Die Finanzierung dieser Arbeit wurde vom Natural Sciences and Engineering Research Council von Kanada (NSERC) und der Sentinel Bioaktive Paper Network zur Verfügung gestellt.

<ol>
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A., Li, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+pH3DZ1+-+An+RNA-cleaving+deoxyribozyme+with+optimal+activity+at+pH+3.">Characterization of pH3DZ1 - An RNA-cleaving deoxyribozyme with optimal activity at pH 3.</a> Can. J. Chem. 85, 261-273 (2007).</li><li>Chiuman, W., Li, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+signaling+platforms+built+from+a+small+catalytic+DNA+and+doubly+labeled+fluorogenic+substrates.">Efficient signaling platforms built from a small catalytic DNA and doubly labeled fluorogenic substrates.</a> Nucleic Acids Res. 35, 401-405 (2007).</li><li>Chiuman, W., Li, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+fluorescent+sensors+engineered+with+catalytic+DNA+MgZ+based+on+a+non-classic+allosteric+design.">Simple fluorescent sensors engineered with catalytic DNA MgZ based on a non-classic allosteric design.</a> PLoS ONE. 2, e1224 (2007).</li><li>Shen, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Entrapment+of+fluorescence+signaling+DNA+enzymes+in+sol+gel-derived+materials+for+metal+ion+sensing.">Entrapment of fluorescence signaling DNA enzymes in sol gel-derived materials for metal ion sensing.</a> Anal. 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K., Li, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+selection+of+protein-binding+DNA+aptamers+as+ligands+for+biosensing+applications.">In vitro selection of protein-binding DNA aptamers as ligands for biosensing applications.</a> Methods Mol. Biol. 504, 399-415 (2009).</li><li>Ali, M. M., Li, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Colorimetric+sensing+by+using+allosteric-DNAzyme-coupled+rolling+circle+amplification+and+a+peptide+nucleic+acid-organic+dye+probe.">Colorimetric sensing by using allosteric-DNAzyme-coupled rolling circle amplification and a peptide nucleic acid-organic dye probe.</a> Angew. Chem. Int. Ed. 48, 3512-3515 (2009).</li></ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Die meisten der häufigsten bakteriellen Nachweismethoden sind heute entweder langsam (klassische mikrobielle) oder technisch anspruchsvolle (Antikörper, PCR). Daher glauben wir, dass die nächste Generation von Tools zur Erkennung sollte nach Schnelligkeit und Einfachheit gerecht zu werden. Zu diesem Zweck haben wir eine RNA-spaltende und Fluoreszenz-Signal DNAzym, mit dem einfache Assays zu entwickeln, um die Anwesenheit von Bakterien durch die Erzeugung eines Fluoreszenzsignals berichten kann geschaffen werden. Die vorgestellten DNAzym Sonde RFD-EC1, wird durch die CEM während das Wachstum von E. hergestellt aktiviert coli in Kulturmedien. Da unsere Methode verwendet Rohöl extrazellulären Mischungen aus einem Bakterium als Ziel der Erkennung und umgeht das mühsame Ziel Extraktion und Amplifikation Schritte, es verwendet werden kann die Einrichtung sehr einfach werden, &quot;Mix-and-read&quot;-Typ von Tests zur Erkennung bakterieller. Die Nutzung unserer DNAzym ist nicht auf fluoreszenzbasierten Verfahren beschränkt. Zum Beispiel, mit kolorimetrischen Nachweis der gleichen DNAzym System Assay cein entworfen mit einer Methode, die bereits früher berichtet Rolling-Circle-Amplifikation nutzt in Verbindung mit einem organischen Farbstoff werden. 32 Wir sehen den Einsatz von DNAzymen für Nachweis von Bakterien als attraktiver Weg zu neuen bakteriellen Biosensoren mit größerer Einfachheit im Betrieb zu generieren.

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenzes </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer oder Modell </td></tr><tr><td> Agar </td><td> BioShop Kanada </td><td> AGR003 </td></tr><tr><td> Ammoniumpersulfat (APS) </td><td> BioShop Kanada </td><td> AMP001 </td></tr><tr><td> Acrylamid / Bis-Acrylamid (40%, 29:1) </td><td> BioShop Kanada </td><td> ACR004 </td></tr><tr><td> Borsäure </td><td> BioShop Kanada </td><td> BOR001 </td></tr><tr><td> Bromphenolblau </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> B8026 </td></tr><tr><td> EDTA </td><td> EM Science </td><td> EXO539-1 </td></tr><tr><td> HCl </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 38281 </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> Bioshop Kanada </td><td> HEP001 </td></tr><tr><td> LB-Brühe </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> L3022 </td></tr><tr><td> MgCl 2 </td><td> EMDChemicals </td><td> B10149-34 </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> BioShop Kanada </td><td> SOD002 </td></tr><tr><td> NaOAc </td><td> EMD Chemicals </td><td> SXO255-1 </td></tr><tr><td> NaOH </td><td> EMD Chemicals </td><td> SXO590-1 </td></tr><tr><td> SDS </td><td> BioShop Kanada </td><td> SDS001 </td></tr><tr><td> TEMED </td><td> BioShop Kanada </td><td> TEM001 </td></tr><tr><td> Tris-Base </td><td> BioShop Kanada </td><td> BST666 </td></tr><tr><td> Tween 20 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P9416 </td></tr><tr><td> Harnstoff </td><td> BioShop Kanada </td><td> URE001 </td></tr><tr><td> Xylenecyanol FF </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> X4126 </td></tr><tr><td> DNA-Konzentrator </td><td> Thermo Scientific </td><td> Savant DNA SpeedVac 120 </td></tr><tr><td> Millex Filtereinheit </td><td> Millipore </td><td> SLGP033RS </td></tr><tr><td> Tipps zum Einlegen von Gel </td&gt; <td> Diamed </td><td> TEC200EX-K </td></tr><tr><td> ImageQuant-Software </td><td> Molecular Dynamics </td><td> Version 5.0 </td></tr><tr><td> Kimwipes </td><td> Kimberly-Clark Professional </td><td> 34705 </td></tr><tr><td> Mini Vortexer </td><td> VWR </td><td> 58816-121 </td></tr><tr><td> Parafilm </td><td> Pechiney Plastic Packaging </td><td> PM996 </td></tr><tr><td> Petrischalen </td><td> Fisher Scientific </td><td> Fisherbrand 08-757-12 </td></tr><tr><td> Stripettor Plus (Pipetten-Pistole) </td><td> Corning </td><td> 07764714 </td></tr><tr><td> Quarzküvetten </td><td> Varian Inc. </td><td> 66-100216-00 </td></tr><tr><td> Shaker / Incubator </td><td> New Brunswick Scientific </td><td> Classic-Serie C24 </td></tr><tr><td> Typhoon-Scanner </td><td> GE Healthcare </td><td> 9200 Variable-Modus </td></tr><tr><td> Zentrifugieren </td><td> Beckman Coulter </td><td> Allegra X22-R </td></tr><tr><td> UV-Spektrophotometers </td><td> Thermo Scientific </td><td> GenesysUV 10 </td></tr><tr><td> Fluoreszenz-Spektralphotometer </td><td> Varian Inc. </td><td> Cary-Eclipse </td></tr></tbody></table>

detection of bacteria using fluorogenic dnazymes

Ausbrüche an lebensmittelbedingten und im Krankenhaus erworbene Erreger Konto für Millionen von Todesfällen und Hospitalisierungen sowie kolossale wirtschaftliche Verluste jedes Jahr verbunden. Prävention solcher Ausbrüche und die Minimierung der Auswirkungen einer laufenden Epidemie Ort eine ständig steigende Nachfrage nach analytischen Methoden, die genau zu identifizieren Täter Krankheitserreger im frühesten Stadium kann. Zwar gibt es eine große Palette von effektiven Methoden für den Erregernachweis, kann keiner von ihnen erfüllen auch die folgenden fünf führenden Anforderungen für einen idealen Nachweismethode verkörperte: eine hohe Spezifität (Erkennen nur das Bakterium von Interesse), hohe Empfindlichkeit (zum Aufspüren von so niedrig als eine einzige Live-Bakterienzelle), kurze Time-to-Ergebnisse (Minuten bis Stunden), große Einfachheit im Betrieb (keine langwierigen Probenahmeverfahren und den Einsatz von Spezialgeräten) und Wirtschaftlichkeit. So sind zum Beispiel klassischen mikrobiologischen Methoden hochspezifische erfordern aber eine längere Zeit (days bis Wochen), um eine definitive Resultat zu erwerben. 1 PCR-und Antikörper-basierte Techniken bieten kürzere Wartezeiten (Stunden bis Tage), aber sie erfordern den Einsatz von teuren Reagenzien und / oder die anspruchsvolle Ausrüstung. 2-4 Folglich gibt es immer noch eine große Nachfrage für die wissenschaftliche Forschung zur Entwicklung innovativer bakterielle Nachweismethoden, die verbesserten Eigenschaften in einem oder mehreren der oben genannten Anforderungen zu bieten. Unser Labor ist daran interessiert, Prüfung des Potenzials DNAzyme als einer neuen Klasse von molekularen Sonden für Biosensorik Anwendungen, einschließlich Nachweis von Bakterien. 5 DNAzyme (auch als Desoxyribozyme oder DNA-Enzyme bezeichnet) sind synthetische einzelsträngige DNA-Moleküle mit der Fähigkeit zur Katalyse chemischer Reaktionen. 6-8 Diese Moleküle aus einer großen Random-Sequenz-DNA-Pool (die nicht weniger als 10 enthält, kann isoliert werden 16 einzelne Sequenzen) durch ein Verfahren als &quot;in-vitro-Selektion&quot; o bekanntr &quot;SELEX&quot; (systematische Evolution von Liganden durch exponentielle Anreicherung). 16.9 Diese besonderen DNA-Moleküle sind weit verbreitet in den letzten Jahren als molekulare Werkzeuge für Biosensorik Anwendungen untersucht. 8.6 Unser Labor hat in vitro Selektion Verfahren zur Isolierung von RNA-spaltende fluoreszierende DNAzyme (. RFDs; Abb. 1) wurde untersucht und die Verwendung von RFDs als analytische Werkzeuge 17-29 RFDs katalysieren die Spaltung eines DNA-RNA-Chimären Substrat an einem einzelnen Ribonukleotid. Verbindung (R), die von einem Fluorophor (F) und einem Quencher (Q) flankiert wird. Die Nähe von F und Q macht die ungespaltenen Substrat minimale Fluoreszenz. Allerdings führt die Spaltung bei der Trennung von F und Q, die durch deutliche Erhöhung der Fluoreszenzintensität begleitet wird. In jüngerer Zeit entwickelten wir ein Verfahren zur Isolierung von RFDs für Nachweis von Bakterien. 5 Diese speziellen RFDs wurden isoliert &quot;leuchtet &quot;in Anwesenheit des rohen extrazellulären Mischung (CEM) zurückgelassen von einer besonderen Art von Bakterien in ihrem Umfeld oder in den Medien werden sie kultiviert (Abb. 1). Die Verwendung von rohen Mischung umgeht das mühsame Prozess der Reinigung und Identifizierung eines geeigneten Ziels von der Mikrobe von Interesse für die Entwicklung von Biosensoren (was Monate oder Jahre in Anspruch nehmen). Der Einsatz von extrazellulären Ziele bedeutet, dass das Testen von Verfahren ist einfach, weil es keine Notwendigkeit für Schritte zur intrazellulären Ziele zu erreichen. Mit dem obigen Ansatz abgeleitet wir eine RFD, das sein Substrat spaltet (FS1;. 2A) nur in Gegenwart des CEM hergestellt von E. coli (CEM-EG). 5 Diese E. coli-Sensing RFD, benannt RFD-EC1 (Abb. 2A), erwies sich als streng, die auf CEM-EG aber nicht reagierende zu CEMs aus einer Vielzahl von anderen Bakterien (Abb. 3). Hier haben wir PreseNT die wichtigsten experimentellen Verfahren für die Einrichtung E. coli-Nachweis-Assays mit RFD-EC1 und repräsentative Ergebnisse.

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Detection of Bacteria Using Fluorogenic DNAzymes

Wir haben vor kurzem einen neuartigen Ansatz zur Erzeugung von fluorogenen DNAzym Sonden, die angewendet zur Einrichtung eine einfache, &quot;Mix-and-read&quot; Fluoreszenz-Assay für die bakterielle Nachweis kann berichtet werden. Diese speziellen DNA-Sonden katalysieren die Spaltung eines Chromophors-modifizierten DNA-RNA-chimären Substrat in Gegenwart von rohem extrazellulären Mischung (CEM) von einem bestimmten Bakteriums fort, wodurch Nachweis von Bakterien in Fluoreszenz-Erzeugungseinheit erzeugt wird. In diesem Bericht beschreiben wir wichtigen experimentellen Verfahren, bei denen eine bestimmte DNAzym Sonde bezeichnet &quot;RFD-EC1&quot; für den Nachweis des Modells Bakterium verwendet wird,<em&gt; Escherichia coli (E. coli)</em&gt;.

Nachweis von Bakterien mit fluorogenen DNAzyme

Outbreaks linked to food-borne and hospital-acquired pathogens account for millions of deaths and hospitalizations as well as colossal economic losses ...

detection-of-bacteria-using-fluorogenic-dnazymes

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

18.7K Aufrufe.  McMaster University. Wir haben vor kurzem einen neuartigen Ansatz zur Erzeugung von fluorogenen DNAzym Sonden, die angewendet zur Einrichtung eine einfache, "Mix-and-read" Fluoreszenz-Assay für die bakterielle Nachweis kann berichtet werden. Diese speziellen DNA-Sonden katalysieren die Spaltung eines Chromophors-modifizierten DNA-RNA-chimären Substrat in Gegenwart von rohem extrazellulären Mischung (CEM) von einem bestimmten Bakteriums fort, wodurch Nachweis von Bakterien in Fluo...