics with high spatio-temporal resolution in vivo and less photo-toxicity to study leukocyte recruitment and extravasation during arteriogenesis.

Imagem Intravital Multifóton para Monitoramento do Recrutamento de Leucócitos durante a Arteriogênese em Modelo de Membro Posterior Murino

Arteriogenesis strongly depends on leukocyte and platelet recruitment to the perivascular space of growing collateral vessels. The standard approach for ...