Name: protein extract preparation and co-immunoprecipitation from caenorhabditis elegans
Uploaded: 2020-05-23T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 22 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Protein Extract Preparation and Co-immunoprecipitation from Caenorhabditis elegans at JoVE.com

Este trabalho foi em parte apoiado por Kansas INBRE, P20GM103418 para Li e Zinovyeva e R35GM124828 para Zinovyeva. Agradecemos a Min Han por compartilhar generosamente o anticorpo anti-AIN-1. Algumas das cepas utilizadas no decorrer deste trabalho foram fornecidas pelo Centro de Genética de Caenorhabditis (CGC), financiado pelo NIH Office of Research Infrastructure Programs (P40 OD010440).

1. Coleta de amostras de vermes
<ol><li>Fase mista de sementes ousincronizado 13 vermes em placas sólidas NGM na temperatura necessária e permitem que os vermes cresçam até o estágio desejado. Para o crescimento e manutenção básicos de C. elegans, consulte Stiernagle et al. e Porta-de-la-Riva et al.14,13.</li>
	<li>Colete vermes em um tubo de centrífuga cônica de 15 mL lavando as placas de vermes com tampão M9.</li>
	<li>Pellule os vermes por centrifugação a 400 x g à temperatura ambiente (RT) por 2 min e descarte o supernasce. NOTA: O tamanho da pelota de verme para a preparação do extrato está entre 100 μL e 500 μL. Uma pelota de 300 μL de vermes embalados é recomendada para experimentos de imunoprecipitação a jusante e normalmente produz ~4,5 mg de proteína total, enquanto uma pelota de 500 μL produzirá ~7,5 mg de proteína total.</li>
	<li>Realize lavagens adicionais de 3 a 5 com tampão M9 (ver Tabela 1) ou até que o sobrenatante não esteja mais nublado.</li>
	<li>Realize uma última lavagem com ddH2O.</li>
	<li>Mova a pelota de verme solto para um tubo de microcentrifuuge de 1,5 mL e gire a 400 x g no RT por 2 min. Descarte o restante do supernante para obter uma pelota de verme embalada e prossiga para extrair a preparação. NOTA: O protocolo pode ser pausado aqui. As pelotas de verme podem ser congeladas em nitrogênio líquido imediatamente e armazenadas a -80 °C ou em nitrogênio líquido. Por favor, note que as pelotas de verme só podem ser descongeladas uma vez e não podem ser refrozenas.</li>
</ol>2. Extrair preparação da pelota de verme
NOTA: A preparação do extrato deve ser realizada no gelo ou a 4 °C.
<ol><li>Se congelado, descongele a pelota de verme no gelo. NOTA: Se o tamanho da pelota de verme embalado desejado de 300 μL não foi obtido durante a coleta de amostras, várias pelotas menores podem ser combinadas até que o material suficiente esteja presente para posterior extração.</li>
	<li>Adicione um volume igual de tampão de lise 2x lysis gelada (60 mM HEPES, pH = 7,4, 100 mM de cloreto de potássio, 0,1% Triton X, 4 mM de cloreto de magnésio, 10% glicerol, 2 mM DTT com inibidor de RNase, inibidor de protease e inibidores de fosfatase; ver Tabela 1) e vórtice ou pipeta para cima e para baixo para misturar. Gire o tubo para baixo para coletar a mistura na parte inferior do tubo.</li>
	<li>Mova a mistura para um tubo sem RNase de 1,5 mL contendo contas metálicas (ver Tabela de Materiais) e coloque a amostra no homogeneizador do moinho de contas (ver Tabela de Materiais) a 4 °C. Certifique-se de que as tampas do tubo estão apertadas e as amostras são equilibradas dentro do homogeneizador.</li>
	<li>Homogeneize a amostra na velocidade mais alta (ajuste 12) por 4 min.</li>
	<li>Remova a amostra das contas e coloque-a em um novo tubo de microcentrifuuge de 1,5 mL. Alternativamente, um ímã fornecido com o homogeneizador pode ser usado para remover as contas da amostra.</li>
	<li>Gire o extrato a 19.000 x g por 20 min a 4 °C para esclarecer o extrato de proteína.</li>
	<li>Transfira o supernante para um tubo fresco de 1,5 mL no gelo, evitando o transporte do precipitado branco e nublado que se forma em cima da amostra. O supernante é agora o extrato esclarecido. NOTA: Economize 10 μL do extrato esclarecido para determinar a concentração total da proteína.</li>
	<li>Use o extrato imediatamente para os seguintes experimentos ou congele o extrato em nitrogênio líquido e armazene a -80 °C. NOTA: O protocolo pode ser pausado aqui. Os extratos podem ser armazenados à temperatura ultrabaixo (-80 °C congelador ou nitrogênio líquido por ~6 meses). Extratos congelados podem ser descongelados uma vez e não podem ser refrozenados.</li>
	<li>Determine a concentração total de proteínas do extrato utilizando um kit de ensaio de concentração de proteína compatível com detergentes (ver Tabela de Materiais) de acordo com as instruções do fabricante.</li>
</ol>3. Imunoprecipitação
NOTA: Todas as etapas de imunoprecipitação para a preparação do extrato devem ser realizadas no gelo ou a 4 °C. Recomenda-se o uso de 2 mg de proteína total para cada imunoprecipitação. No entanto, foram realizadas imunoprecipitações bem sucedidas com 0,8-1 mg de proteína total. Use sempre extratos de proteínas frescos ou descongelados. O protocolo a seguir é delineado para realizar imunoprecipitação a partir de 2 mg de proteína total, ou um único experimento de imunoprecipitação. A quantidade de contas e anticorpos pode ser aumentada ou diminuída em conformidade para múltiplas amostras ou se uma quantidade diferente de extrato de proteína for usada.
<ol><li>Coloque ou descongele o extrato de proteína no gelo. A amostra pode ser diluída a 10 mg/mL ou 5 mg/mL com tampão de 1x de lise gelada (ver Tabela 1).</li>
	<li>Resuspenda as contas magnéticas por inversão e transfira 150 μL da suspensão de contas de 50% em um tubo de 1,5 mL. Magnetize as contas no gelo contra uma posição magnética por 1 min ou até que a solução esteja clara. Descarte o supernaspeso.</li>
	<li>Remova o tubo do suporte magnético e lave as contas em 1x tampão de lise usando 2 volumes (ou seja, 300 μL) de chorume de contas. Repita a lavagem 2x para um total de três lavagens.</li>
	<li>Resuspenda as contas em 150 μL de tampão de lise gelada.</li>
	<li>Transfira 75 μL do chorume de contas para 2 mg de extrato de proteína e incubar a 4 °C por 1h com agitação suave. Guarde a suspensão restante do cordão um pouco no gelo para uso posterior. NOTA: Esta etapa é realizada para reduzir a ligação proteica inespecífica às contas durante a etapa de imunoprecipitação.</li>
	<li>Coloque o tubo com amostra no suporte magnético no gelo por 1 minuto ou até que as contas estejam totalmente magnetizadas e a amostra esteja clara. Transfira o supernante para um novo tubo de 1,5 mL; não perturbe as contas. Este é o lise de proteína pré-esclaro. Guarde 10% da amostra para análise de manchas ocidentais.</li>
	<li>Adicione 20 μg de anticorpo purificado de afinidade ao lise pré-esclara e incubar a 4 °C por 1h com agitação suave. NOTA: A quantidade de anticorpos utilizados para a imunoprecipitação é específica para o anticorpo e proteína e deve ser empiricamente determinada para garantir uma imunoprecipitação eficaz da proteína alvo.</li>
	<li>Adicione os 75 μL restantes da suspensão pré-lavada das contas (etapa 3.5) à mistura de anticorpos/lisesato e incubar por 1h a 4 °C com agitação suave.</li>
	<li>Coloque o tubo no suporte magnético no gelo por 1 minuto ou até que as contas estejam totalmente magnetizadas e a amostra esteja clara. Guarde o supernatante para análise de manchas ocidentais (opcional).</li>
	<li>Lave as contas contendo o imunoprecipitato 3x em 450 μL de tampão de lavagem (30 mM HEPES, pH = 7,4, 100 mM cloreto de potássio, 0,1% Triton X, 2 mM cloreto de magnésio, 10% glicerol, 1 mM DTT; ver Tabela 1) no gelo. NOTA: Podem ser realizadas lavagens adicionais se forem preferidas condições de lavagem mais rigorosas.</li>
	<li>Resuspenha a pelota de contas em 20 μL de 2x tampão de carregamento de gel de proteína SDS/BME (ver Tabela de Materiais) e desnaturar a 95 °C por 5 minutos antes de carregar em um gel SDS-PAGE. Alternativamente, as amostras desnaturadas podem ser armazenadas a -20 °C por vários meses. NOTA: Uma parte do imunoprecipitato de contas pode ser salva para o isolamento do RNA a jusante, se desejar.</li>
</ol>4. Detecção de manchas ocidentais de amostras de IP
<ol><li>Carregue as amostras IP no gel SDS-PAGE (ver Tabela de Materiais). Evite transferir as contas colocando os tubos IP no suporte magnético por 1 minuto antes da aspiração da amostra.</li>
	<li>Realizar a mancha ocidental15,16 e mancha deanticorpos 16 com as seguintes modificações: diluir o anticorpo ALG-117 1:500 em 5% de leite seco não gordo (NFDM); diluir o anticorpo HRPK-12 1:1.000 em 5% NFDM; e diluir o anticorpo AIN-118 1:10.000 em 5% NFDM. Anticorpos secundários (ver Tabela de Materiais) foram utilizados de acordo com as instruções do fabricante.</li>
	<li>Detecte as bandas com chemiluminescência baseada em HRP (ver Tabela de Materiais).</li>
</ol>

<ol>
	<li>Liu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+AP-MS-+and+BioID-compatible+MAC-tag+enables+comprehensive+mapping+of+protein+interactions+and+subcellular+localizations.">An AP-MS- and BioID-compatible MAC-tag enables comprehensive mapping of protein interactions and subcellular localizations.</a> Nature Communications. 9 (1), 1188-1216 (2018).</li><li>Li, L., Veksler-Lublinsky, I., Zinovyeva, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HRPK-1,+a+conserved+KH-domain+protein,+modulates+microRNA+activity+during+Caenorhabditis+elegans+development.">HRPK-1, a conserved KH-domain protein, modulates microRNA activity during Caenorhabditis elegans development.</a> PLoS Genetics. 15 (10), 1008067 (2019).</li><li>Zinovyeva, A. Y., Veksler-Lublinsky, I., Vashisht, A. A., Wohlschlegel, J. A., Ambros, V. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caenorhabditis+elegans+ALG-1+antimorphic+mutations+uncover+functions+for+Argonaute+in+microRNA+guide+strand+selection+and+passenger+strand+disposal.">Caenorhabditis elegans ALG-1 antimorphic mutations uncover functions for Argonaute in microRNA guide strand selection and passenger strand disposal.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (38), 5271-5280 (2015).</li><li>Hammell, C. M., Lubin, I., Boag, P. R., Blackwell, T. K., Ambros, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=nhl-2+Modulates+microRNA+activity+in+Caenorhabditis+elegans.">nhl-2 Modulates microRNA activity in Caenorhabditis elegans.</a> Cell. 136 (5), 926-938 (2009).</li><li>Zou, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+decline+in+neuronal+regeneration+by+the+progressive+change+of+two+intrinsic+timers.">Developmental decline in neuronal regeneration by the progressive change of two intrinsic timers.</a> Science. 340 (6130), 372-376 (2013).</li><li>Zanin, E., Dumont, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Affinity+purification+of+protein+complexes+in+C.+elegans.">Affinity purification of protein complexes in C. elegans.</a> Methods in Cell Biology. 106, 289-322 (2011).</li><li>Bhaskaran, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breaking+Caenorhabditis+elegans+the+easy+way+using+the+Balch+homogenizer:+an+old+tool+for+a+new+application.">Breaking Caenorhabditis elegans the easy way using the Balch homogenizer: an old tool for a new application.</a> Analytical Biochemistry. 413 (2), 123-132 (2011).</li><li>Kohl, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plate-based+Large-scale+Cultivation+of+Caenorhabditis+elegans:+Sample+Preparation+for+the+Study+of+Metabolic+Alterations+in+Diabetes.">Plate-based Large-scale Cultivation of Caenorhabditis elegans: Sample Preparation for the Study of Metabolic Alterations in Diabetes.</a> Journal of Visualized Experiments. (138), e58117 (2018).</li><li>Larance, M., Bailly, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stable-isotope+labeling+with+amino+acids+in+nematodes.">Stable-isotope labeling with amino acids in nematodes.</a> Nature Methods. 8 (10), 849-851 (2011).</li><li>Ding, L., Han, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GW182+family+proteins+are+crucial+for+microRNA-mediated+gene+silencing.">GW182 family proteins are crucial for microRNA-mediated gene silencing.</a> Trends in Cell Biology. 17 (8), 411-416 (2007).</li><li>Ding, L., Spencer, A., Morita, K., Han, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Developmental+Timing+Regulator+AIN-1+Interacts+with+miRISCs+and+May+Target+the+Argonaute+Protein+ALG-1+to+Cytoplasmic+P+Bodies+in+C.+elegans.">The Developmental Timing Regulator AIN-1 Interacts with miRISCs and May Target the Argonaute Protein ALG-1 to Cytoplasmic P Bodies in C. elegans.</a> Molecular Cell. 19 (4), 437-447 (2005).</li><li>Jannot, G., Vasquez-Rifo, A., Simard, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Argonaute+Pull-Down+and+RISC+Analysis+Using+2&#8217;-O-Methylated+Oligonucleotides+Affinity+Matrices.">Argonaute Pull-Down and RISC Analysis Using 2&#8217;-O-Methylated Oligonucleotides Affinity Matrices.</a> Methods in Molecular Biology. 725, 233-249 (2011).</li><li>Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Ceron, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+Caenorhabditis+elegans+methods:+synchronization+and+observation.">Basic Caenorhabditis elegans methods: synchronization and observation.</a> Journal of Visualized Experiments. (64), e4019 (2012).</li><li>Stiernagle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintenance+of+C.+elegans.">Maintenance of C. elegans.</a> WormBook: the Online Review of C. elegans Biology. , 1-11 (2006).</li><li>Gallagher, S., Chakavarti, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunoblot+analysis.">Immunoblot analysis.</a> Journal of Visualized Experiments. (16), e759 (2008).</li><li>Eslami, A., Lujan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Western+blotting:+sample+preparation+to+detection.">Western blotting: sample preparation to detection.</a> Journal of Visualized Experiments. (44), e2359 (2010).</li><li>Zinovyeva, A. Y., Bouasker, S., Simard, M. J., Hammell, C. M., Ambros, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+in+conserved+residues+of+the+C.+elegans+microRNA+Argonaute+ALG-1+identify+separable+functions+in+ALG-1+miRISC+loading+and+target+repression.">Mutations in conserved residues of the C. elegans microRNA Argonaute ALG-1 identify separable functions in ALG-1 miRISC loading and target repression.</a> PLoS Genetics. 10 (4), 1004286 (2014).</li><li>Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+Identification+of+C.+miRISC+Proteins,+miRNAs,+and+mRNA+Targets+by+Their+Interactions+with+GW182+Proteins+AIN-1+and+AIN-2.">Systematic Identification of C. miRISC Proteins, miRNAs, and mRNA Targets by Their Interactions with GW182 Proteins AIN-1 and AIN-2.</a> Molecular Cell. 28 (4), 598-613 (2007).</li><li>Corsi, A. K., Wightman, B., Chalfie, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Transparent+Window+into+Biology:+A+Primer+on+Caenorhabditis+elegans.">A Transparent Window into Biology: A Primer on Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 200 (2), 387-407 (2015).</li><li>Farboud, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+Genome+Editing+with+Cas9+Ribonucleoprotein+in+Diverse+Cells+and+Organisms.">Enhanced Genome Editing with Cas9 Ribonucleoprotein in Diverse Cells and Organisms.</a> Journal of Visualized Experiments. (135), e57350 (2018).</li><li>Dickinson, D. J., Goldstein, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-Based+Methods+for+Caenorhabditis+elegans+Genome+Engineering.">CRISPR-Based Methods for Caenorhabditis elegans Genome Engineering.</a> Genetics. 202 (3), 885-901 (2016).</li></ol>

Os autores não têm nada a revelar.

C. elegans é um excelente modelo para estudar questões fundamentais em biologia celular, molecular e de desenvolvimento19. Além de seu poder como um sistema de modelo genético, C. elegans é favorável a abordagens bioquímicas, incluindo, mas não se limitando a, imunoprecipitação proteica e co-imunoprecipitação. Um obstáculo potencial na realização de experimentos de imunoprecipitação é a falta de anticorpos específicos às proteínas de interesse. Se nenhum anticorpo estiver disponível, podem ser gerados anticorpos policlonais ou monoclonais personalizados. No entanto, as recentes inovações na tecnologia de edição de genomas permitiram aos pesquisadores introduzir rapidamente mutações ou marcar genes endógenos C. elegans 20,21, facilitando estudos que desvendam as interações genéticas, funcionais e físicas entre os genes e as proteínas codificadas. Especificamente, a marcação mediada por CRISPR/Cas9 de genes C. elegans no loci endógeno reduziu a dependência de experimentos de imunoprecipitação na disponibilidade de anticorpos, tornando os experimentos de co-imunoprecipitação muito mais viáveis. C. elegans genes podem ser marcados com uma variedade de tags que vão desde tags fluorescentes como GFP ou mCherry até pequenas tags como FLAG e HA. Os anticorpos que reconhecem essas etiquetas estão prontamente disponíveis comercialmente, facilitando os estudos de interações proteína-proteína através de abordagens de imunoprecipitação.
O protocolo apresentado, delineado na Figura 1,pode ser realizado para um pequeno número de amostras ou ampliado, permitindo até 24 preparações amostrais por vez. Embora as caracterizações iniciais de interações proteína-proteína via imunoprecipitação sejam tipicamente feitas em origens do tipo selvagem em condições normais de crescimento, estudos de acompanhamento frequentemente exigem testar as interações proteína-proteína em uma variedade de origens genéticas ou em diferentes condições de crescimento. A capacidade de preparar simultaneamente vários extratos economiza tempo e, importante, garante a consistência de preparação do extrato entre as diferentes amostras. Um controle negativo é sempre necessário, com o controle ideal sendo uma mutação nula na codificação genética para a proteína imunoprecipitada de interesse (Ver Figura 3 e Figura 4, por exemplo).
Este protocolo de extrato permite a preparação rápida do extrato de proteínas a partir de amostras de C. elegans e é comparável à homogeneização à base de contas de zircônio8. A homogeneização das contas em geral pode ser dimensionada até múltiplas preparações simultâneas de amostras usando uma variedade de homogeneizadores de moinhos de contas ou equipamentos similares. Alguns homogeneizadores mais econômicos da fábrica de contas podem reduzir o número de amostras que podem ser processadas simultaneamente, no entanto. Alternativamente, o protocolo de extrato apresentado é compatível com a preparação do extrato à base de dounce, que representa uma alternativa econômica. Embora diferentes homogeneizadores de moinhos de contas não tenham sido testados, a maioria provavelmente será compatível com este protocolo de extrato de proteína, desde que a interrupção completa das amostras de C. elegans seja alcançada.
Como apresentado, este protocolo de preparação de extratos é compatível com múltiplos experimentos a jusante, incluindo imunoprecipitação proteica2 e microRNA pull-down12 e permite a coleta a jusante de componentes de proteína e RNA. Também extrai eficientemente proteínas nucleares e citoplasmáticas(Figura 2, Figura 3e Figura 4). Da mesma forma, o protocolo de imunoprecipitação apresentado permite o isolamento do RNA de imunoprecipitatos associados à proteína. Embora o protocolo de imunoprecipitação tenha sido originalmente desenvolvido para identificar os interagedores de proteínas ALG-1, o método pode ser adaptado para testar interações entre quaisquer proteínas de interesse. De fato, as condições de imunoprecipitação utilizadas funcionaram igualmente bem para imunoprecipitação ALG-1 (Figura 3) e HRPK-1 (Figura 4). Este protocolo é um excelente ponto de partida para a imunopurização de proteínas de ligação de RNA. Deve-se notar, no entanto, que algumas mudanças na composição do buffer podem ser necessárias para outras proteínas de interesse. As alterações podem depender das propriedades físicas e bioquímicas da proteína de interesse e devem ser implementadas caso a caso.
Uma vez que a proteína alvo (aqui, ALG-1 ou HRPK-1) é imunoprecipitada, a mancha ocidental pode ser usada para testar o co-imunoprecipitato para interagidores específicos de proteínas.
Alternativamente, o imunoprecipitato copurificado pode ser submetido à análise de espectrometria de massa para identificar todas as proteínas interativas putativas. Interações confirmadas de co-imunoprecipitação podem então ser examinadas em uma variedade de origens genéticas ou condições para identificar a possível regulação da interação específica. Por exemplo, para determinar se o HRPK-1 desempenha um papel na montagem ALG-1/AIN-1 miRISC, a coprecipitação ALG-1-AIN-1 foi avaliada tanto em um fundo tipo selvagem quanto na ausência de HRPK-1 (Figura 3). hrpk-1 foi considerado dispensável para interação ALG-1/AIN-12 (Figura 3). Além disso, a tecnologia de edição de genomas CRISPR/Cas9 pode ser empregada para gerar mutações de exclusão de ponto único ou domínio nas proteínas de interesse. Retestar a capacidade dos mutantes gerados de coprecipitar com seus interajadores de proteínas pode revelar quais domínios ou resíduos mediam a interação física. Tais estudos futuros podem produzir informações inestimáveis sobre o mecanismo da função e regulação da proteína. Essas abordagens, combinadas com o poder da genética C. elegans, podem fornecer insights importantes sobre os processos moleculares fundamentais que regem o desenvolvimento animal e a função celular.

Identificar as interações macromoleculares de uma proteína de interesse pode ser a chave para aprender mais sobre sua função. Experimentos de imunoprecipitação e co-imunoprecipitação podem ser usados para identificar todo o interactome de uma proteína através de abordagens proteômicas em larga escala1 ou para testar especificamente a capacidade de uma proteína de coprecipitar com um interagidor hipotético. Em C. elegans,ambos os métodos foram empregados com sucesso para aprender mais sobre a atividade de uma variedade de proteínas, incluindo aquelas que funcionam de perto com microRNAs para regular a expressão genética2,3,4. Experimentos de co-imunoprecipitação têm a vantagem de testar as interações proteína-proteína em seu ambiente celular nativo, mas a preparação do extrato pode ser desafiadora e demorada. A lise eficiente da amostra é necessária, mas deve-se tomar cuidado para minimizar a interrupção das interações proteína-proteína. Métodos como douncing5, sonication6, Balch homogenization7, e zircônia beads-homogeneization8,9 têm sido usados para preparar com sucesso extratos totais de proteínas C. elegans. Esses métodos, com exceção da homogeneização da conta de zircônia, têm limitações em termos do número de amostras que podem ser processadas simultaneamente. Apresentado é um método alternativo que pode ser facilmente dimensionado para permitir a preparação de extratos de proteínas rápidas e de alta produtividade de C. elegans seguidos de co-imunoprecipitação. Especificamente, o método pode preparar até 24 amostras por vez, reduzindo consideravelmente o tempo necessário para a preparação do extrato. Em contraste, por exemplo, douncing normalmente permite apenas uma preparação amostral por vez. Este método extrato pode ser usado para preparar extratos de qualquer estágio de desenvolvimento de C. elegans.
Descrito é um procedimento passo-a-passo para coleta de amostras de animais, preparação de extratos, imunoprecipitação e apresentação de dados de manchas ocidentais para confirmar a retirada e detecção bem sucedida da proteína co-imunoprecipitante de interesse. Para demonstrar a eficácia do protocolo, foram realizados dois experimentos de co-imunoprecipitação entre 1) microRNA Argonaute ALG-1 e AIN-1, um homólogo GW182; e 2) ALG-1 e HRPK-1, um recém-identificado interagedor ALG-12. ALG-1 e AIN-1 são proteínas centrais que compõem o complexo de silenciamento induzido pelo microRNA (miRISC) e a interação entre essas duas proteínas é bem estabelecida10,11. O protocolo de preparação do extrato foi eficaz no experimento de co-imunoprecipitação ALG-1-AIN-1. Este protocolo também confirmou com sucesso a interação entre a ALG-1e seu recém-identificado interager, HRPK-12 .
Em resumo, o manuscrito descreve um protocolo de preparação de extrato de C. elegans que pode ser dimensionado para processar simultaneamente 24 amostras, juntamente com um protocolo de co-imunoprecipitação que pode ser usado para identificar novas ou confirmar interações hipotéticas entre proteínas. O protocolo de preparação do extrato é compatível com uma série de experimentos a jusante, incluindo imunoprecipitaçãoproteica 2 e pulldowns microRNA12. Além disso, o protocolo de imunoprecipitação pode ser adaptado para testar interações entre quaisquer duas ou mais proteínas endógenas, marcadas ou superexpressas em uma variedade de origens genéticas.

<table><tbody><tr><td>15 mL tube</td><td>VWR</td><td>89039-664</td><td>STEP 1.2</td></tr><tr><td>2x Laemmli Sample Buffer</td><td>BioRed</td><td>1610737</td><td>STEP 3.11</td></tr><tr><td>4&amp;ndash;20% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels</td><td>BioRed</td><td>4561096</td><td>STEP 4.1</td></tr><tr><td>anti-AIN-1 monoclonal antibody</td><td>custom generated</td><td>n/a</td><td>STEP 4.2, see ref. Zhang et al. 2007</td></tr><tr><td>anti-ALG-1 monoclonal antibody</td><td>custom generated by PRF&amp;amp;L</td><td>n/a</td><td>STEP 4.2</td></tr><tr><td>anti-HRPK-1 monoclonal antibody</td><td>custom generated by PRF&amp;amp;L</td><td>n/a</td><td>STEP 4.2</td></tr><tr><td>Bullet Blender Storm Homogenizer</td><td>MidSci</td><td>BBY24M</td><td>STEP 2.3</td></tr><tr><td>DL-Dithiothreitol (DTT)</td><td>Sigma</td><td>D9779-5G</td><td>Table 1</td></tr><tr><td>Dynabeads Protein A for Immunoprecipitation</td><td>Thermo Fisher</td><td>10002D</td><td>STEP 3.2</td></tr><tr><td>DynaMag-2 Magnet</td><td>Thermo Fisher</td><td>12321D</td><td>STEP 3.2</td></tr><tr><td>EDTA-free protease inhibitors</td><td>Roche</td><td>11836170001</td><td>Table 1</td></tr><tr><td>GFP antibody (FL)</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-8334</td><td>Figure 2</td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Thermo Fisher</td><td>G33-500</td><td>Table 1</td></tr><tr><td>Goat Anti-Rabbit Secondary Antibody, HRP</td><td>BioRed</td><td>1662408</td><td>STEP 4.2</td></tr><tr><td>Goat anti-Rat IgG (H+L) Secondary Antibody, HRP</td><td>Thermo Fisher</td><td>31470</td><td>STEP 4.2</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H4034-500G</td><td>Table 1</td></tr><tr><td>LICOR WesternSure PREMIUM Chemiluminescent Substrate, 100 mL Kit</td><td>LI-COR</td><td>926-95000</td><td>STEP 4.3</td></tr><tr><td>Magnesium chloride hexahydrate ACS</td><td>VWR</td><td>VWRV0288-500G</td><td>Table 1</td></tr><tr><td>Magnesium Sulfate Anhydrous</td><td>Thermo Fisher</td><td>M65-500</td><td>Table 1</td></tr><tr><td>Microcentrifuge Tubes, 1.5 mL</td><td>VWR</td><td>20170-333</td><td>STEP 1.6</td></tr><tr><td>N2 wild type</td><td>CGC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Navy RINO RNA Lysis Kit 50 pack (1.5 mL)</td><td>MidSci</td><td>NAVYR1-RNA</td><td>STEP 2.3</td></tr><tr><td>Phosphatase inhibitor cocktail 2</td><td>Sigma</td><td>P5726-1ML</td><td>Table 1</td></tr><tr><td>Phosphatase inhibitor cocktail 3</td><td>Sigma</td><td>P0044-1ML</td><td>Table 1</td></tr><tr><td>Potassium Chloride</td><td>Thermo Fisher</td><td>P217-500</td><td>Table 1</td></tr><tr><td>Potassium phosphate monobasic</td><td>Thermo Fisher</td><td>P285-3</td><td>Table 1</td></tr><tr><td>RC DC Protein Assay Kit I</td><td>BioRed</td><td>5000121</td><td>STEP 2.9</td></tr><tr><td>RNaseOUT Recombinant Ribonuclease Inhibitor</td><td>Thermo Fisher</td><td>10777019</td><td>Table 1</td></tr><tr><td>Sodium Chloride</td><td>Thermo Fisher</td><td>S271-500</td><td>Table 1</td></tr><tr><td>Sodium Phosphate Dibasic Anhydrous</td><td>Thermo Fisher</td><td>S374-500</td><td>Table 1</td></tr><tr><td>TritionX-100</td><td>Sigma</td><td>X100-500ML</td><td>Table 1</td></tr><tr><td>UY38 hrpk-1(zen17)</td><td>available upon request</td><td></td><td></td></tr><tr><td>VT1367 col-19::gfp(maIS105)</td><td>available upon request</td><td></td><td></td></tr><tr><td>VT3841 alg-1(tm492)</td><td>available upon request</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

protein extract preparation and co-immunoprecipitation from caenorhabditis elegans

Métodos de co-imunoprecipitação são frequentemente usados para estudar interações proteína-proteína. A confirmação de interações proteína-proteínas hipotéticas ou a identificação de novas podem fornecer informações inestimáveis sobre a função de uma proteína de interesse. Alguns dos métodos tradicionais de preparação de extratos frequentemente requerem técnicas intensivas em mão-de-obra e demoradas. Aqui, um protocolo de preparação de extratos modificados usando um homogeneizador de moinho de contas e contas metálicas é descrito como uma alternativa rápida aos métodos tradicionais de preparação de proteínas. Este método de preparação do extrato é compatível com estudos de co-imunoprecipitação a jusante. Como exemplo, o método foi usado para co-imunoprecipitar com sucesso C. elegans microRNA Argonaute ALG-1 e dois interagidores alg-1 conhecidos: AIN-1 e HRPK-1. Este protocolo inclui descrições da coleta de amostras de animais, preparação de extratos, esclarecimento de extratos e imunoprecipitação proteica. O protocolo descrito pode ser adaptado para testar interações entre quaisquer duas ou mais proteínas endógenas, marcadas endógenamente ou superexpressas em uma variedade de origens genéticas.

Este protocolo (esquematizado na Figura 1) foi utilizado com sucesso para obter extratos totais de proteínas C. elegans (Figura 2) para imunoprecipitação a jusante de várias proteínas2 (Figura 3 e Figura 4). O protocolo de homogeneizador da fábrica de contas apresentado foi comparável na extração total de proteínas aos métodos à base de dounce(Figura 2) e eficientemente extraído nuclear (COL-19::GFP(NLS) (Figura 2) e proteínas citoplasmáticas(Figura 3 e Figura 4). Várias amostras de vários tamanhos foram extraídas simultaneamente(Figura 2). As proteínas argonautas interagem com membros da família de proteínas GW182, formando os miRISCs que se ligam ao mensageiro alvo RNAs e reprimem sua expressão10. A Figura 3 mostra uma co-imunoprecipitação bem-sucedida dos componentes núcleo miRISC ALG-1 e AIN-1, consistentes com os relatórios anteriores11,17. Mais recentemente, foram feitos esforços para identificar interagidores proteicos adicionais do Argonaute ALG-13, a fim de saber mais sobre como a biogênese e a atividade do microRNA podem ser reguladas por fatores auxiliares. A proteína de ligação de RNA HRPK-1 foi identificada em imunoprecipitatos ALG-13. Esta interação foi recentemente confirmada em um experimento recíproco de imunoprecipitação HRPK-12. Os protocolos de extração e imunoprecipitação apresentados recuperaram com sucesso a ALG-1 em co-imunoprecipitatos específicos hrpk-1(Figura 4). Além disso, a interação ALG-1 -AIN-1 foi testada em uma variedade de origens genéticas e o HRPK-1 mostrou-se desnecessário para o conjunto ALG-1/AIN-1 miRISC2 (Figura 3). Figuras suplementares são fornecidas para mostrar a membrana completa sondada(Figura Suplementar 1).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61243/61243fig1.jpg"> Figura 1: Esquema de fluxo de trabalho para C. elegans extraem preparação e imunoprecipitação. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61243/61243fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61243/61243fig2.jpg"> Figura 2: Comparação de manchas ocidentais de um GFP localizado nuclear, COL-19::GFP(NLS), níveis em amostras preparadas e homogeneizadas de 250 μL e 100 μL de pelotas de vermes. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61243/61243fig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61243/61243fig3.jpg"> Figura 3: GW182 homólogo AIN-1 co-imunoprecipitates com ALG-1. Manchas ocidentais para proteínas ALG-1 e AIN-1 em imunoprecipitatos ALG-1. A co-imunoprecipitação ALG-1/AIN-1 não foi afetada pela ausência de hrpk-1. Entrada = 10% de IP. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61243/61243fig3large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61243/61243fig4.jpg"> Figura 4: ALG-1 co-imunoprecipitatos com HRPK-1. Mancha ocidental para HRPK-1 e ALG-1 em imunoprecipitatos HRPK-1 é mostrado. Entrada = 10% de IP. * indica corrente pesada de anticorpos. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61243/61243fig4large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td colspan="2">Tampão M9 (1 L)</td>
		</tr>
<tr>
<td>KH2PO4
</td>
			<td>3 g</td>
		</tr>
<tr>
<td>Na2HPO4
</td>
			<td>6 g</td>
		</tr>
<tr>
<td>NaCl</td>
			<td>5 g</td>
		</tr>
<tr>
<td>1 M MgSO4
</td>
			<td>1 mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>ddH2O</td>
			<td>até 1 L</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Tampão de lysis 2x (5 mL)</td>
		</tr>
<tr>
<td>HEPES (pH 7.4)</td>
			<td>200 μL</td>
		</tr>
<tr>
<td>2 M KCl</td>
			<td>250 μL</td>
		</tr>
<tr>
<td>TritonX 10%</td>
			<td>100 μL</td>
		</tr>
<tr>
<td>1 M MgCl2
</td>
			<td>20 μL</td>
		</tr>
<tr>
<td>100% glicerol</td>
			<td>1 mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>ddH2O</td>
			<td>até 5 mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Adicione fresco:</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>1 M DTT</td>
			<td>20 μL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Inibidor de protease sem EDTA</td>
			<td>1 comprimido</td>
		</tr>
<tr>
<td>coquetel inibidor de fosfatase 2</td>
			<td>100 μL</td>
		</tr>
<tr>
<td>coquetel inibidor de fosfatase 3</td>
			<td>100 μL</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">1x Tampão de lysis</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Diluir 2x tampão de lise com um volume igual de ddH20.</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">1x Tampão de lavagem 10 mL)</td>
		</tr>
<tr>
<td>HEPES (pH 7.4)</td>
			<td>300 μL</td>
		</tr>
<tr>
<td>2 M KCl</td>
			<td>500 μL</td>
		</tr>
<tr>
<td>TritonX 10%</td>
			<td>100 μL</td>
		</tr>
<tr>
<td>1 M MgCl2
</td>
			<td>20 μL</td>
		</tr>
<tr>
<td>100% glicerol</td>
			<td>1 mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>ddH2O</td>
			<td>até 10 mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>1 M DTT</td>
			<td>20 μL (adicionar fresco)</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabela 1: Receitas
Figura Suplementar 1. As membranas ocidentais investigadas completas usadas para gerar figuras 2-4 são mostradas. (A) Membrana sondada para a Figura 2. Note que a membrana foi cortada para permitir a sondagem simultânea para GFP e Tubulin, reduzindo o tamanho geral da mancha. (B) Membrana sondada para a Figura 3. (C) Membrana sondada para a Figura 3. *denota a corrente pesada de anticorpos. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61243/Supplemental_Figure_1.pdf" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Protein Extract Preparation and Co-immunoprecipitation from Caenorhabditis elegans at JoVE.com

Protein Extract Preparation and Co-immunoprecipitation from Caenorhabditis elegans

Este método descreve um protocolo para a preparação de extratos de proteína de alto rendimento de amostras de elegans de Caenorhabditis e posterior co-imunoprecipitação.

Preparação e Co-imunoprecipitação de Caenorhabditis elegans

Co-immunoprecipitation methods are frequently used to study protein-protein interactions. Confirmation of hypothesized protein-protein interactions or ...

protein-extract-preparation-co-immunoprecipitation-from

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Protein Extract Preparation and Co-immunoprecipitation from Caenorhabditis elegans

8.8K visualizações.  Kansas State University. Este método descreve um protocolo para a preparação de extratos de proteína de alto rendimento de amostras de elegans de Caenorhabditis e posterior co-imunoprecipitação.

Vídeo: Protein Extract Preparation and Co-immunoprecipitation from Caenorhabditis elegans

Identification of EGFR and RAS Inhibitors using Caenorhabditis elegans

The changes in the plasma membrane localization of the epidermal growth factor receptor (EGFR) and its downstream effector RAS have been implicated in several diseases including cancer. The free-living nematode C. elegans possesses an evolutionary and functionally conserved EGFR-RAS-ERK MAP signal cascade which is central for the development of the vulva. Gain of function mutations in RAS homolog LET-60 and EGFR homolog LET-23 induce the generation of visible nonfunctional ectopic pseudovulva along the ventral body wall of these worms. Previously, the multivulval (Muv) phenotype in these worms has been shown to be inhibited by small chemical molecules. Here we describe a protocol for using the worm in a liquid-based assay to identify inhibitors that abolish the activities of EGFR and RAS proteins. Using this assay, we show R-fendiline, an indirect inhibitor of K-RAS, suppresses the Muv phenotype expressed in the let-60(n1046) and let-23(sa62) mutant worms. The assay is simple, inexpensive, is not time consuming to setup, and can be used as an initial platform for the discovery of anticancer therapeutics.

Identification of EGFR and RAS Inhibitors using Caenorhabditis elegans

The genetically tractable nematode Caenorhabditis elegans can be used as a simple and inexpensive model for drug discovery. Described here is a protocol to identify anticancer therapeutics that inhibit the downstream signaling of RAS and EGFR proteins.

Identificação de Inibidores EGFR e RAS utilizando elegans caenorhabditis

The changes in the plasma membrane localization of the epidermal growth factor receptor (EGFR) and its downstream effector RAS have been implicated in ...

Pesquisa do câncer

In Vivo Hydroxyl Radical Protein Footprinting for the Study of Protein Interactions in Caenorhabditis elegans

Fast oxidation of proteins (FPOP) is a hydroxyl radical protein footprinting (HRPF) method used to study protein structure, protein-ligand interactions, and protein-protein interactions. FPOP utilizes a KrF excimer laser at 248 nm for photolysis of hydrogen peroxide to generate hydroxyl radicals which in turn oxidatively modify solvent-accessible amino acid side chains. Recently, we expanded the use of FPOP of in vivo oxidative labeling in Caenorhabditis elegans (C. elegans), entitled IV-FPOP. The transparent nematodes have been used as model systems for many human diseases. Structural studies in C. elegans by IV-FPOP is feasible because of the animal&#8217;s ability to uptake hydrogen peroxide, their transparency to laser irradiation at 248 nm, and the irreversible nature of the modification. The assembly of a microfluidic flow system for IV-FPOP labeling, IV-FPOP parameters, protein extraction, and LC-MS/MS optimized parameters are described herein.

In Vivo Hydroxyl Radical Protein Footprinting for the Study of Protein Interactions in Caenorhabditis elegans

In vivo fast photochemical oxidation of proteins (IV-FPOP) is a hydroxyl radical protein footprinting technique that allows for mapping of protein structure in their native environment. This protocol describes the assembly and set-up of the IV-FPOP microfluidic flow system.

In Vivo Hydroxyl Radical Protein Footprinting para o Estudo de Interações Proteicas em Caenorhabditis elegans

Fast oxidation of proteins (FPOP) is a hydroxyl radical protein footprinting (HRPF) method used to study protein structure, protein-ligand interactions, ...

Bioquímica

Isolation of Active Caenorhabditis elegans Nuclear Extract and Reconstitution for In Vitro Transcription

Caenorhabditis elegans has been an important model system for biological research since it was introduced in 1963. However, C. elegans has not been fully utilized in the biochemical study of biological reactions using its nuclear extracts such as in vitro transcription and DNA replication. A significant hurdle for using C. elegans in biochemical studies is disrupting the nematode&#39;s thick outer cuticle without sacrificing the activity of the nuclear extract. While several methods are used to break the cuticle, such as Dounce homogenization or sonication, they often lead to protein instability. There are no established protocols for isolating active nuclear proteins from larva or adult C. elegans for in vitro reactions. Here, the protocol describes in detail the homogenization of larval stage 4 C. elegans using a Balch homogenizer. The Balch homogenizer uses pressure to slowly force the animals through a narrow gap breaking the cuticle in the process. The uniform design and precise machining of the Balch homogenizer allow for consistent grinding of animals between experiments. Fractionating the homogenate obtained from the Balch homogenizer yields functionally active nuclear extract that can be used in an in vitro method for assaying transcription activity of C. elegans.

Isolation of Active Caenorhabditis elegans Nuclear Extract and Reconstitution for In Vitro Transcription

Here, we describe a detailed protocol for isolating active nuclear extract from larval stage 4 C. elegans and visualizing transcription activity in an in vitro system.

Isolamento da Caenorhabditis Ativa elegans Extrato Nuclear e Reconstituição para Transcrição In Vitro

Caenorhabditis elegans has been an important model system for biological research since it was introduced in 1963. However, C. elegans has not been fully ...

Prostaglandin Extraction and Analysis in Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans is emerging as a powerful animal model to study the biology of lipids1-9. Prostaglandins are an important class of eicosanoids, which are lipid signals derived from polyunsaturated fatty acids (PUFAs)10-14. These signalling molecules are difficult to study because of their low abundance and reactive nature. The characteristic feature of prostaglandins is a cyclopentane ring structure located within the fatty acid backbone. In mammals, prostaglandins can be formed through cyclooxygenase enzyme-dependent and -independent pathways10,15. C. elegans synthesizes a wide array of prostaglandins independent of cyclooxygenases6,16,17. A large class of F-series prostaglandins has been identified, but the study of eicosanoids is at an early stage with ample room for new discoveries. Here we describe a procedure for extracting and analyzing prostaglandins and other eicosanoids. Charged lipids are extracted from mass worm cultures using a liquid-liquid extraction technique and analyzed by liquid chromatography coupled to electrospray ionization tandem mass spectrometry (LC-ESI-MS/MS). The inclusion of deuterated analogs of prostaglandins, such as PGF2 &alpha;-d4 as an internal standard is recommended for quantitative analysis. Multiple reaction monitoring or MRM can be used to quantify and compare specific prostaglandin types between wild-type and mutant animals. Collision-induced decomposition or MS/MS can be used to obtain information on important structural features. Liquid chromatography mass spectrometry (LC-MS) survey scans of a selected mass range, such as m/z 315-360 can be used to evaluate global changes in prostaglandin levels. We provide examples of all three analyses. These methods will provide researchers with a toolset for discovering novel eicosanoids and delineating their metabolic pathways.

Prostaglandin Extraction and Analysis in Caenorhabditis elegans

In this paper, we describe an optimized procedure for extracting and analyzing prostaglandins and other eicosanoids from C. elegans using LC-MS/MS.

Extração de prostaglandina e Análise em<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Caenorhabditis elegans is emerging as a powerful animal model to study the biology of lipids1-9. Prostaglandins are an important class of eicosanoids, ...

Biologia

Methods to Study Changes in Inherent Protein Aggregation with Age in Caenorhabditis elegans

In the last decades, the prevalence of neurodegenerative disorders, such as Alzheimer's disease (AD) and Parkinson's disease (PD), has grown. These age-associated disorders are characterized by the appearance of protein aggregates with fibrillary structure in the brains of these patients. Exactly why normally soluble proteins undergo an aggregation process remains poorly understood. The discovery that protein aggregation is not limited to disease processes and instead part of the normal aging process enables the study of the molecular and cellular mechanisms that regulate protein aggregation, without using ectopically expressed human disease-associated proteins. Here we describe methodologies to examine inherent protein aggregation in Caenorhabditis elegans through complementary approaches. First, we examine how to grow large numbers of age-synchronized C. elegans to obtain aged animals and we present the biochemical procedures to isolate highly-insoluble-large aggregates. In combination with a targeted genetic knockdown, it is possible to dissect the role of a gene of interest in promoting or preventing age-dependent protein aggregation by using either a comprehensive analysis with quantitative mass spectrometry or a candidate-based analysis with antibodies. These findings are then confirmed by in vivo analysis with transgenic animals expressing fluorescent-tagged aggregation-prone proteins. These methods should help clarify why certain proteins are prone to aggregate with age and ultimately how to keep these proteins fully functional.

Methods to Study Changes in Inherent Protein Aggregation with Age in Caenorhabditis elegans

The goal of the method presented here is to explore protein aggregation during normal aging in the model organism C. elegans. The protocol represents a powerful tool to study the highly insoluble large aggregates that form with age and to determine how changes in proteostasis impact protein aggregation.

Métodos de estudo mudanças na agregação de proteínas inerente com a idade em Caenorhabditis elegans

In the last decades, the prevalence of neurodegenerative disorders, such as Alzheimer's disease (AD) and Parkinson's disease (PD), has grown. These ...

Combined Nucleotide and Protein Extractions in Caenorhabditis elegans

A single biological sample holds a plethora of information, and it is now common practice to simultaneously investigate several macromolecules to capture a full picture of the multiple levels of molecular processing and changes between different conditions. This protocol presents the method of isolating DNA, RNA, and protein from the same sample of the nematode Caenorhabditis elegans to remove the variation introduced when these biomolecules are isolated from replicates of similarly treated but ultimately different samples. Nucleic acids and protein are extracted from the nematode using the acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction method, with subsequent precipitation, washing, and solubilization of each. We show the successful isolation of RNA, DNA, and protein from a single sample from three strains of nematode and HeLa cells, with better protein isolation results in adult animals. Additionally, guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform-extracted protein from nematodes improves the resolution of larger proteins, with enhanced detectable levels as observed by immunoblotting, compared to the traditional RIPA extraction of protein.
The method presented here is useful when investigating samples using a multiomic approach, specifically for the exploration of the proteome and transcriptome. Techniques that simultaneously assess multiomics are appealing because molecular signaling underlying complex biological phenomena is thought to occur at complementary levels; however, it has become increasingly common to see that changes in mRNA levels do not always reflect the same change in protein levels and that the time of collection is relevant in the context of circadian regulations. This method removes any intersample variation when assaying different contents within the same sample (intrasample.)

Combined Nucleotide and Protein Extractions in Caenorhabditis elegans

Here, we present a protocol for the isolation of RNA, DNA, and protein from the same sample, in an effort to reduce variation, improve reproducibility, and facilitate interpretations.

Combinado nucleotídeos e proteínas extrações em Caenorhabditis elegans

A single biological sample holds a plethora of information, and it is now common practice to simultaneously investigate several macromolecules to capture ...

Purification and Analysis of Caenorhabditis elegans Extracellular Vesicles

The secretion of small membrane-bound vesicles into the external environment is a fundamental physiological process of all cells. These extracellular vesicles (EVs) function outside the cell to regulate global physiological processes by transferring proteins, nucleic acids, metabolites, and lipids between tissues. EVs reflect the physiological state of their cells of origin. EVs are implicated to have fundamental roles in virtually every aspect of human health. Thus, EV protein and genetic cargos are being increasingly analyzed for biomarkers of health and disease. However, the EV field still lacks a tractable invertebrate model system that permits the study of EV cargo composition. C. elegans is well suited for EV research because it actively secretes EVs outside of its body into its external environment, permitting facile isolation. This article provides all the necessary information for generating, purifying, and quantifying these environmentally secreted C. elegans EVs including how to work quantitatively with very large populations of age-synchronized worms, purifying EVs, and a flow cytometry protocol that directly measures the number of intact EVs in the purified sample. Thus, the large library of genetic reagents available for C. elegans research can be tapped into for investigating the impacts of genetic pathways and physiological processes on EV cargo composition.

Purification and Analysis of Caenorhabditis elegans Extracellular Vesicles

This article presents methods for generating, purifying, and quantifying Caenorhabditis elegans extracellular vesicles.

Purificação e Análise de Catadores Elegans Extracelulares

The secretion of small membrane-bound vesicles into the external environment is a fundamental physiological process of all cells. These extracellular ...

Quantification of Insoluble Protein Aggregation in Caenorhabditis elegans during Aging with a Novel Data-Independent Acquisition Workflow

We and others have shown that the aging process results in a proteome-wide accumulation of insoluble proteins. Knocking down genes encoding the insoluble proteins over 40% of the time results in an extension of the lifespan in C. elegans, suggesting that many of these proteins are key determinants of the aging process. Isolation and quantitative identification of these insoluble proteins are crucial to understand key biological processes that occur during aging. Here, we present a modified and improved protocol that details how to extract and isolate the SDS-insoluble proteins (insolublome) from C. elegans more efficiently to streamline mass spectrometric workflows via a novel label-free quantitative proteomics analysis. This improved protocol utilizes a highly efficient sonicator for worm lysis that greatly increases efficiency for protein extraction and allows us to use significantly less starting material (approximately 3,000 worms) than in previous protocols (typically using at least 40,000 worms). Subsequent quantitative proteomic analysis of the insolublome was performed using data-dependent acquisition (DDA) for protein discovery and identification and data-independent acquisition (DIA) for comprehensive and more accurate protein quantification. Bioinformatic analysis of quantified proteins provides potential candidates that can be easily followed up with other molecular methods in C. elegans. With this workflow, we routinely identify more than 1000 proteins and quantify more than 500 proteins. This new protocol enables efficient compound screening with C. elegans. Here, we validated and applied this improved protocol to wild-type C. elegans N2-Bristol strain and confirmed that aged day-10 N2 worms showed greater accumulation of the insolublome than day-2 young worms.

Quantification of Insoluble Protein Aggregation in Caenorhabditis elegans during Aging with a Novel Data-Independent Acquisition Workflow

This novel workflow efficiently extracts and isolates SDS-insoluble proteins (insolublome) from Caenorhabditis elegans with minimal starting material for quantitative differential proteomic analysis. The protocol uses a comprehensive data-independent acquisition mass spectrometry analysis to quantify the insolublome and bioinformatic analysis to gain biological insights into aging mechanisms and pathologies.

We and others have shown that the aging process results in a proteome-wide accumulation of insoluble proteins. Knocking down genes encoding the insoluble ...

Small-Scale Extraction of Caenorhabditis elegans Genomic DNA

Genomic DNA extraction from single or a few Caenorhabditis elegans has many downstream applications, including PCR for genotyping lines, cloning, and sequencing. The traditional proteinase K-based methods for genomic DNA extraction from C. elegans take several hours. Commercial extraction kits that effectively break open the C. elegans cuticle and extract genomic DNA are limited. An easy, faster (~15 min), and cost-efficient method of extracting C. elegans genomic DNA that works well for classroom and research applications is reported here. This DNA extraction method is optimized to use single or a few late-larval (L4) or adult nematodes as starting material for obtaining a reliable template to perform PCR. The results indicate that the DNA quality is suitable for amplifying gene targets of different sizes by PCR, permitting genotyping of single or a few animals even at dilutions to one-fiftieth of the genomic DNA from a single adult per reaction. The reported protocols can be reliably used to quickly produce DNA template from a single or a small sample of C. elegans for PCR-based applications.

Small-Scale Extraction of Caenorhabditis elegans Genomic DNA

Presented here is a description of the straightforward and relatively rapid isolation of Caenorhabditis elegans genomic DNA from one or a few animals using a commercially available tissue kit. The resulting gDNA preparation is a suitable template for PCR.

Extração em pequena escala de Caenorhabditis elegans DNA genômico

Genomic DNA extraction from single or a few Caenorhabditis elegans has many downstream applications, including PCR for genotyping lines, cloning, and ...

Single Cell Dissociation of Caenorhabditis elegans: A Method to Isolate Live Cells

Source: Germany, E. M., et al. <a href="https://www.jove.com/video/60145/isolation-specific-neuron-populations-from-roundworm-caenorhabditis">Isolation of Specific Neuron Populations from Roundworm Caenorhabditis elegans</a>. J. Vis. Exp. (2019).
This video describes a method to dissociate whole worms into a single-cell suspension suitable for FACS or immunoprecipitation of intact cells.

Dissociação de célula única de Caenorhabditis elegans: um método para isolar células vivas

Source: Germany, E. M., et al. Isolation of Specific Neuron Populations from Roundworm Caenorhabditis elegans. J. Vis. Exp. (2019).
This video describes a ...

Preparação e Co-imunoprecipitação de Caenorhabditis elegans

Resumo

Explore mais vídeos

Capítulos neste vídeo

Identificação de Inibidores EGFR e RAS utilizando elegans caenorhabditis

In Vivo Hydroxyl Radical Protein Footprinting para o Estudo de Interações Proteicas em Caenorhabditis elegans

Isolamento da Caenorhabditis Ativa elegans Extrato Nuclear e Reconstituição para Transcrição In Vitro

Extração de prostaglandina e Análise em

Métodos de estudo mudanças na agregação de proteínas inerente com a idade em Caenorhabditis elegans

Combinado nucleotídeos e proteínas extrações em Caenorhabditis elegans

Purificação e Análise de Catadores Elegans Extracelulares

Quantification of Insoluble Protein Aggregation in Caenorhabditis elegans during Aging with a Novel Data-Independent Acquisition Workflow

Extração em pequena escala de Caenorhabditis elegans DNA genômico

Dissociação de célula única de Caenorhabditis elegans: um método para isolar células vivas