Les auteurs ont apprécié les contributions de Greg Smith, Lisa Pomeranz, Matt Lyman, Marlies Eldridge, Halina Staniszewska Goraczniak, et des membres du laboratoire Enquist à peaufiner ce protocole.

1. Premier jour: Infection virale et la préparation des tampons <ol><li> Préparez des plats 5-10 (15 cm de diamètre) de cellules de culture tissulaire de l&#39;infection, par exemple cellules PK-15 pour le virus de la pseudo-rage (PRV) ou des cellules Vero pour l&#39;herpès simplex virus (HSV). </li><li> Lorsque les cellules sont de 95 - 100% de confluence, les infecter à un (MOI) de 5-10. Pour ce faire, inoculer chaque plaque en utilisant stock de virus dans un volume total de 4 ml par plaque, puis incuber les plaques pendant 1 heure à 37 ° C. Plaques rocheuses délicatement toutes les 15 minutes afin de s&#39;assurer que la monocouche de cellules reste entièrement recouvert par le virus de l&#39;inoculum. Pendant ce temps, faire chauffer le support pour la prochaine étape. </li><li> Après une heure d&#39;infection, aspirer inoculum viral à partir des plaques, ajouter 15 ml de milieu chaud, et incuber à 37 ° C pendant 12-20 heures dans un incubateur humidifié. </li><li> Préparation des tampons LCM (voir tableau 1) et le rock toute la nuit à 4 ° C pour un mélange uniforme. Préparer TNE pour la remise en suspension de l&#39;ADN viral (voir tableau 2). </li></ol> 2. Second Jour, Phase 1: la lyse cellulaire et ultracentrifugation <ol><li> Vérifier visuellement que l&#39;infection des cellules a causé uniforme effet cytopathogène (ECP). Permettre à l&#39;infection de progresser jusqu&#39;à ce que toutes les cellules ont arrondi vers le haut, mais n&#39;ont pas soulevé de la plaque. </li><li> Racler les cellules infectées dans le milieu, et de combiner des cellules et du milieu dans des tubes coniques de 50 ml. Le nombre de tubes coniques nécessaires pour cette étape dépendra du nombre de plats utilisés pour l&#39;infection à l&#39;étape 1.2 ci-dessus, par exemple un tube conique de 50 ml peut être utilisée pour obtenir un culot d&#39;un maximum de 3 plats de 15 ml de milieu de chaque option:. Rincer le plaques avec 10 ml de PBS et se combinent avec les cellules et le milieu. </li><li> Centrifuger les cellules et le milieu pendant 10 minutes à 2000 centifugal vigueur relative (fcr) à température ambiante, puis aspirer le surnageant et remettre en suspension chaque culot dans 10 ml de PBS. Si le culot d&#39;une infection virale a été étendue en de multiples tubes coniques à l&#39;étape 2.2, ceux-ci peuvent être recombinés dans un tube conique à ce step. Répétez centrifugation et aspiration en option:. Cette pastille peut être conservé à -20 ° C et le protocole poursuivie à une date ultérieure. </li></ol> 3. Deuxième jour, Phase 2: Ultracentrifugation Gardez le culot cellulaire et tampons LCM sur la glace chaque fois que possible pendant les étapes suivantes. <ol><li> Ajouter β-mercaptoéthanol à 0% de glycérol - mémoire tampon LCM. Commencez le refroidissement de la ultracentrifugeuse (pour l&#39;étape 3.9 ci-dessous) en la fixant à 4 ° C et tournant sur le vide. </li><li> Remettre en suspension le culot cellulaire dans 5 ml de glycérol 0% - mémoire tampon LCM jusqu&#39;à ce qu&#39;il ne soit plus touffue. Si nécessaire, le tube vortex de briser n&#39;importe quelle cellule non dissous granulés. </li><li> Extraire en ajoutant 1,5 ml fréon (1,1,2-trichloro-1 ,2,2-trifluoroéthane) et vortex vigoureusement. Immédiatement centrifuger pendant 10 min à 2000 rcf à une température de 4 ° C. Recueillir la couche supérieure avec une pointe de pipette de gros calibre (en évitant l&#39;interface) et transférer dans un nouveau tube. Optionnel: Si la pastille est un solide gélatineux, vous pouvez verser rapidement la couche supérieure dans un nouveau tube. </li><li> Répéter l&#39;extraction fréon et centrifuger à nouveau. </li><li> Recueillir la couche supérieure (~ 5 ml) et transférer dans un tube d&#39;ultracentrifugation polyallomère nouvelle. Ajouter β-mercaptoéthanol au glycérol deux autres - tampons LCM. </li><li> Préparer un dégradé dans le tube à centrifuger polyallomère par sous-jacente de l&#39;extrait Fréon (couche supérieure) avec 3 ml de glycérol à 5% - LCM (couche intermédiaire), puis sous-jacente à nouveau avec 2,5 ml de glycérol 45% - LCM (couche inférieure). Utiliser une pipette fine pour éviter le débordement du contenu du tube. </li><li> Si nécessaire, préparez un tube d&#39;équilibrage équivalente en utilisant les mêmes proportions de tampons LCM. </li><li> Transfert des tubes dans des seaux ultracentrifugation. Solde seaux à 0,1 g de l&#39;autre, en ajoutant doucement supplémentaire glycérol 0% - mémoire tampon LCM à la couche supérieure (~ 50-100 ul à la fois). </li><li> En utilisant une ultracentrifugeuse froid avec une roto godet horizontal ou oscillantr, tourner les échantillons équilibrés pendant 1 heure à 77.000 fcr (par exemple 25.000 rpm pour un rotor SW41Ti) à une température de 4 ° C. </li><li> Au cours de l&#39;ultracentrifugation, faire un crochet verre pour capturer l&#39;ADN flottant à l&#39;étape de précipitation à l&#39;éthanol (4.6). Tenez les deux extrémités d&#39;une pipette Pasteur en verre et de suspendre la partie médiane dessus d&#39;une flamme. Quand une section de verre est presque fondu, tirez doucement pour étirer le verre, l&#39;incliner légèrement pour créer un crochet à angle serré (&lt;90 degrés), et tirez fermement pour sceller la fin. Si la pointe de l&#39;hameçon en verre est ouvert, maintenez la pointe sur la flamme pour que le verre se fond assez pour la refermer. </li><li> Après l&#39;ultracentrifugation, vous devriez voir une mince opaque à granulés avec une tache sombre au milieu. Soigneusement aspirer le liquide du tube, y compris coulures sur les côtés, mais en évitant le culot au fond du tube. </li><li> Ajouter 0,5 ml TNE à la température ambiante. </li><li> Laissez le culot reposer pendant au moins 10 minutes pour permettre l&#39;hydratation de la pastille. Optionnel: Le culot peut aussi remettre en suspension dans du TNE du jour au lendemain, si elles sont conservées à 4 ° C. </li></ol> 4. Troisième jour: Précipitations ADN &quot;Ghost&quot; <ol><li> Brisez le culot par pipetage avec une pointe de petit calibre pipette (par exemple une pointe de pipette p200). Ne vous inquiétez pas à propos de cisaillement au niveau de cette étape, parce que l&#39;ADN viral est encore contenue dans des capsides à ce stade. Ajouter les réactifs suivants dans le tube contenant le culot viral, à la température ambiante, à détruire capsides: <ul><li> 4,25 ml TNE </li><li> 0,25 ml SDS à 10% </li><li> 2 mg protéinase K </li></ul> Secouez délicatement pour mélanger ces réactifs. Il devrait y avoir une légère augmentation de la viscosité. </li></ol> Méfiez-vous de cisaillement à partir d&#39;ici, par exemple, utiliser des pipettes de gros calibre et de ne pas vortexer le matériel viral <ol start="2"><li> Extraire des protéines virales en ajoutant 5 ml de phénol-chloroforme et commencer immédiatement inverser ou vortex de maintenir une émulsion. Mélanger pendant 10 secondes, puis centrifugerl&#39;émulsion pendant 5 minutes à 2000 rcf à la température ambiante. Recueillir la couche supérieure avec une pointe de pipette de gros calibre, en évitant l&#39;interface et le transfert dans un nouveau tube en option:. Utilisation verrouillage de phase gel (PLG) tubes de cette étape pour éviter la contamination de l&#39;interface. </li><li> Répéter l&#39;extraction phénol-chloroforme et centrifuger à nouveau. </li><li> Après la seconde extraction au phénol-chloroforme, recueillir la couche supérieure dans un tube de 30 ml en verre Corex et refroidir le tube à -20 ° C pendant 10-15 minutes, en prenant soin qu&#39;il ne gèle pas. </li><li> Ajouter 10 ml d&#39;éthanol glacé, recouvrir le tube (par exemple en étirant un morceau de parafilm M sur le dessus), et mélanger par inversion immédiatement. Surveillez un ADN &quot;fantôme&quot; d&#39;apparaître, qui se compose d&#39;un précipité visqueux mince. Inverser le tube doucement pour mélanger encore et provoquer l&#39;ADN précipite collant à se regrouper. </li><li> Utiliser un crochet pour saisir le verre fantôme ADN (s). Soigneusement effacer l&#39;ADN pour enlever l&#39;excès de liquide, puis placez le crochet (pointe vers le bas)dans un tube de 1,5 ml et laisser sécher. Ajouter 0,25 - 0,5 ml de TE pour dissoudre le fantôme d&#39;ADN. Permettre la remise en suspension de l&#39;ADN se dérouler pendant au moins une heure. L&#39;ADN se conserve à 4 ° C. Facultatif: Pour maximiser le rendement de l&#39;ADN, brisez le crochet de verre dans le tube de 1,5 ml, de sorte que la remise en suspension au large des fragments de verre peuvent continuer au fil du temps. </li></ol> 5. Les résultats représentatifs Avec une grande suffisamment MOI, les cellules doivent atteindre la pleine CPE dans les ~ 18 heures après l&#39;infection (hpi) pour les souches de PRV de type sauvage, et ~ 24 hpi pour type sauvage des souches de HSV-1 (figure 1). Une fois la cellule infectée culot est récolté, les étapes restantes du protocole ne peut être complète en un seul jour long ou réalisé sur deux jours (Figure 2). Lors de la préparation des crochets en verre pour capturer le fantôme d&#39;ADN, il est important de faire l&#39;angle d&#39;attaque inférieur à 90 degrés, de sorte que plus tard, il peut s&#39;adapter à la base d&#39;un tube de 1,5 ml (figure 3). Scelle la pointe de ce crochet empêche la perte de l&#39;ADN danscôté de la pipette. Fantômes d&#39;ADN se former pendant l&#39;étape de précipitation et apparaîtra comme blancs, les discussions filant (figure 4). Ces granulats et le bâton à l&#39;autre et / ou le crochet de verre utilisée pour capturer l&#39;ADN. Ainsi, le crochet même verre peuvent être utilisés pour rassembler plusieurs threads d&#39;ADN à partir de la solution de précipitation. <table border="1"><tbody><tr><td> Choisir la colonne en fonction du volume désiré: </td><td> 10 ml </td><td> 15 ml </td><td> 20 ml </td><td> 40 ml </td></tr><tr><td> 1M KCl </td><td> 1,3 ml </td><td> 1,9 ml </td><td> 2,5 ml </td><td> 5 ml </td></tr><tr><td> 1M Tris (pH 7,4) </td><td> 300 pl </td><td> 450 ul </td><td> 600 pi </td><td> 1,2 ml </td></tr><tr><td> 1M MgCl 2 </td><td> 50 pi </td><td> 75 pi </td><td> 100 pi </td><td> 200 pi </td></tr><tr><td> 0,5 EDTA </td><td&gt; 10 pl </td><td> 15 pi </td><td> 20 pi </td><td> 40 pi </td></tr><tr><td> NP40/IGEPAL </td><td> 50 pi </td><td> 75 pi </td><td> 100 pi </td><td> 200 pi </td></tr><tr><td> β-mercaptoéthanol (ajouter immédiatement avant utilisation) </td><td> 4,3 pl </td><td> 6,5 pl </td><td> 8,6 pl </td><td> 17,2 ul </td></tr><tr><td colspan="5"></td></tr><tr><td colspan="5"> Utiliser des proportions pour le glycérol pour cent désirée (0, 5, ou 45%) </td></tr><tr><td> 0% de glycérol </td><td> Aucun </td><td> Aucun </td><td> Aucun </td><td> Aucun </td></tr><tr><td> eau </td><td> 8,3 ml </td><td> 12,5 ml </td><td> 16,7 ml </td><td> 33,4 ml </td></tr><tr><td> Glycérol à 5% </td><td> 0,5 ml </td><td> 0,8 ml </td><td> 1,0 ml </td><td> 2,0 ml </td></tr><tr><td> eau </td><td> 7,8 ml </td><td> 11,7 ml </td><td> 15,7 ml </td><td> 31,4 ml </td></tr><tr><td> G 45%lycerol </td><td> 4,5 ml </td><td> 6,8 ml </td><td> 9,0 ml </td><td> 18,0 ml </td></tr><tr><td> eau </td><td> 3,8 ml </td><td> 5,7 ml </td><td> 7,7 ml </td><td> 15,4 ml </td></tr></tbody></table> Tableau 1. Recettes pour la préparation de tampons LCM <table border="1"><tbody><tr><td> Pour un volume de 50 ml </td></tr><tr><td> 5 ml de NaCl 1M </td></tr><tr><td> 2,5 ml Tris 1 M, pH 7,5 </td></tr><tr><td> 1 ml d&#39;EDTA 0,5 </td></tr><tr><td> 41,5 ml de H 2 O </td></tr></tbody></table> Tableau 2. Préparation de TNE (0,1 M de NaCl, 50 mM de Tris, pH 7,5, EDTA 10 mM) <table border="1"><tbody><tr><td> Pour 1 litres </td></tr><tr><td> 0,2 g de KCl </td></tr><tr><td> 0,2 g KH 2 PO 4 </td></tr><tr><td> 8 g de NaCl </td></tr><tr><td> 1,15 g de Na 2 HPO 4 </td&gt; </tr><tr><td> H 2 O à 1L </td></tr></tbody></table> Tableau 3. Préparation de PBS (2,7 mM KCl, 1,5 mM KH 2 PO 4; 137 mM NaCl; 8,1 mM Na 2 HPO 4, pH 7,0) <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/3151/3151fig1.jpg" /> Figure 1. PK15 cellules (A) avant l&#39;infection, (B) à mi-chemin à travers l&#39;infection, et (C) à l&#39;effet cytopathogène (CPE), après une multiplicité d&#39;infection. <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/3151/3151fig2.jpg" /> Figure 2. Vue d&#39;ensemble du protocole. <img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/3151/3151fig3.jpg" /> Figure 3. Trois exemples représentatifs de verre crochets utilisés pour recueillir les fantômes d&#39;ADN viral. <img alt="Figure 4" src="/files/ftp_upload/3151/3151fig4.jpg" /> Figure 4. Exemple représentatif d&#39;un ADN &quot;fantôme&quot; bien formé et abondante.

<ol>
	<li>Szpara, M. L., Parsons, L., Enquist, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequence+variability+in+clinical+and+laboratory+isolates+of+herpes+simplex+virus+1+reveals+new+mutations.">Sequence variability in clinical and laboratory isolates of herpes simplex virus 1 reveals new mutations.</a> J Virol. 84, 5303-5313 (2010).</li><li>Banfield, B. W., Kaufman, J. D., Randall, J. A., Pickard, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+pseudorabies+virus+strains+expressing+red+fluorescent+proteins:+new+tools+for+multisynaptic+labeling+applications.">Development of pseudorabies virus strains expressing red fluorescent proteins: new tools for multisynaptic labeling applications.</a> J Virol. 77, 10106-10112 (2003).</li><li>Kobiler, O., Lipman, Y., Therkelsen, K., Daubechies, I., Enquist, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Herpesviruses+carrying+a+Brainbow+cassette+reveal+replication+and+expression+of+limited+numbers+of+incoming+genomes.">Herpesviruses carrying a Brainbow cassette reveal replication and expression of limited numbers of incoming genomes.</a> Nat Commun. 1, 146-146 (2010).</li><li>Enquist, L. W., Madden, M. J., Schiop-Stanley, P., Vande Woude, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cloning+of+herpes+simplex+type+1+DNA+fragments+in+a+bacteriophage+lambda+vector.">Cloning of herpes simplex type 1 DNA fragments in a bacteriophage lambda vector.</a> Science. 203, 541-544 (1979).</li><li>Smith, G. A., Enquist, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Construction+and+transposon+mutagenesis+in+Escherichia+coli+of+a+full-length+infectious+clone+of+pseudorabies+virus,+an+alphaherpesvirus.">Construction and transposon mutagenesis in Escherichia coli of a full-length infectious clone of pseudorabies virus, an alphaherpesvirus.</a> J Virol. 73, 6405-6414 (1999).</li><li>Flint, S. J., Enquist, L. W., Racaniello, V. R., Skalka, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Principles of virology. , (2008).</li><li>Pomeranz, L. E., Reynolds, A. E., Hengartner, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+biology+of+pseudorabies+virus:+impact+on+neurovirology+and+veterinary+medicine.">Molecular biology of pseudorabies virus: impact on neurovirology and veterinary medicine.</a> Microbiol Mol Biol Rev. 69, 462-500 (2005).</li><li>Roizman, B., Pellett, P. E., Knipe, D. M., Howley, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Fields Virology. , 2381-2397 (2001).</li><li>Mendez, I. I., Hermann, L. L., Hazelton, P. R., Coombs, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparative+analysis+of+freon+substitutes+in+the+purification+of+reovirus+and+calicivirus.">A comparative analysis of freon substitutes in the purification of reovirus and calicivirus.</a> J Virol Methods. 90, 59-67 (2000).</li><li>Gharabaghi, F., Aymard, M., Trotemann, P., Gerdil, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+and+simplified+micromethod+for+subtyping+varicella-zoster+virus.">A rapid and simplified micromethod for subtyping varicella-zoster virus.</a> J Med Virol. 31, 129-134 (1990).</li><li>Granstedt, A. E., Szpara, M. L., Kuhn, B., Wang, S. S., Enquist, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence-based+monitoring+of+in+vivo+neural+activity+using+a+circuit-tracing+pseudorabies+virus.">Fluorescence-based monitoring of in vivo neural activity using a circuit-tracing pseudorabies virus.</a> PLoS One. 4, e6923-e6923 (2009).</li></ol>

Aucun conflit d&#39;intérêt déclaré.

Certaines parties de ce protocole ont été initialement développées pour l&#39;isolement d&#39;ADN viral dans des conditions de biosécurité L4, mais elle s&#39;adapte aussi bien aux non-BSL conditions. 4 Nous communément utiliser ce protocole pour isoler l&#39;ADN du PRV alpha-herpèsvirus et le HSV-1, qui possèdent des génomes d&#39;ADN enfermé dans une capside protéique et entouré par une enveloppe lipidique. 7,8 Cependant, il est probable directement adaptable à d&#39;autres virus à...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom du réactif </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td><td> Commentaires </td></tr><tr><td> Fréon (1,1,2-trichloro-1 ,2,2-trifluoroéthane) </td><td> Pêcheur </td><td> T178-4 </td><td> Vérifiez auprès de votre institution pour les directives concernant l&#39;élimination appropriée des déchets contenant du fréon, ou de voir Mendez et al. des solutions de rechange potentielles Fréon 9. </td></tr><tr><td> Tubes à verrouillage de phase gel, lourd capacité 15ml </td><td> 5 PRIME </td><td> 2302850 </td><td> En option </td></tr><tr><td> Tubes ultracentrifugation polyallomère </td><td> Beckman * </td><td> 331372 * </td><td> * Sélectionnez tubes appropriés pour votre propre ultracentrifugeuse; ceux-ci sont inclus à titre d&#39;exemple </td></tr><tr><td> NP-40 / IGEPAL </td><td> Sigma </td><td> Je-3021 </td><td></td></tr><tr><td> Cellules PK-15 </td><td> ATCC </td><td> CCL-33 </td><td></td></tr><tr><td> Les cellules Vero </td><td> ATCC </td><td> CCL-81 </td><td></td></tr><tr><td> PBS </td><td> HyClone </td><td> SH30028.03 </td><td></td></tr></tbody></table>

preparation of viral dna from nucleocapsids

Les virus sont des parasites cellulaires, et donc l&#39;étude de leur ADN nécessite un matériau isolant virale loin de contaminants de la cellule hôte et de l&#39;ADN. Plusieurs applications en aval nécessitent de grandes quantités d&#39;ADN viral pur, qui est prévue par le présent protocole. Ces applications comprennent le séquençage du génome viral, où la suppression de l&#39;ADN hôte est cruciale pour optimiser la production de données pour les séquences virales, et la production de nouvelles souches virales recombinantes, où la co-transfection de plasmide purifié et linéaire d&#39;ADN viral facilite la recombinaison. 1,2, 3 Cette procédure utilise une combinaison d&#39;extractions et de densité à base de centrifugation afin d&#39;isoler l&#39;ADN purifié herpèsvirus linéaire nucléocapside à partir de cellules infectées. 4,5 Les premières étapes de purification pour but d&#39;isoler capsides virales purifiées, qui contient et protège l&#39;ADN viral au cours de l&#39;extraction et les étapes de centrifugation qui éliminent les protéines cellulaires et l&#39;ADN. Lyse des nucleocapsides libère alors l&#39;ADN viral, et deux finales de phénol-chloroforme étapes éliminer les protéines restantes. L&#39;ADN capturé finale de la solution est très concentré et pur, avec une moyenne DO 260/280 de 1,90. En fonction de la quantité de cellules infectées utilisées, les rendements de l&#39;ADN viral gamme de 150 à 800 mg ou plus. La pureté de cet ADN, il est stable pendant un stockage prolongé à 4 ° C. Cet ADN est donc parfaitement adapté pour séquençage à haut débit, haute fidélité réactions PCR, et transfections. Avant de commencer le protocole, il est important de connaître le nombre moyen de cellules par boîte (par exemple, une moyenne de 8 x 10 6 cellules PK-15 confluentes dans un plat de 15 cm), et le titre du stock viral à utiliser ( par exemple 1 x 10 8 unités formant des plages par ml). Ceux-ci sont nécessaires pour calculer la multiplicité appropriée d&#39;infection (MOI) pour le protocole. 6 Par exemple, pour infecter une de 15 cm plat de cellules PK-15 avec le stock au-dessus virale, àune MOI de 5, vous pouvez utiliser 400 ul de stock viral et le diluer avec 3,6 ml de milieu (volume inoculation total de 4 ml pour une plaque de 15 cm). Plusieurs préparations d&#39;ADN viraux peuvent être préparés en même temps. Le nombre de préparations simultanées n&#39;est limité que par le nombre de tubes détenus par le rotor ultracentrifugeuse (un par le virus; voir l&#39;étape 3.9 ci-dessous). Nous décrivons ici la procédure comme si elle était faite pour un virus.

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Preparation of Viral DNA from Nucleocapsids

Nous décrivons le processus d&#39;isolation de haute pureté nucléocapside herpèsvirus ADN à partir de cellules infectées. L&#39;ADN capturé finale de la solution est de forte concentration et de pureté, qui le rend idéal pour séquençage à haut débit, haute fidélité réactions PCR, et transfections pour produire de nouveaux virus recombinants.

Préparation de l&#39;ADN viral à partir des nucléocapsides

Viruses are obligate cellular parasites, and thus the study of their DNA requires isolating viral material away from host cell contaminants and DNA. ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

20.8K vues.  Princeton University. Nous décrivons le processus d'isolation de haute pureté nucléocapside herpèsvirus ADN à partir de cellules infectées. L'ADN capturé finale de la solution est de forte concentration et de pureté, qui le rend idéal pour séquençage à haut débit, haute fidélité réactions PCR, et transfections pour produire de nouveaux virus recombinants.

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Generation of Recombinant Influenza Virus from Plasmid DNA

Efforts by a number of influenza research groups have been pivotal in the development and improvement of influenza A virus reverse genetics. Originally established in 1999 1,2 plasmid-based reverse genetic techniques to generate recombinant viruses have revolutionized the influenza research field because specific questions have been answered by genetically engineered, infectious, recombinant influenza viruses. Such studies include virus replication, function of viral proteins, the contribution of specific mutations in viral proteins in viral replication and/or pathogenesis and, also, viral vectors using recombinant influenza viruses expressing foreign proteins 3.

Rescue of influenza A viruses from plasmid DNA is a basic and essential experimental technique that allows influenza researchers to generate recombinant viruses to study multiple aspects in the biology of influenza virus, and to be used as potential vectors or vaccines.

Génération de virus recombinants de la grippe des ADN plasmidique

Efforts by a number of influenza research groups have been pivotal in the development and improvement of influenza A virus reverse genetics. Originally ...

Recherche

Immunologie et infection

Using a Pan-Viral Microarray Assay (Virochip) to Screen Clinical Samples for Viral Pathogens

The diagnosis of viral causes of many infectious diseases is difficult due to the inherent sequence diversity of viruses as well as the ongoing emergence of novel viral pathogens, such as SARS coronavirus and 2009 pandemic H1N1 influenza virus, that are not detectable by traditional methods. To address these challenges, we have previously developed and validated a pan-viral microarray platform called the Virochip with the capacity to detect all known viruses as well as novel variants on the basis of conserved sequence homology1. Using the Virochip, we have identified the full spectrum of viruses associated with respiratory infections, including cases of unexplained critical illness in hospitalized patients, with a sensitivity equivalent to or superior to conventional clinical testing2-5. The Virochip has also been used to identify novel viruses, including the SARS coronavirus6,7, a novel rhinovirus clade5, XMRV (a retrovirus linked to prostate cancer)8, avian bornavirus (the cause of a wasting disease in parrots)9, and a novel cardiovirus in children with respiratory and diarrheal illness10. The current version of the Virochip has been ported to an Agilent microarray platform and consists of ~36,000 probes derived from over ~1,500 viruses in GenBank as of December of 2009. Here we demonstrate the steps involved in processing a Virochip assay from start to finish (~24 hour turnaround time), including sample nucleic acid extraction, PCR amplification using random primers, fluorescent dye incorporation, and microarray hybridization, scanning, and analysis.

Using a Pan-Viral Microarray Assay Virochip to Screen Clinical Samples for Viral Pathogens

The Virochip is a pan-viral microarray designed to simultaneously detect all known viruses as well as novel viruses on the basis of conserved sequence homology. Here we demonstrate how to run a Virochip assay to analyze clinical samples for the presence of both known and unknown viruses.

En utilisant un dosage Microarray pan-virale (Virochip) pour cribler des échantillons cliniques pour les pathogènes viraux

The diagnosis of viral causes of many infectious diseases is difficult due to the inherent sequence diversity of viruses as well as the ongoing emergence ...

Isolation of Fidelity Variants of RNA Viruses and Characterization of Virus Mutation Frequency

RNA viruses use RNA dependent RNA polymerases to replicate their genomes. The intrinsically high error rate of these enzymes is a large contributor to the generation of extreme population diversity that facilitates virus adaptation and evolution. Increasing evidence shows that the intrinsic error rates, and the resulting mutation frequencies, of RNA viruses can be modulated by subtle amino acid changes to the viral polymerase. Although biochemical assays exist for some viral RNA polymerases that permit quantitative measure of incorporation fidelity, here we describe a simple method of measuring mutation frequencies of RNA viruses that has proven to be as accurate as biochemical approaches in identifying fidelity altering mutations. The approach uses conventional virological and sequencing techniques that can be performed in most biology laboratories. Based on our experience with a number of different viruses, we have identified the key steps that must be optimized to increase the likelihood of isolating fidelity variants and generating data of statistical significance. The isolation and characterization of fidelity altering mutations can provide new insights into polymerase structure and function1-3. Furthermore, these fidelity variants can be useful tools in characterizing mechanisms of virus adaptation and evolution4-7.

The present article describes the steps required to isolate and characterize RNA polymerase fidelity variants of RNA viruses and how to use mutation frequency data to confirm fidelity changes in tissue culture.

Isolement des variantes des virus à ARN de Fidelity et caractérisation de la fréquence de mutation de virus

RNA viruses use RNA dependent RNA polymerases to replicate their genomes. The intrinsically high error rate of these enzymes is a large contributor to the ...

Separation of Single-stranded DNA, Double-stranded DNA and RNA from an Environmental Viral Community Using Hydroxyapatite Chromatography

Viruses, particularly bacteriophages (phages), are the most numerous biological entities on Earth1,2. Viruses modulate host cell abundance and diversity, contribute to the cycling of nutrients, alter host cell phenotype, and influence the evolution of both host cell and viral communities through the lateral transfer of genes 3. Numerous studies have highlighted the staggering genetic diversity of viruses and their functional potential in a variety of natural environments. 
Metagenomic techniques have been used to study the taxonomic diversity and functional potential of complex viral assemblages whose members contain single-stranded DNA (ssDNA), double-stranded DNA (dsDNA) and RNA genotypes 4-9. Current library construction protocols used to study environmental DNA-containing or RNA-containing viruses require an initial nuclease treatment in order to remove nontargeted templates 10. However, a comprehensive understanding of the collective gene complement of the virus community and virus diversity requires knowledge of all members regardless of genome composition. Fractionation of purified nucleic acid subtypes provides an effective mechanism by which to study viral assemblages without sacrificing a subset of the community&#x2019;s genetic signature. 
Hydroxyapatite, a crystalline form of calcium phosphate, has been employed in the separation of nucleic acids, as well as proteins and microbes, since the 1960s11. By exploiting the charge interaction between the positively-charged Ca2+ ions of the hydroxyapatite and the negatively charged phosphate backbone of the nucleic acid subtypes, it is possible to preferentially elute each nucleic acid subtype independent of the others. We recently employed this strategy to independently fractionate the genomes of ssDNA, dsDNA and RNA-containing viruses in preparation of DNA sequencing 12. Here, we present a method for the fractionation and recovery of ssDNA, dsDNA and RNA viral nucleic acids from mixed viral assemblages using hydroxyapatite chromotography.

We describe an efficient method to separate single-stranded DNA, double-stranded DNA and RNA molecules from environmental viral communities. Nucleic acids are fractionated using hydroxyapatite chromatography with increasing concentrations of phosphate-containing buffers. This method permits the isolation of all viral nucleic acid types from environmental samples.

Séparation de l&#39;ADN simple brin, double brin de l&#39;ADN et l&#39;ARN à partir d&#39;un environnement communautaire viral en utilisant chromatographie d&#39;hydroxyapatite

Viruses, particularly bacteriophages (phages), are the most numerous biological entities on Earth1,2.  Viruses modulate host cell abundance and diversity, ...

A Simple Chelex Protocol for DNA Extraction from Anopheles spp.

Endemic countries are increasingly adopting molecular tools for efficient typing, identification and surveillance against malaria parasites and vector mosquitoes, as an integral part of their control programs1,2,3,4,5. For sustainable establishment of these accurate approaches in operations research to strengthen malaria control and elimination efforts, simple and affordable methods, with parsimonious reagent and equipment requirements are essential6,7,8. Here we present a simple Chelex-based technique for extracting malaria parasite and vector DNA from field collected mosquito specimens.
We morphologically identified 72 Anopheles gambiae sl. from 156 mosquitoes captured by pyrethrum spray catches in sleeping rooms of households within a 2,000 km2 vicinity of the Malaria Institute at Macha. After dissection to separate the head and thorax from the abdomen for all 72 Anopheles gambiae sl. mosquitoes, the two sections were individually placed in 1.5 ml microcentrifuge tubes and submerged in 20 &mu;l of deionized water. Using a sterile pipette tip, each mosquito section was separately homogenized to a uniform suspension in the deionized water. Of the ensuing homogenate from each mosquito section, 10 &mu;l was retained while the other 10 &mu;l was transferred to a separate autoclaved 1.5 ml tube. The separate aliquots were subjected to DNA extraction by either the simplified Chelex or the standard salting out extraction protocol9,10. The salting out protocol is so-called and widely used because it employs high salt concentrations in lieu of hazardous organic solvents (such as phenol and chloroform) for the protein precipitation step during DNA extraction9.
Extracts were used as templates for PCR amplification using primers targeting arthropod mitochondrial nicotinamide adenine dinucleotide dehydrogenase (NADH) subunit 4 gene (ND4) to check DNA quality11, a PCR for identification of Anopheles gambiae sibling species10 and a nested PCR for typing of Plasmodium falciparum infection12. Comparison using DNA quality (ND4) PCR showed 93% sensitivity and 82% specificity for the Chelex approach relative to the established salting out protocol. Corresponding values of sensitivity and specificity were 100% and 78%, respectively, using sibling species identification PCR and 92% and 80%, respectively for P. falciparum detection PCR. There were no significant differences in proportion of samples giving amplicon signal with the Chelex or the regular salting out protocol across all three PCR applications. The Chelex approach required three simple reagents and 37 min to complete, while the salting out protocol entailed 10 different reagents and 2 hr and 47 min' processing time, including an overnight step. Our results show that the Chelex method is comparable to the existing salting out extraction and can be substituted as a simple and sustainable approach in resource-limited settings where a constant reagent supply chain is often difficult to maintain.

A Simple Chelex Protocol for DNA Extraction from Anopheles spp.

A rapid and affordable way to extract quality malaria parasite and vector DNA from mosquito specimens is described. Capitalizing on chelating properties of Chelex resin, the simple method enables genotyping of malaria parasites in mosquito mid-gut and salivary gland phases, as well as molecular identification of the Anopheles sibling species by PCR.

Un protocole Chelex simple pour l&#39;extraction d&#39;ADN à partir de<em&gt; Anopheles</em&gt; Spp.

Endemic countries are increasingly adopting molecular tools for  efficient typing, identification and surveillance against malaria parasites and  vector ...

Establishing a Liquid-covered Culture of Polarized Human Airway Epithelial Calu-3 Cells to Study Host Cell Response to Respiratory Pathogens In vitro

The apical and basolateral surfaces of airway epithelial cells demonstrate directional responses to pathogen exposure in vivo. Thus, ideal in vitro models for examining cellular responses to respiratory pathogens polarize, forming apical and basolateral surfaces. One such model is differentiated normal human bronchial epithelial cells (NHBE). However, this system requires lung tissue samples, expertise isolating and culturing epithelial cells from tissue, and time to generate an air-liquid interface culture.
Calu-3 cells, derived from a human bronchial adenocarcinoma, are an alternative model for examining the response of proximal airway epithelial cells to respiratory insult1, pharmacological compounds2-6, and bacterial7-9 and viral pathogens, including influenza virus, rhinovirus and severe acute respiratory syndrome - associated coronavirus10-14. Recently, we demonstrated that Calu-3 cells are susceptible to respiratory syncytial virus (RSV) infection in a manner consistent with NHBE15,16 . Here, we detail the establishment of a polarized, liquid-covered culture (LCC) of Calu-3 cells, focusing on the technical details of growing and culturing Calu-3 cells, maintaining cells that have been cultured into LCC, and we present the method for performing respiratory virus infection of polarized Calu-3 cells.
To consistently obtain polarized Calu-3 LCC, Calu-3 cells must be carefully subcultured before culturing in Transwell inserts. Calu-3 monolayer cultures should remain below 90% confluence, should be subcultured fewer than 10 times from frozen stock, and should regularly be supplied with fresh medium. Once cultured in Transwells, Calu-3 LCC must be handled with care. Irregular media changes and mechanical or physical disruption of the cell layers or plates negatively impact polarization for several hours or days. Polarization is monitored by evaluating trans-epithelial electrical resistance (TEER) and is verified by evaluating the passive equilibration of sodium fluorescein between the apical and basolateral compartments17,18 . Once TEER plateaus at or above 1,000 &Omega;&times;cm2, Calu-3 LCC are ready to use to examine cellular responses to respiratory pathogens.

Establishing a Liquid-covered Culture of Polarized Human Airway Epithelial Calu-3 Cells to Study Host Cell Response to Respiratory Pathogens In vitro

The findings and conclusions in this report are those of the authors and do not necessarily represent the views of the Centers for Disease Control and Prevention.

L&#39;établissement d&#39;une culture liquide recouvert de Airway humaines épithéliales polarisées cellules Calu-3 pour étudier la réponse cellulaire aux agents pathogènes respiratoires hôte<em&gt; In vitro</em

The  apical and basolateral surfaces of airway epithelial cells demonstrate  directional responses to pathogen exposure in  vivo. Thus, ideal in vitro ...

Establishment of an In vitro System to Study Intracellular Behavior of Candida glabrata in Human THP-1 Macrophages

A cell culture model system, if a close mimic of host environmental conditions, can serve as an inexpensive, reproducible and easily manipulatable alternative to animal model systems for the study of a specific step of microbial pathogen infection. A human monocytic cell line THP-1 which, upon phorbol ester treatment, is differentiated into macrophages, has previously been used to study virulence strategies of many intracellular pathogens including Mycobacterium tuberculosis. Here, we discuss a protocol to enact an in vitro cell culture model system using THP-1 macrophages to delineate the interaction of an opportunistic human yeast pathogen Candida glabrata with host phagocytic cells. This model system is simple, fast, amenable to high-throughput mutant screens, and requires no sophisticated equipment. A typical THP-1 macrophage infection experiment takes approximately 24 hr with an additional 24-48 hr to allow recovered intracellular yeast to grow on rich medium for colony forming unit-based viability analysis. Like other in vitro model systems, a possible limitation of this approach is difficulty in extrapolating the results obtained to a highly complex immune cell circuitry existing in the human host. However, despite this, the current protocol is very useful to elucidate the strategies that a fungal pathogen may employ to evade/counteract antimicrobial response and survive, adapt, and proliferate in the nutrient-poor environment of host immune cells.

Establishment of an In vitro System to Study Intracellular Behavior of Candida glabrata in Human THP-1 Macrophages

The current article outlines a protocol to establish an in vitro cell culture model system to study the interaction of a facultative intracellular human fungal pathogen Candida glabrata with human macrophages which will be a useful tool to advance our knowledge of fungal virulence mechanisms.

Mise en place d&#39;un<em&gt; In vitro</em&gt; Système d&#39;étudier le comportement intracellulaire de<em&gt; Candida glabrata</em&gt; En droits macrophages THP-1

A cell culture model system, if a close mimic of host environmental conditions, can serve as an inexpensive, reproducible and easily manipulatable ...

Averaging of Viral Envelope Glycoprotein Spikes from Electron Cryotomography Reconstructions using Jsubtomo

Enveloped viruses utilize membrane glycoproteins on their surface to mediate entry into host cells. Three-dimensional structural analysis of these glycoprotein &#8216;spikes&#8217; is often technically challenging but important for understanding viral pathogenesis and in drug design. Here, a protocol is presented for viral spike structure determination through computational averaging of electron cryo-tomography data. Electron cryo-tomography is a technique in electron microscopy used to derive three-dimensional tomographic volume reconstructions, or tomograms, of pleomorphic biological specimens such as membrane viruses in a near-native, frozen-hydrated state. These tomograms reveal structures of interest in three dimensions, albeit at low resolution. Computational averaging of sub-volumes, or sub-tomograms, is necessary to obtain higher resolution detail of repeating structural motifs, such as viral glycoprotein spikes. A detailed computational approach for aligning and averaging sub-tomograms using the Jsubtomo software package is outlined. This approach enables visualization of the structure of viral glycoprotein spikes to a resolution in the range of 20-40 &#197; and study of the study of higher order spike-to-spike interactions on the virion membrane. Typical results are presented for Bunyamwera virus, an enveloped virus from the family Bunyaviridae. This family is a structurally diverse group of pathogens posing a threat to human and animal health.

An approach is presented for determining structures of viral membrane glycoprotein complexes using a combination of electron cryo-tomography and sub-tomogram averaging with the computational package Jsubtomo.

Moyenne de la glycoprotéine d&#39;enveloppe virale Pointes de Electron Cryotomography reconstructions utilisant Jsubtomo

Enveloped viruses utilize membrane glycoproteins on their surface to mediate entry into host cells. Three-dimensional structural analysis of these ...

Isolation of Viral Replication Compartment-enriched Sub-nuclear Fractions from Adenovirus-infected Normal Human Cells

During infection of human cells by adenovirus (Ad), the host cell nucleus is dramatically reorganized, leading to formation of nuclear microenvironments through the recruitment of viral and cellular proteins to sites occupied by the viral genome. These sites, called replication compartments (RC), can be considered viral-induced nuclear domains where the viral genome is localized and viral and cellular proteins that participate in replication, transcription and post-transcriptional processing are recruited. Moreover, cellular proteins involved in the antiviral response, such as tumor suppressor proteins, DNA damage response (DDR) components and innate immune response factors are also co-opted to RC. Although RC seem to play a crucial role to promote an efficient and productive replication cycle, a detailed analysis of their composition and associated activities has not been made. To facilitate the study of adenoviral RC and potentially those from other DNA viruses that replicate in the cell nucleus, we adapted a simple procedure based on velocity gradients to isolate Ad RC and established a cell-free system amenable to conduct morphological, functional and compositional studies of these virus-induced subnuclear structures, as well as to study their impact on host-cell interactions.

We provide a novel strategy to isolate viral replication compartments (RC) from adenovirus (Ad)-infected human cells. This approach represents a cell-free system that can help to elucidate the molecular mechanisms regulating viral genome replication and expression as well as regulation of viral-host interactions established at the RC.

Isolation des fractions de sous-nucléaire réplication virale Compartiment enrichies d&#39;adénovirus-infectés cellules humaines normales

During infection of human cells by adenovirus (Ad), the host cell nucleus is dramatically reorganized, leading to formation of nuclear microenvironments ...

The Development of Lyophilized Loop-mediated Isothermal Amplification Reagents for the Detection of Coxiella burnetii

Coxiella burnetii, the agent causing Q fever, is an obligate intracellular bacterium. PCR based diagnostic assays have been developed for detecting C. burnetii DNA in cell cultures and clinical samples. PCR requires specialized equipment and extensive end user training, and therefore, it is not suitable for routine work especially in a resource-constrained area. We have developed a loop-mediated isothermal amplification (LAMP) assay to detect the presence of C. burnetii in patient samples. This method is performed at a single temperature around 60 &#176;C in a water bath or heating block. The sensitivity of this LAMP assay is very similar to PCR with a detection limit of about 25 copies per reaction. This report describes the preparation of the reaction using lyophilized reagents and visualization of results using hydroxynaphthol blue (HNB) or a UV lamp with fluorescent intercalating dye in the reaction. The LAMP reagents were lyophilized and stored at room temperature (RT) for one month without loss of detection sensitivity. This LAMP assay is particularly robust because the reaction mixture preparation does not involve complex steps. This method is ideal for use in resource-limited settings where Q fever is endemic.

The Development of Lyophilized Loop-mediated Isothermal Amplification Reagents for the Detection of Coxiella burnetii

We described here a simple loop-mediated isothermal amplification (LAMP) method using lyophilized reagents for the detection of C. burnetii in patient samples.

Le développement de lyophilisé boucle médiées isothermes Amplification Réactifs pour la détection des<em&gt; Coxiella burnetii</em

Coxiella burnetii, the agent causing Q fever, is an obligate intracellular bacterium. PCR based diagnostic assays have been developed for detecting C. ...