Este protocolo descreve a preparação e análise de um biosensor único que foi projetado para detectar os componentes químicos do resíduo de pólvora. O uso de biosensores para aplicações forenses é único. Representa uma alternativa de baixo custo e simples de usar para a instrumentação altamente especializada normalmente usada em laboratórios forenses.
Os métodos de biologia sintética descritos podem ser usados para qualquer sistema que use partes de biologia sintética padrão. A análise química descrita é aplicável a qualquer biosensor que expresse proteína fluorescente vermelha. Demonstrando o procedimento estarão Andrea Soles e Elle Richardson, estudantes de graduação da Universidade de Longwood.
Para iniciar este procedimento, adicione dez microlitadores do DNA plasmídeo J10060 anteriormente isolado a um tubo de microcentrifuge. Adicione oito microliters de água, e um microliter de cada uma das enzimas EcoRI e NHEL pré-misturadas com um microliter de buffer. Para o DNA do promotor, adicione dez microliters de sequências de DNA do promotor a um tubo de microcentrifuge fresco.
Adicione oito microliters de água, e um microliter de cada uma das enzimas EcoRI e NHEL pré-misturadas com um microliter de buffer. Usando uma pipeta definida para dez microliters, delicadamente pipeta as amostras para cima e para baixo para misturar. Incubar as amostras a 37 graus Celsius por 30 minutos.
Em seguida, aqueça e ativo as enzimas a 80 graus Celsius por cinco minutos. Guarde o DNA digerido em um congelador até que esteja pronto para prosseguir. Primeiro, use o DNA plasmídeo e promotor que foram previamente digeridos para configurar a reação em um tubo de microcetrifúgio no gelo, como descrito na tabela um do protocolo de texto.
Certificando-se de adicionar o T4 DNA Ligase por último. Pipeta para cima e para baixo suavemente para misturar a reação, e centrífuga brevemente. Incubar em temperatura ambiente por dez minutos.
Em seguida, aqueça e ative a 65 graus Celsius por dez minutos. Realize a transformação conforme descrito no protocolo de texto. Primeiro, configure as misturas de reação para PCR conforme descrito na tabela dois do protocolo de texto.
Pipeta suavemente para cima e para baixo para misturar as reações. Usando uma ponta de pipeta amarela, raspe uma colônia do E.coli transformado. Transfira um deslize deste E.coli para uma nova placa de ágar LB-ampicillin que foi seccionada e, em seguida, insira a ponta da pipeta no tubo PCR.
Agite a ponta da pipeta para misturar o E.Coli com a mistura PCR. Repita este processo mais três vezes para colônias adicionais. Em seguida, carregue os tubos PCR em uma máquina PCR e comece a termociclamento conforme descrito na tabela três do protocolo de texto.
Para começar, rotule o número adequado de tubos de cultura estéreis conforme descrito na tabela quatro do protocolo de texto. Adicione dois mililitros do caldo de cultura preparado a cada tubo. Adicione a solução de estoque de anilite aos tubos conforme descrito na tabela quatro.
Em seguida, coloque as tampas de encaixe nos tubos de cultura para que fiquem soltos para permitir o fluxo de ar no tubo. Vórtice cada tubo de cultura. Depois disso, coloque os tubos em uma incubadora de agitação a 37 graus Celsius e a 220 RPM por pelo menos 24 horas.
Primeiro, use uma limpeza à base de etanol projetada para remover chumbo para limpar todas as superfícies das mãos, inclusive entre os dedos. Armazene os lenços em um saco vedado devidamente rotulado até a análise. Use uma limpeza à base de álcool para limpar quaisquer superfícies grandes a serem testadas.
Use uma troca de algodão umedecido com etanol para limpar quaisquer superfícies pequenas a serem testadas. Usando luvas limpas e usando uma tesoura que foi limpa com álcool, corte uma seção que é aproximadamente um centímetro quadrado fora do centro do lenço. Em seguida, coloque o pedaço de limpeza cortado, ou cotonete, diretamente em um tubo de cultura contendo dois mililitros da bactéria do sensor, e certifique-se de que ele está completamente submerso no caldo.
Prepare o espectrômetro para coletar a submissão fluorescente no comprimento de onda apropriado para a variante RFP, com um comprimento de onda de excitação de 500 nanômetros. Em seguida, use uma batedeira de vórtice para agitar os tubos. Transfira cuidadosamente cada supernante para um cuvette de baixo volume e colete a intensidade de emissão.
Usando uma batedeira de vórtice, agite os tubos. Transfira 200 microliters do caldo para um poço na placa do poço. Registo que amostras foram em cada poço desta placa.
Configure o farinhaômetro para coletar a intensidade de emissão no comprimento de onda apropriado para a variante RFP. O espectro de fluorescência para uma variante RFP representativa mostra tanto o controle negativo quanto o espectro em dois níveis diferentes de anilite adicionados. O sinal fluorescente máximo para a variante RFP utilizado neste trabalho é observado em 575 nanômetros.
Os dados representativos são coletados para o mesmo conjunto de soluções, tanto do espectrômetro portátil quanto do fluorômetro. Há uma tendência geral de aumento da fluorescência à medida que a concentração de anilite aumenta. Vale ressaltar que em altas concentrações, superiores a cerca de 800 partes por bilhão para o sensor de chumbo, a resposta cai devido à toxicidade do chumbo em uma concentração tão alta.
A análise das amostras de cotonete de etanol do interior de uma cápsula de cartucho de calibre 40 gasta fornece a prova dos resultados dos princípios. Os resultados positivos de cada uma das três bactérias do sensor indicam um teste positivo para resíduos de pólvora. Os biosensores preparados neste protocolo também podem ser usados individualmente para detectar contaminação em alimentos, água ou amostras ambientais.
Esta técnica abre caminho para os pesquisadores desenvolverem biosensores usando técnicas padrão de biologia sintética para uma variedade de diferentes anilites químicos. Os equipamentos de proteção individual devem ser usados, e os analistas devem lavar as mãos e desinfetar superfícies após o manuseio de E.coli. Os resíduos devem ser autoclavados, e quaisquer resíduos contendo metais pesados devem ser tratados em conformidade.
