Este trabalho foi apoiado por bolsas de investigação (NIH / NIDCD 009269, 012831 e ARRA administrativos suplemento NIH) para Weihong Lin. Agradecemos especialmente Mr. Tim Ford em UMBC por sua assistência técnica na filmagem e processamento. Gostaríamos também de agradecer ao Dr. Daphne Blumberg, Ms. Chere Petty em UMBC eo Sr. Nicholas McCollum da Olympus America Inc. por sua assistência em equipamentos de filmagem.

1. Rato Nariz Preparação Usamos adultos camundongos C57BL / 6 fundo neste estudo. Todos os cuidados e procedimentos com animais são aprovados pelo Animal Care e Comitês de Uso (IACUC) da Universidade de Maryland, Baltimore County. 1.1 Adquirir o nariz de camundongos paraformaldahyde-fixados <img src="/files/ftp_upload/50538/50538fig1.jpg" alt="Figura 1" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50538/50538fig1highres.jpg"/> Figura 1. Ossos de um crânio de rato A:. Vista dorsal do crânio B:. Vista ventral do crânio com a mandíbula removida. O crânio foi preparado a partir de um ratinho de idade de 40 dias. Ossos individuais são coloridos para melhor visualização. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50538/50538fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver a figura maior</a> . <ol><li> Perfundir transcardially para corrigir camundongos individuais seguindo ªe protocolo de Lin et ai., (2008) 16. Resumidamente, os ratos foram profundamente anestesiados com tribromoetanol (Avertin 250 ug / g de peso corporal), transcardially perfundidos com tampão fosfato 0,1 M (PB, 30-50 ml), seguido por um agente fixador de fosfato tamponada, contendo 3% de paraformaldeído, 19 mM de L-lisina monocloridrato, e 0,23% de m-periodato de sódio (cerca de 35-50 mL). Pode-se também seguir as etapas no artigo Jove para perfusão animais 35. </li><li> Utilizar um par de tesouras para cortar mandíbula (ou a mandíbula inferior) e retirar a pele da cabeça. </li><li> Separa-se toda a cabeça do resto do corpo. </li><li> Retire o paladar. Também, limpar e remover o tecido muscular e conjuntivo remanescente na superfície do crânio para obter a amostra representada nas Figuras 1A e 1B. </li><li> Sob um microscópio de dissecção, remover o osso do crânio que cobre o cérebro e os bulbos olfactivos. Apare o excesso de tecido e ossos. Nãote, para a preparação de tecido estendido em que o cérebro e nariz permanecer ligado, apenas os ossos são removidos do crânio. Para as experiências de imuno-histoquímica, o tecido foi pós-fixada, durante 1,5 horas e transferidas para solução salina tamponada com fosfato 0,1 M (PBS) com 25% de sacarose durante a noite. Tecido nasal deve ser mantida durante todo o humidif dissecção por imersão na solução de sacarose tamponada várias vezes. </li></ol> 1.2 Adquirir o nariz de camundongos recém-sacrificados <ol><li> Ratinhos individuais foram transferidas para uma gaiola limpa e exposto a gás de CO 2, o que foi seguido por deslocamento cervical 5 min após o sopro final. Para reduzir o sangue no tecido nariz utilize uma tesoura para abrir a caixa e cortar o coração para permitir que o sangue escorra. </li><li> Repita os passos 1.1.2 a 1.1.5, exceto a pós-fixação e crioproteção com 25% de sacarose. A amostra deve ser mantido humidificada e mantida com solução salina de Tyrode contendo (em mM): 140 de NaCl, 5 KCl, MgCl2 1, CaCl2 1, 10 piruvato de Na, 10 em D-glucose, e 10 N-2-hidroxietilpiperazina-N&#39;-2-etanossulfónico tampão de ácido (HEPES, com pH ajustado para 7,4). Alternativamente, dobrar uma peça de Kimwipes, embeba-lo com uma solução de Tyrode, e colocar sob o espécime dissecando e ocasionalmente mergulhar o espécimen em solução a de Tyrode ou cair algumas solução sobre o tecido para o manter húmida para manter a viabilidade das células e dos tecidos . </li></ol> 2. Incisivo, Anterior Vomer e maxila remoção óssea <ol><li> Iniciar a partir de um ponto de vista ventral. Localize o osso vômer e quebrar o osso vômer ao longo de seu comprimento usando uma rongeur ou pinças com dentes para quebrar a maior parte ventral do osso. </li><li> Usando fórceps serrilhados, remover os segmentos quebradas do osso vômer dobrando suavemente os fragmentos do osso para fora do órgão vomeronasal (OVN). Note-se, para os ratos menos de um mês de idade, ou se apenas interessados ​​no MOE, estes dois steps pode ser ignorada. </li><li> Segure a cabeça firmemente com uma pinça. Utilizar a alveolótomo para quebrar a porção frontal dos incisivos e da região anterior da maxila articulada entre os dois incisivos e do osso vômer. </li><li> Ruptura da porção ventral da maxila direita na região imediatamente anterior ao arco zigomática até ao nível da placa zigomática dorsal. </li><li> Virar o nariz para um ponto de vista dorsal. Use o rongeur para quebrar o anterior maxilar direito da placa zigomática dorsal. Todo o anterior maxilar direito da placa zigomática deve ser solto. Use as pinça fina para separar delicadamente qualquer tecido nasal subjacente à maxila, e em seguida, levante suavemente o fragmento de osso. </li><li> Repita os passos 2.4 e 2.5 para soltar o dente incisivo esquerdo e maxilar anterior esquerda e depois removê-los do osso nasal foi removido. </li></ol> 3. Osso nasal e Dorsal retirada da placa zigomático <ol><li> Usar o fórceps ou serrilhada o alveolótomo remover o restante dos ossos frontal apenas caudais para os ossos nasais. Depois de retirar esse pedaço de osso, a parte caudal do osso nasal pode ser tomado com a pinça. </li><li> Utilizar a alveolótomo para quebrar a porção anterior da arcada zigomática, o qual está ligado à placa zigomática. </li><li> Aqui as pinça fina na borda lateral da extremidade dorsal da placa zigomática e virar suavemente o osso e removê-lo. Se o osso não está solto, utilize o rongeur para apertá-lo suavemente para soltá-lo para remoção. </li><li> Utilizar as pinças finas ou uma lâmina de barbear para soltar o fio de sutura medial entre os ossos nasais direita e esquerda. </li><li> Use o serrilhada pinça para agarrar a extremidade caudal do osso nasal direita. Mova cuidadosamente o osso de um lado para outro para separá-lo do tecido subjacente. É útil para mover as pinças ao longo do terceiro caudal do osso nasal para mover o lado do osso para o outro. À medida que o separa do osso nasal, lentamente levantar o osso a partir da extremidade caudal. </li><li> Enquanto tele osso nasal é ligeiramente levantada, incline lateralmente o osso para revelar um afloramento laterais do osso que é forrado com tecido epitelial respiratória fina. Use uma pinça fina para libertar suavemente este tecido do osso nasal. Continue a levantar o osso nasal. Quando o osso está completamente separado do tecido subjacente, use uma tesoura para cortar o osso nasal no final rostral. </li><li> Repita os passos 3.1, 3.5 e 3.6 para a remoção de osso nasal esquerda. </li><li> Repita os passos 3.2 e 3.3 para o lado esquerdo do nariz. </li></ol> 4. Lateral retirada da placa zigomático <ol><li> Remova a placa zigomática um lado de cada vez. Ou placa zigomática pode ser removido primeiro. </li><li> Do ponto de vista ventral, quebrar o maxilar inferior do arco zigomático até a ruptura atinge o arco zigomático. </li><li> Do ponto de vista dorsal, pegue suavemente o arco zigomático e levantar a frente e lateral. Se a placa zigomática ainda está ligado a qualquer tecido, tomar a multafórceps e separam cuidadosamente as ligações entre o tecido eo osso. </li><li> Repetir para a placa zigomática no outro lado do nariz. </li></ol> 5. Orbit remoção óssea <ol><li> Do ponto de vista ventral, quebrar o osso palantine entre os molares do nariz. </li><li> Utilizar a alveolótomo para quebrar as três molares e da maxila de cada lado do nariz. </li><li> Quebrar e remover quaisquer pedaços grossos restantes do osso ventral e posterior aos cornetos em cada lado do nariz. </li></ol> 6. Remoção etmóide <ol><li> Quebrar qualquer parte do osso etmóide salientes caudal aos cornetos. Isso é necessário para evitar a perda de tecido concha ao remover partes finas do osso etmóide cobrindo os cornetos. </li><li> Para o lado direito do nariz, coloque as pinça fina na borda anterior do osso etmóide e remova-o suavemente. Se uma parte do osso permanece, repita esse procedimento até que todos osfino que cobre o osso das conchas foi removido. Os cornetos não precisa de ser retirada a maior parte das preparações. Em ratos idosos, a placa cribriforme torna-se frágil. Se cryosectioning do tecido nasal é necessário, remover pequenos pedaços da placa com uma pinça fina para reduzir o dano potencial causado pelo osso. </li><li> Repetir passo 6.2) para o lado esquerdo do nariz. </li><li> Remova todos os fragmentos de ossos restantes antes do corte. Nota: em animais com mais de um ano de idade, a região póstero do osso septo é um pouco espessa e difícil. Pode-se remover esta parte usando uma pinça fina. Inserir a ponta do fórceps para ambos os lados do osso para separar a porção dorsal do osso do septo e o forro de tecido epitelial. Use uma pinça para pegar o osso e manter o espécime. Use um outro par de fórceps para quebrar a parte superior óssea da parte inferior do septo cartilaginoso e removê-lo suavemente. </li></ol><ol><li> Configure a bomba de vácuo aspirador. </li><li> Coloque o nariz em um molde de incorporação. Submergir o nariz na mídia outubro </li><li> Usar um vácuo para remover as bolhas de ar aprisionadas no interior do tecido do nariz. Este processo leva até 5 min. </li><li> Depois de remover as bolhas de ar, definido o tecido na orientação desejada. </li><li> Congelar a outubro e de tecido no molde usando gelo seco. O tecido pode, então, ser incorporado cryosectioned imediatamente ou armazenada a -80 ° C para uso futuro. </li></ol>

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R., Restrepo, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TRPM5-expressing+microvillous+cells+in+the+main+olfactory+epithelium.">TRPM5-expressing microvillous cells in the main olfactory epithelium.</a> BMC Neurosci. 9, 114 (2008).</li><li>Ogura, T., Krosnowski, K., Zhang, L., Bekkerman, M., Lin, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemoreception+regulates+chemical+access+to+mouse+vomeronasal+organ:+role+of+solitary+chemosensory+cells.">Chemoreception regulates chemical access to mouse vomeronasal organ: role of solitary chemosensory cells.</a> PLoS One. 5, e11924 (2010).</li><li>Sathyanesan, A., Feijoo, A. A., Mehta, S. T., Nimarko, A. F., Lin, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+profile+of+G-protein+&#946;&#947;+subunit+gene+transcripts+in+the+mouse+olfactory+sensory+epithelia.">Expression profile of G-protein &#946;&#947; subunit gene transcripts in the mouse olfactory sensory epithelia.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 7, 84 (2013).</li></ol>

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Aqui, demonstramos um procedimento passo-a-passo para o isolamento de tecido olfactivo e respiratório intacto a partir do nariz do rato sequencialmente remoção dos ossos ao redor, enquanto poupando o tecido abaixo. Nós mostramos que a remoção cuidadosa de osso pode preservar até os tecidos mais delicados, na sua totalidade. Também compartilhar insights sobre possíveis modificações desta técnica, em que isolar tanto o cérebro eo tecido nariz juntos para preservar a conexão do nervo. Este novo método propor...

A cavidade nasal de mamíferos contém vários tipos de tecidos e órgãos que servem funções distintas. A cavidade nasal constitui a porção de entrada do tracto respiratório superior, o que permite viajar ar para dentro e para fora dos pulmões. Ar inalado passa através da cavidade nasal, onde é submetido a temperatura e humidade condicionado 1, bem como a limpeza ou a filtração para remover as substâncias tóxicos e irritantes e microrganismos infecciosos 2. Ambos os tratamentos são efectuados pelo epitélio nasal e subepiteliais tecidos, incluindo as glândulas e vasos e são críticos para proteger as vias aéreas inferiores e dos pulmões. Em adição ao seu papel na respiração e de defesa do epitélio, o tecido nasal também contém aparelhos sensoriais periféricos dos sistemas olfactivos e trigeminal, que detectam uma vasta gama de substâncias químicas na passagem de ar. Dependendo de qual o sistema é activado, a detecção sensorial dos produtos químicos no nariz pode provocar querum sentido de cheiro, irritação ou dor 3,4. O sistema olfativo periférica é complexo e composto de vários órgãos sensoriais olfativos anatomicamente separados dentro da cavidade nasal. Entre eles, o epitélio olfactivo principal (MOE) é o maior, o que representa cerca de 45-52% do epitélio nasal em roedores 5 e está localizado na região posterior. Na região anteroventral, existe um par de estruturas tubulares conhecidos como o órgão vomeronasal 6, que sentar-se ao longo de cada lado do septo nasal. Dois pequenos agrupamentos adicionais de neurónios sensoriais olfactivos, conhecidos como o órgão de septo de Masera 7,8 e gânglio Grüneberg 9, reside ao longo do septo ventral e dorsal da região de entrada da cavidade nasal, respectivamente. Estes órgãos periféricos conter neuro-epitélio com características distintivas em morfologia, expressão marcador celular e função fisiológica. Juntos, eles detectar milhares de odormoléculas com requintada sensibilidade 10-12. Além dos órgãos sensoriais olfactivos, na cavidade nasal também abriga outros sistemas sensoriais. Sabe-se que as fibras do nervo trigeminal peptidérgicas estão presentes no epitélio nasal, especialmente o epitélio respiratório 13,14. Algumas dessas fibras detectar produtos químicos tóxicos e irritantes e são responsáveis ​​por iniciar reflexos protetores, tais como tosse e espirros 4,15. Compostos odoríferos e amargo Irritante também pode ser detectada por uma população de células recentemente descoberto quimio solitários (SCCs), muitos dos quais são inervados por fibras nervosas trigeminais 16-19. Estes CCEs estão localizados em maior densidade na região da entrada da cavidade nasal e os dutos de entrada vomeronasal, dando a entender que eles também podem ter uma função protetora 16-18. Assim, o epitélio nasal pode variar substancialmente em função, morfologia e composição celular em função da sualocalizações anatômicas. Mesmo dentro de um epitélio único e especializado, existem diferenças regionais. O MOE é um exemplo. As linhas MOE vários cornetos, que são complicados e estruturas enrolado. Por causa deles, diferentes regiões da experiência de taxas de fluxo de ar diferentes Moe, e, portanto, diferente de difusão e taxas de depuração de moléculas de odor no ar 20. Além disso, sabe-se que os neurónios sensoriais olfactivos (ORS) que expressam um dado receptor de odor estão localizados numa das quatro zonas contornadas do MOE 21,22. Como esta diferença local afecta a resposta de um OSN a odorantes largamente não é conhecido. Além disso, algumas populações OSN exibem preferência regional. Guanilato ciclase-D (GC-D) expressando ORS têm distribuições zonais favorecendo as regiões cul-de-sac das ectoturbinates 23,24. Mais recentemente, verificou-se uma subpopulação de ORS canônicas que expressa transitória receptor potencial canal M5 (trPM5) e localiza-se preferencialmente nas regiões laterais e ventral 25. Estes resultados indicam que o MOE não é uniforme. No entanto, como estas diferenças regionais afectar codificação olfactivos não é compreendido. Isto é em parte porque a investigação aprofundada fisiológica do MOE e do nariz tem sido limitada pela dificuldade de obtenção de epitélio nasal intacto com organização anatómica preservados utilizando métodos correntes. O epitélio nasal são predominantemente cercado pelos ossos anterior do crânio, incluindo o nasal, maxila, palatino, zigomático, e os ossos etmoidais. Em camundongos adultos e outros modelos de roedores, estes ossos são duros e difíceis de remover sem danificar o tecido nasal intimamente associada, especialmente dos cornetos delicados. Muitas vezes, descalcificação de base química é utilizada para amolecer ossos para permitir cryosectioning dos tecidos nasais para morfológica, imuno-histoquímica, e em estudos de hibridação in situ, no entanto, dependendo da idade do animal, do processo de descalcificação pode durar até durante a noite a 7 ​​dias 24,26-28. Este tratamento também é limitada, porque requer tecido fixador ser preservada. Além disso, a descalcificação química pode ser dura e afetar a imunomarcação de alguns anticorpos sensíveis 29,30. Para os estudos fisiológicos, tecido vivo é necessário e, portanto, estas experiências são frequentemente executadas em ORS isoladas ou fatias de MOE obtidos a partir de recém-nascidos, cujos ossos do crânio são fina e macia 17,31,32. Estudos fisiológicos também podem utilizar os preparativos de montagem inteiros, dividindo a cabeça 25,33,34, mas geralmente apenas a superfície medial do nariz é facilmente acessível, limitando gravações fisiológicas em outras áreas. Aqui, descrevemos, um método de desossa manual do efetivo para preparar tecidos nasais intactas com organização anatómica original preservada e morfologia. Nós sequencialmente remover os principais ossos do anteriorÉ necessário crânio sob um microscópio de dissecação para expor um epitélio nasal quase inteiramente intactas, mantendo os ossos finos cornetos intacta, a menos que os ratos são muito antigas e cryosectioning. Nós também estender o método para preservar a conexão entre os tecidos nasais e bolbos olfactivos, assim como o resto do cérebro, facilitando, assim, análise simultânea dos circuitos centrais e periféricos. O método pode ser utilizado para preparar o paraformaldeído fixo, bem como fresco, tecido nasal vivo. Assim, espera-se o nosso método para facilitar estudos morfológicos, imuno-histoquímica e fisiológico da respiração, olfato e nasal danos e doenças.

<table border="1">
 <tr>
 <td>Name</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalogue Number</td>
 <td>Comments </td>
 </tr>
 <tr>
 	<td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Dissection</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Rongeur, 1.0 mm Jaw width</td>
 <td>World Precision Instruments (WPI)</td>
 <td>501333</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Fine forceps, Dumont 3 </td>
 <td>WPI</td>
 <td>503235 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Fine forceps, Dumont 55</td>
 <td>WPI</td>
 <td>14099</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Fine forceps, Dumont AA</td>
 <td>Fine Science Tools (FST)</td>
 <td>11210-20</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Specimen forceps, Serrated</td>
 <td>VWR</td>
 <td>82027-440</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Operating scissors</td>
 <td>WPI</td>
 <td>501753</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Iris scissors, Straight</td>
 <td>Miltex</td>
 <td>V95-304</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Dissection microscope</td>
 <td>Olympus</td>
 <td>SZ40</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>[header]</td>
 </tr>
 <tr>
 	<td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Tissue embedding</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Optimum cutting temperature (OCT) compound</td>
 <td>Sakura Finetek</td>
 <td>4583</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Plastic embedding mold</td>
 <td>VWR</td>
 <td>15160-215 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Aspirator vacuum pump</td>
 <td>Fisher Scientific</td>
 <td>09-960-2</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>[header]</td>
 </tr>
 <tr>
 	 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Section staining </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Neutral red</td>
 <td>ACROS Organic</td>
 <td>CAS 553-24-2</td>
 <td>Nuclei staining</td>
 </tr>
</table>

an effective manual deboning method to prepare intact mouse nasal tissue with preserved anatomical organization

O nariz de mamífero é um órgão multi-funcional com estruturas internas intrincados. A cavidade nasal é revestida com vários epitélios, tais como epitélio olfatório, respiratória e escamosas que diferem acentuadamente em localizações anatômicas, morfologia e funções. Em ratinhos adultos, o nariz é coberto com vários ossos do crânio, limitando o acesso experimental para as estruturas internas, especialmente aquelas na região posterior, tais como o epitélio olfactivo principal (MOE). Aqui nós descrevemos um método eficaz para a obtenção de quase os tecidos nasais inteiros e intactos, com organização anatômica preservada. Usando ferramentas cirúrgicas sob um microscópio de dissecação, que sequencialmente remover os ossos do crânio em torno do tecido nasal. Este procedimento pode ser realizado em ambas as cabeças de pele de rato paraformaldeído fixos e recém-dissecados. O processo de desossamento inteiro leva cerca de 20-30 minutos, o que é significativamente mais curto do que o tempo necessário para experimental convencional de química baseadacalcificação. Além disso, apresentamos um método fácil para remover as bolhas de ar presas entre os cornetos, o que é fundamental para a obtenção de seções horizontais ou coronal e sagital finas intactas desde a preparação do tecido nasal. Tecido nasal preparado utilizando o nosso método pode ser utilizado para a observação de toda a montagem de todo o epitélio, bem como características morfológicas, imunocitoquímica, de hibridação de ARN in situ e os estudos fisiológicos, especialmente em estudos onde o exame específico de região e comparação de interesse.

Usando esse método, podemos obter de forma confiável tecido nasal quase inteiramente intactas. Figura 2A mostra uma imagem de amostra nasal adulto de uma cabeça paraformaldeído fixo. Neste modelo, todas as quatro sub-órgãos sensoriais olfactivos, incluindo a, órgão MOE do septo, o gânglio Grüneberg e VNO, estão intactas. Além disso, o epitélio respiratório e tecidos subepiteliais, tais como glândulas e vasos, são preservados. Nós utilizamos com sucesso este método de uma série de estu...

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An Effective Manual Deboning Method To Prepare Intact Mouse Nasal Tissue With Preserved Anatomical Organization

Um método eficaz para Desossa manual Prepare Intacto Rato tecido nasal com organização anatômica preservada

The mammalian nose is a multi-functional organ with intricate internal structures.  The nasal cavity is lined with various epithelia such as olfactory, ...

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Research

JoVE Journal

Biology

34.5K visualizações.  University of Maryland Baltimore County. 

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In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

Human cancer and response to therapy is better represented in orthotopic animal models. This paper describes the development of an orthotopic mouse model of ovarian cancer, treatment of cancer via oral delivery of drugs, and monitoring of tumor cell behavior in response to drug treatment in real time using in vivo imaging system. In this orthotopic model, ovarian tumor cells expressing luciferase are applied topically by injecting them directly into the mouse bursa where each ovary is enclosed. Upon injection of D-luciferin, a substrate of firefly luciferase, luciferase-expressing cells generate bioluminescence signals. This signal is detected by the in vivo imaging system and allows for a non-invasive means of monitoring tumor growth, distribution, and regression in individual animals. Drug administration via oral gavage allows for a maximum dosing volume of 10 mL/kg body weight to be delivered directly to the stomach and closely resembles delivery of drugs in clinical treatments. Therefore, techniques described here, development of an orthotopic mouse model of ovarian cancer, oral delivery of drugs, and in vivo imaging, are useful for better understanding of human ovarian cancer and treatment and will improve targeting this disease.

In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

Orthotopic animal models of ovarian cancer replicate better human disease and therefore enhance our understanding of cancer progression and tumor response to therapy. A mouse model receives an intrabursal injection of luciferase-expressing ovarian tumor cells. Treatment is administered via oral gavage. Tumor growth is monitored by in vivo imaging system.

In vivo de imagens e tratamentos terapêuticos em um modelo de camundongo ortotópico de câncer de ovário

Human cancer and response to therapy is better represented in orthotopic animal models.  This paper describes the development of an orthotopic mouse model ...

Biologia

Combined Immunofluorescence and DNA FISH on 3D-preserved Interphase Nuclei to Study Changes in 3D Nuclear Organization

Fluorescent in situ hybridization using DNA probes on 3-dimensionally preserved nuclei followed by 3D confocal microscopy (3D DNA FISH) represents the most direct way to visualize the location of gene loci, chromosomal sub-regions or entire territories in individual cells. This type of analysis provides insight into the global architecture of the nucleus as well as the behavior of specific genomic loci and regions within the nuclear space. Immunofluorescence, on the other hand, permits the detection of nuclear proteins (modified histones, histone variants and modifiers, transcription machinery and factors, nuclear sub-compartments, etc). The major challenge in combining immunofluorescence and 3D DNA FISH is, on the one hand to preserve the epitope detected by the antibody as well as the 3D architecture of the nucleus, and on the other hand, to allow the penetration of the DNA probe to detect gene loci or chromosome territories 1-5. Here we provide a protocol that combines visualization of chromatin modifications with genomic loci in 3D preserved nuclei.

Here we describe a protocol for simultaneous detection of histone modifications by immunofluorescence and DNA sequences by DNA FISH followed by 3D microscopy and analyses (3D immuno-DNA FISH).

Imunofluorescência combinados e FISH DNA em 3D preservado núcleos interfásicos para estudar mudanças na organização nuclear 3D

Fluorescent in situ hybridization using DNA probes  on 3-dimensionally preserved nuclei followed by 3D confocal microscopy (3D DNA  FISH) represents the ...

Hybrid-Cut: An Improved Sectioning Method for Recalcitrant Plant Tissue Samples

Maintaining plant section integrity is essential for studying detailed anatomical structures at the cellular, tissue, or even organ level. However, some plant cells have rigid cell walls, tough fibers and crystals (calcium oxalate, silica, etc.), and high water content that often disrupt tissue integrity during plant tissue sectioning.
This study establishes a simple Hybrid-Cut tissue sectioning method. This protocol modifies a paraffin-based sectioning technique and improves the integrity of tissue sections from different plants. Plant tissues were embedded in paraffin before sectioning in a cryostat at -16 &#176;C. Sectioning under low temperature hardened the paraffin blocks, reduced tearing and scratching, and improved tissue integrity significantly. This protocol was successfully applied to calcium oxalate-rich Phalaenopsis orchid tissues as well as recalcitrant tissues such as reproductive organs and leaves of rice, maize, and wheat. In addition, the high quality of tissue sections from Hybrid-Cut could be used in combination with in situ hybridization (ISH) to provide spatial expression patterns of genes of interest. In conclusion, this protocol is particularly useful for recalcitrant plant tissue containing high crystal or silica content. Good quality tissue sections enable morphological and other biological studies.

This protocol describes a simple Hybrid-Cut tissue sectioning method that is useful for recalcitrant plant tissues. Good quality tissue sections enable anatomical studies and other biological studies including in situ hybridization (ISH).

Hybrid-Cut: Um Método Seccionamento melhorado para amostras de tecidos de plantas recalcitrante

Maintaining plant section integrity is essential for studying detailed anatomical structures at the cellular, tissue, or even organ level. However, some ...

Trans-inner Cell Mass Injection of Embryonic Stem Cells Leads to Higher Chimerism Rates

In an effort to increase efficiency in the creation of genetically modified mice via ES Cell methodologies, we present an adaptation to the current blastocyst injection protocol. Here we report that a simple rotation of the embryo, and injection through Trans-Inner cell mass (TICM) increased the percentage of chimeric mice from 31% to 50%, with no additional equipment or further specialized training. 26 different inbred clones, and 35 total clones were injected over a period of 9 months. There was no significant difference in either pregnancy rate or recovery rate of embryos between traditional injection techniques and TICM. Therefore, without any major alteration in the injection process and a simple positioning of the blastocyst and injecting through the ICM, releasing the ES cells into the blastocoel cavity can potentially improve the quantity of chimeric production and subsequent germline transmission.

Here we present a protocol to increase chimera production without the use of new equipment. A simple orientation change of the embryo for injection can increase the number of embryos produced, and potentially reduce the timeline to germline transmission.

Trans-interno pilha injeção maciça de células-tronco embrionárias leva a taxas mais elevadas de quimerismo

In an effort to increase efficiency in the creation of genetically modified mice via ES Cell methodologies, we present an adaptation to the current ...

Isolation of Intact Eyeball to Obtain Integral Ocular Surface Tissue for Histological Examination and Immunohistochemistry

Ocular surface (OS) consists of an epithelial sheet with three connected parts: palpebral conjunctiva, bulbar conjunctiva and corneal epithelium. Disruption of OS would lead to keratitis, conjunctivitis or both (keratoconjunctivitis). In experimental animal models with certain genetic modifications or artificial operations, it is useful to examine all parts of the OS epithelial sheet to evaluate relative pathogenetic changes of each part in parallel. However, dissection of OS tissue as a whole without distortion or damage has been challenging, primarily due to the softness and thinness of the OS affixed to physically separate yet movable eyelids and eyeball. Additionally, the deep eye socket formed by the hard skull/orbital bones is fully occupied by the eyeball leaving limited space for operating dissections. As a result, direct dissection of the eyeball with associated OS tissues from the facial side would often lead to tissue damages, especially the palpebral and bulbar conjunctiva. In this protocol, we described a method to remove the skull and orbital bones sequentially from a bisected mouse head, leaving eyelids, ocular surface, lens and retina altogether in one piece. The integrity of the OS sheet was well preserved and could be examined by histology or immunostaining in a single section.

This protocol describes a method for the isolation of the mouse eyeball with eyelid, ocular surface, anterior and posterior segments in relatively intact position.

Isolação do globo ocular intacto para obter o tecido integral da superfície da ocular para a examinação histológica e immunohistochemistry

Ocular surface (OS) consists of an epithelial sheet with three connected parts: palpebral conjunctiva, bulbar conjunctiva and corneal epithelium. ...

The CryoAPEX Method for Electron Microscopy Analysis of Membrane Protein Localization Within Ultrastructurally-Preserved Cells

Key cellular events like signal transduction and membrane trafficking rely on proper protein location within cellular compartments. Understanding precise subcellular localization of proteins is thus important for answering many biological questions. The quest for a robust label to identify protein localization combined with adequate cellular preservation and staining has been historically challenging. Recent advances in electron microscopy (EM) imaging have led to the development of many methods and strategies to increase cellular preservation and label target proteins. A relatively new peroxidase-based genetic tag, APEX2, is a promising leader in cloneable EM-active tags. Sample preparation for transmission electron microscopy (TEM) has also advanced in recent years with the advent of cryofixation by high pressure freezing (HPF) and low-temperature dehydration and staining via freeze substitution (FS). HPF and FS provide excellent preservation of cellular ultrastructure for TEM imaging, second only to direct cryo-imaging of vitreous samples. Here we present a protocol for the cryoAPEX method, which combines the use of the APEX2 tag with HPF and FS. In this protocol, a protein of interest is tagged with APEX2, followed by chemical fixation and the peroxidase reaction. In place of traditional staining and alcohol dehydration at room temperature, the sample is cryofixed and undergoes dehydration and staining at low temperature via FS. Using cryoAPEX, not only can a protein of interest be identified within subcellular compartments, but also additional information can be resolved with respect to its topology within a structurally preserved membrane. We show that this method can provide high enough resolution to decipher protein distribution patterns within an organelle lumen, and to distinguish the compartmentalization of a protein within one organelle in close proximity to other unlabeled organelles. Further, cryoAPEX is procedurally straightforward and amenable to cells grown in tissue culture. It is no more technically challenging than typical cryofixation and freeze substitution methods. CryoAPEX is widely applicable for TEM analysis of any membrane protein that can be genetically tagged.

This protocol describes the cryoAPEX method, in which an APEX2-tagged membrane protein can be localized by transmission electron microscopy within optimally-preserved cell ultrastructure.

O Método CrioAPEX para Análise de Microscopia Eletrônica da Localização da Proteína da Membrana dentro de células ultraestruturalmente preservadas

Key cellular events like signal transduction and membrane trafficking rely on proper protein location within cellular compartments. Understanding precise ...

Application of Passive Head Motion to Generate Defined Accelerations at the Heads of Rodents

Exercise is widely recognized as effective for various diseases and physical disorders, including those related to brain dysfunction. However, molecular mechanisms behind the beneficial effects of exercise are poorly understood. Many physical workouts, particularly those classified as aerobic exercises such as jogging and walking, produce impulsive forces at the time of foot contact with the ground. Therefore, it was speculated that mechanical impact might be implicated in how exercise contributes to organismal homeostasis. For testing this hypothesis on the brain, a custom-designed ''passive head motion'' (hereafter referred to as PHM) system was developed that can generate vertical accelerations with controlled and defined magnitudes and modes and reproduce mechanical stimulation that might be applied to the heads of rodents during treadmill running at moderate velocities, a typical intervention to test the effects of exercise in animals. By using this system, it was demonstrated that PHM recapitulates the serotonin (5-hydroxytryptamine, hereafter referred to as 5-HT) receptor subtype 2A (5-HT2A) signaling in the prefrontal cortex (PFC) neurons of mice. This work provides detailed protocols for applying PHM and measuring its resultant mechanical accelerations at rodents' heads.

The present protocol describes a custom-designed ''passive head motion'' system, which reproduces mechanical accelerations at rodents' heads generated during their treadmill running at moderate velocities. It allows dissecting mechanical factors/elements from the beneficial effects of physical exercise.

Aplicação do movimento passivo da cabeça para gerar acelerações definidas nas cabeças dos roedores

Exercise is widely recognized as effective for various diseases and physical disorders, including those related to brain dysfunction. However, molecular ...

A Mouse Model of Pulmonary Fibrosis Induced by Nasal Bleomycin Nebulization

Pulmonary fibrosis is characteristic of several human lung diseases that arise from various causes. Given that treatment options are fairly limited, mouse models continue to be an important tool for developing new anti-fibrotic strategies. In this study, intrapulmonary administration of bleomycin (BLM) is carried out by nasal nebulization to create a mouse model of pulmonary fibrosis that closely mimics clinical disease characteristics. C57BL/6 mice received BLM (7 U/mL, 30 min/day) by nasal nebulization for 3 consecutive days and were sacrificed on day 9, 16, or 23 to observe inflammatory and fibrotic changes in lung tissue. Nasal aerosolized BLM directly targeted the lungs, resulting in widespread and uniform lung inflammation and fibrosis. Thus, we successfully generated an experimental mouse model of typical human pulmonary fibrosis. This method could easily be used to study the effects of the administration of various nasal aerosols on lung pathophysiology and validate new anti-inflammatory and anti-fibrotic treatments.

<meta charset="utf8"></head><body>Um modelo de camundongo de fibrose pulmonar induzida por nebulização de bleomicina nasal

Various animal models of pulmonary fibrosis have been established using bleomycin to clarify the pathogenesis of pulmonary fibrosis and find new drug targets. However, most pulmonary fibrosis models targeting lung tissue have uneven drug administration. Here, we propose a model of uniform pulmonary fibrosis induced by nasal bleomycin nebulization.

Um modelo de camundongo de fibrose pulmonar induzida por nebulização de bleomicina nasal

Pulmonary fibrosis is characteristic of several human lung diseases that arise from various causes. Given that treatment options are fairly limited, mouse ...

Investigating Cardiac Metabolism in the Isolated Perfused Mouse Heart with Hyperpolarized [1-13C]Pyruvate and 13C/31P NMR Spectroscopy

Metabolism is the basis of important processes in cellular life. Characterizing how metabolic networks function in living tissues provides crucial information for understanding the mechanism of diseases and designing treatments. In this work, we describe procedures and methodologies for studying in-cell metabolic activity in a retrogradely perfused mouse heart in real-time. The heart was isolated in situ,&#160;in conjunction with cardiac arrest to minimize the myocardial ischemia and was perfused inside a nuclear magnetic resonance (NMR) spectrometer. While in the spectrometer and under continuous perfusion, hyperpolarized [1-13C]pyruvate was administered to the heart, and the subsequent hyperpolarized [1-13C]lactate and [13C]bicarbonate production rates served to determine, in real-time, the rates of lactate dehydrogenase and pyruvate dehydrogenase production. This metabolic activity of hyperpolarized [1-13C]pyruvate was quantified with NMR spectroscopy in a model free-manner using the product selective saturating-excitations acquisition approach. 31P spectroscopy was applied in between the hyperpolarized acquisitions to monitor the cardiac energetics and pH. This system is uniquely useful for studying metabolic activity in the healthy and diseased mouse heart.

Investigating Cardiac Metabolism in the Isolated Perfused Mouse Heart with Hyperpolarized [1-13C]Pyruvate and 13C/31P NMR Spectroscopy

We describe an experimental setup for administrating hyperpolarized 13C-labeled metabolites in continuous perfusion mode to an isolated perfused mouse heart. A dedicated 13C-NMR acquisition approach enabled the quantification of metabolic enzyme activity in real-time, and a multiparametric 31P-NMR analysis enabled the determination of the tissue ATP content and pH.

Investigando o Metabolismo Cardíaco no Coração de Rato Perfundido Isolado com Piruvato Hiperpolarizado [1-13C]Piruvato e Espectroscopia de RMN 13C/31P