Esta é uma ampla facilidade de protocolo, aumentos brutos de geração, e uso de culturas específicas do paciente a partir de células mononucleares de sangue periféricos. Essas táticas são reprodutíveis e fáceis de seguir, especialmente para iniciantes. E não exija.especialistas em baladas de células-tronco, ou medicina cardiovascular.
Nosso protocolo pode ser usado para gerar cardiomiócitos específicos do paciente a partir de uma única coleta de sangue que pode ser usada para modelar doenças cardiovasculares e testar a toxicidade cardíaca de novas drogas. Este protocolo requer um longo compromisso com a manutenção da reprogramação de células-tronco e diferenciação direcionada. No entanto, você realmente aprecia seus esforços.
Quando você vê cardiomiócitos batendo no prato. Quando as colônias humanas de iPSC atingirem mais de 90% de confluência, enxágue cada poço com três mililitros de DPBS antes de tratar as células com um mililitro de 0,5 mililitro EDTA em DPBS por poço a 37 graus Celsius. Após cinco a oito minutos, adicione um mililitro de média de passagem iPSC para cada poço e desaloja manualmente as células.
Transfira de 600 a 900 microlitres das células para wells individuais têm uma membrana de porão revestida de seis placas de poço para uma incubação durante a noite a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono. Em seguida, refrescar as culturas com dois mililitros de meio E8 completo todos os dias durante três a quatro dias. Quando a cultura atingir a confluência, substitua o meio por dois mililitros de meio de diferenciação de cardiomiocócito, dois por poço.
No segundo dia, substitua os supernacantes por dois mililitros de diferenciação de cardiomiocócito. No terceiro dia, substitua os supernantes por dois mililitros de diferenciação de cardiomiocócito médio três. No quinto dia.
Substitua o supernatante por dois mililitros de diferenciação de cardiomiocócito. No sétimo ao dia 10, substitua o supernasciente por dois mililitros de diferenciação de cardiomiocócito quatro. Nos dias 11 e 13.
Quando as células de contração forem observadas, substitua o supernaente por dois mililitros de diferenciação de cardiomiocócito cinco. Nos dias 15, 17, 19 e 21. Substitua o supernatante por dois mililitros de diferenciação de cardiomiocócito médio quatro.
Após a pré-cultura com meio sanguíneo completo por sete dias, o PBMC tornou-se grande com núcleos visíveis e citoplasma indicando que eles estão prontos para transfecção com fatores de reprogramação do Vírus Sendai. Após a introdução ao meio E8 completo. As células completamente reprogramadas se ligarão e começarão a formar colônias.
Após quatro a cinco passagens, colônias de iPSC altamente puras se formarão a partir das células reprogramadas com pouquíssimas células diferenciadas observadas. Nesta fase, a maioria das células são OCT4 e NANOG indicativo positivo de sua pluripotenia. Cardiomiócitos batendo são geralmente observados após 12 dias de diferenciação.
Após a fome de glicose, e replando cardiomiócitos iPSC exibe, espancamento espontâneo, e uma estrutura de sarcomere alinhada com troponina cardíaca intercalada T e expressão de actinina alfa. As colônias mantêm sua pureza como evidenciado por sua expressão Troponin T. Embora os cardiomiócitos iPSC sejam relativamente imaturos comparados aos cardiomiócitos adultos.
Eles demonstram potenciais de ação ventriculares e atrial, medidos por patch por atacado, grampo. Cardiomiócitos ventriculares expressam a cadeia de luz da miosina dois, enquanto os cardiomiócitos iPSC atrial são marcados pela expressão NR2F2. A ativação do WNT estimula a divisão celular e promove a expressão dos reguladores do ciclo celular.
Curiosamente, a ativação do WNT também induz a proliferação robusta de cardiomiócitos iPSC precoces por duas passagens em comparação com os controles, embora essa capacidade proliferativa diminua com o tempo. Certifique-se de que o PBMS seja ampliado com o nuclear e o citoplasma claros antes que os vetores de reprogramação do iPSC sejam introduzidos, pois a condição dos PBMs é fundamental para a reprogramação do iPSC. Cardiomiócitos específicos do paciente são valiosos para modelar doenças cardiovasculares in vitro e para fornecer uma tonelada de células doadoras para terapia de células-tronco cardíacas.
