Este trabalho foi financiado pela National Science Foundation-NSF IOS concessão # 1144391 a SHB.

1. Preparação de plantas <ol><li> Sementes de Arabidopsis podem ser germinadas directamente no solo ou em placas de MS. Crescer as plantas para quatro a seis semanas em câmaras de crescimento com um fotoperíodo de 12 horas (22 ° C dia, 15 ° C noite, 14). As plantas aquáticas uma a duas vezes por semana. Use a bandeja inferior para rega, não plantas aquáticas a partir do topo, permitir que as bandejas para secar antes de voltar a regar. Certifique-se que as plantas são bem hidratado no momento da colheita. </li></ol> 2. Preparação de Soluções e pratos <ol><li> K-EDTA solução 2: Fazer uma solução 100 mM de K-EDTA 2 de estoque, o qual pode ser mantido no refrigerador. No dia da recolha, dilui-se a solução de 1-5 (uma solução de EDTA a peça, quatro partes de água) para se obter uma solução a 2 20 mM de K-EDTA. </li><li> Encha um copo ou placa de Petri (diâmetro de 7-15 cm) até a metade com a solução 20 mM 2-EDTA K. Se a coleta de amostras de diferentes tratamentos (por examplo controle e plantas sal estressado ou diferentes genótipos), preparar pratos separados para cada tratamento. </li><li> Encha número desejado de tubos de reacção de 1,7 ml com 1,4 ml de solução de 2 K-EDTA 20 mM. Encher um igual número de tubos de reacção com 1,4 ml de água desionizada autoclavada ou Millipore. </li><li> Coloque as toalhas de papel no banco para definir plantas em, obter uma nova lâmina de barbear e colocar luvas. </li></ol> 3. Coleção de Floema Exsudatos (Descrito no fluxograma na Figura 1) <ol><li> Colheita folhas de roseta de quatro a seis semanas de idade, as plantas, cortando-os com a lâmina na base do pecíolo, perto do centro da roseta. </li><li> Imediatamente coloque as folhas nos pratos contendo 20 mM de K 2-EDTA. Certifique-se a extremidade cortada do pecíolo está submerso na solução (Figura 2). </li><li> Uma vez as folhas 15 terem sido recolhidos (ca. 3-4 plantas), empilhar folhas suavemente no topo de cada um dos outros tchapéu pecíolos o corte estão alinhados uns com os outros. Recorte na base dos pecíolos (cerca de 1 mm) e transferir imediatamente as folhas em um dos tubos de reacção com a solução de 2 20 mM de K-EDTA. As folhas caber mais fácil se eles estão um pouco enrolado. Evite apertar as folhas de uma vez que esta pode causar lesão de células e, portanto, leva à cobrança de conteúdo da célula folha. </li><li> Se mais material é necessário, cubra delicadamente as amostras com uma toalha de papel molhado. Use um novo conjunto de pratos se para a coleta de amostras de diferentes tratamentos ou genótipos. </li><li> Uma vez que todas as amostras são posicionados em tubos de reacção, recolhe os exsudados ou no escuro ou à luz. </li><li> Para a coleta no escuro, a linha no chão de um grande prato raso com toalhas de papel molhadas. Coloque o rack com os tubos de reacção cheias de folhas no prato e quer cobrir com toalhas de papel molhadas ou colocar em uma parte traseira de plástico preto com fendas para ventilação. Coloque toda a configuração em um armário ou um quarto escuro. </li><li> Para a coleta na luz, forrar o fundo de um recipiente de acrílico transparente com toalhas de papel molhadas. Coloque o rack com os tubos de reacção cheias de folha no recipiente e feche-o. </li><li> Após 1 hora, remover as folhas suavemente a partir do recipiente e os tubos de reacção e lava-se cuidadosamente com água destilada, desionizada ou Millipore para remover todo o EDTA. Este passo serve para três fins: (1) remove o EDTA para minimizar os danos para as células, (2) que elimina a interferência de EDTA com SDS-PAGE e cromatografia, e (3) suprime a quaisquer compostos que tenham acumulado a partir do corte / danificado células. Transferir de imediato para os tubos de reacção preparados contendo água esterilizada e voltar para os recipientes de coleta umidificado para a coleta de exsudato. Neste ponto, adicionar inibidor de RNase se o exsudado precisa de ser utilizado para a extracção de RNA. Opcional: inibidor de proteinase podem ser adicionados se a análise da proteína é desejada. </li><li> Após o tempo de coleta de intenção, retire e discard as folhas e congelar os exsudato do floema em N 2 líquido para uso posterior. Se o armazenamento prolongado é necessário, liofilizar as amostras e armazenar a -80 ° C. </li><li> No caso de Arabidopsis, metabolitos já pode ser detectado após a recolha de exsudado para 1 hr. No entanto, a coleta de 5-8 horas é aconselhável se está prevista a análise de componentes menos abundantes. Para plantas maiores, como Perilla, tempos de coleta mais longos (8 horas) são recomendados. Exsudado recolhido a partir de 15 folhas é geralmente suficiente para uma pista de um gel de SDS-PAGE (proteínas), para extracção de ARNm, GC-MS (açúcares e metabolitos). Para a análise de lipídios a partilha de 2-3 amostras (exsudato 30-45 folhas) é recomendado e leva a resultados mais claros. </li></ol> 4. Análise subseqüente (para vídeo mostramos apenas 4.4) <ol><li> Para a análise de proteínas, amostra ressuspender em 15 mL de água e 30 mL de tampão Lämmli, o calor de 95 ° C por 5 min, girar rapidamente para baixo qualquer precipitates e carrega toda a amostra num gel de SDS-PAGE (45 ul bolsos de carga). As amostras devem ser corados com Coomassie coloidal ou outras manchas sensíveis uma vez que a abundância de proteínas é muito baixa. </li><li> Por análise do açúcar e pequenas metabolito, adicionar agentes de derivatização para a amostra seca, conforme descrito na literatura 14. </li><li> ARNm podem ser analisados ​​por meio de RT-PCR, ou de microarray análise de RNA-Seq. </li><li> Para a análise de lípidos imediatamente piscina 2-3 amostras e partição contra clorofórmio: metanol (1:1), no exaustor de fumos, como se segue: adicionar uma quantidade igual de clorofórmio: metanol a cada amostra, vortex durante alguns segundos, e centrifuga-se durante 4 min a 400 x g. Recolher a fase inferior (orgânico) em um tubo de vidro com tampa de teflon e partição repita com a fase superior mais três vezes. Secar as fases orgânicas reunidas sob um fluxo de N 2 e se submeter a uma análise mais aprofundada (cromatografia em camada fina: TLC 14, 37; espectrometria de cromatografia de massa líquida: LMS C-14). </li></ol>

Não temos nada a divulgar.

A recolha de EDTA-facilitada de floema exsudados é muito simples, necessita de equipamentos mínima, e é aplicável para a maioria das plantas. Em geral, este método aumenta a capacidade para analisar exsudato floema de mais espécies. Embora o exsudado é diluída, é fácil de recolher muitas amostras diferentes ou a partir de muitas plantas de escala até uma grande quantidade de material. Isto permite então que para a detecção de novos compostos que são em muito baixa abundância e, de outro modo ser ignorada. Este método pode ser usado para várias espécies de plantas e funciona como descrito para os listados neste manuscrito. Se novas espécies são exploradas, os dois aspectos que podem precisar de modificação são o número de folhas usadas eo tempo de exsudação. Na maioria dos casos, de cinco a oito horas de exsudação deve ser apropriada. Para confirmar a utilização deste método para uma nova espécie de planta, exsudado precisam de ser recolhidos e um ou mais de a análise subsequente tal como descrito no protocolo da peça 4 nEEDS a ser executada. Dependendo da intensidade do sinal observado, o volume de recolha pode precisar de ser melhorados. Em geral, os lípidos e análise de proteínas requer mais material do que a análise de açúcar e metabolito desde as primeiras são menos abundantes no floema exsudados. Porque a recolha de exsudado EDTA facilitada envolve superfícies de corte, bem como um efeito potencialmente nocivo de EDTA, vários pontos tem que ser considerados: (1) após a incubação de uma hora com EDTA, os pecíolos têm de ser lavados. Isto remove os compostos obtidos a partir de células feridas, bem como a própria EDTA, o que poderia danificar as células ou interferir com a extracção. (2) Para os controlos positivos e negativos devem ser incluídos para assegurar que os dados obtidos são derivados de seiva floema e não a partir de células lesadas (ver passos críticos abaixo). (3) Floema seiva contém várias enzimas, que poderiam ser ativo durante a coleta de exsudato. Assim, em alguns casos, pode ser útil para recolher for diferentes quantidades de tempo. (4) Uma vez que o método envolveu a exsudação em água, a uma quantificação absoluta dos compostos não é possível. Etapas críticas: A chave para o sucesso do uso deste método é o uso de cautela ao manusear a amostra para não ferir as células, bem como o uso de controles apropriados (ver ref 14.). Um controle adequado é a coleção de floema exsudato sem tratamento prévio com EDTA. Neste caso, o floema vedará si e nenhum exsudado pode ser recolhido. Quaisquer compostos contaminantes provenientes das células feridos será detectado aqui. Um segundo controlo seja a análise de açúcares no exsudado. Na Arabidopsis, a sacarose deve ser o metabolito predominante na seiva floema, com sacarose, frutose a proporção de 01:04 - 01:08 (Ref. 8, 14). Para extracção de RNA é necessária a utilização de um inibidor de RNAse. Além disso, um controlo positivo de anteriormente descrevendoed mRNA floema localizada (Ubc9: Ubiquitin enzima conjugante 9, At4g27960, 8, 14) e um controle negativo de, por exemplo, um mRNA cloroplasto (Rubisco LSU) são aconselháveis. Como o exsudado contém enzimas activas, um curso de tempo é aconselhável fazer alterações no perfil certo floema não são simplesmente devido a variações no tempo de recolha. Em alguns casos, pode ser benéfico utilizar os inibidores de proteases. No entanto, os investigadores precisam ter em mente, que o exsudato coletado será concentrada e que os compostos adicionados será em grande parte concentrada. Um segundo passo crítico no âmbito do protocolo é o recutting do pecíolo em EDTA. Este passo serve um propósito duplo: Em primeiro lugar, são removidos todos os pratos perfurados selado, evitando a formação de novas velas permitindo assim o livre fluxo da seiva floema. Segunda, ele remove a bolha de cavitação no xilema gerado durante o corte e, assim, permite o transporte do xilema. O tamanho do segundo corte dependems de plantas utilizadas. Em plantas com pecíolos maiores deve ser de vários milímetros (superior a 1 cm) sobre o primeiro corte, de plantas como a Arabidopsis, são suficientes 1-2 mm. A utilização deste método pode conduzir à descoberta de novos compostos em exsudatos do floema que poderiam ter de sinalização, de desenvolvimento ou implicações biomédicas. Ele levou um olhar mais aprofundado na sinalização de lipídios de longa distância, o que era um campo pouco estudado dentro da ciência da planta, devido à falta de acesso ao floema.

As plantas não podem mover-se para escapar condições adversas. Conseqüentemente, eles tiveram que desenvolver mecanismos para detectar estresses ambientais, obter e transmitir um sinal relacionado com toda a planta, e ajustar o desenvolvimento em conformidade. Existem dois sistemas de transporte para a distribuição de água, nutrientes e outros compostos (sinalização). O primeiro é o xilema; que normalmente transporta água e sais minerais absorvidos pelas raízes ao longo da planta. A segunda é o floema. O ponto de vista do floema mudou de uma simples assimilar sistema de transporte para um canal de RNA, proteínas, vírus, lipídios e outras moléculas pequenas. Ela desempenha um papel importante no transporte de nutrientes e assimilar, a resposta ao stress abiótico e biótico, bem como no crescimento e desenvolvimento da planta. Ele agora é chamado de &quot;superestrada da informação&quot; da planta 18. O floema é constituído por vários tipos de células: parênquima do floema, bem como acompanhante especializado cells e elementos peneira. O elemento de peneira é o local de movimento de longa distância. Para permitir o fluxo longitudinal desobstruída, elementos crivados estão faltando a maioria das organelas, bem como núcleos e são pensados ​​para conter, no máximo, um mecanismo de translação limitado 21, 33. Acredita-se que as células de companhia sintetizar proteínas e outros compostos, que circulam na corrente de floema. Estes compostos são, em seguida, transportados para o elemento de crivo através plasmodesmata e pode funcionar como sinais de longa distância 4,16. Vários grupos de compostos podem ser encontrados em exsudatos floema: <ul><li> Os açúcares são muitas vezes os produtos da fotossíntese e são transportados como &quot;portadores de energia&quot; moléculas para outras partes da planta para armazenamento ou como blocos de construção. No entanto, eles também podem funcionar como anti-congelante, ou como compostos de sinalização. </li><li> As proteínas também podem ser encontrados em exsudados de floema. Eles incluem enzimas metabólicas, mas também têm a função de sinalização. Uma example de uma proteína, que serve como um sinal de desenvolvimento é o lócus de florescência proteína T, o que sinaliza a indução da floração, bem como a queda das folhas em plantas sazonal 6. </li><li> Os ácidos nucleicos que estão presentes em exsudatos do floema, sob a forma de ARNm, pequenas e micro RNAs e RNAs virais. Eles parecem ser amplamente envolvido na sinalização 27, 28, 39. Ao mesmo tempo, rRNA e tRNA para quase todos os aminoácidos foram observados na seiva floema de cucurbitáceas 42. Parecem ser selectivamente transferido para o sistema de tubo de peneira. Os tRNAs mostram as modificações necessárias para a capacidade de transferência de aminoácidos para o aparelho de translação. No entanto, em vez de participar na tradução, que aparecem para inibir este processo. Alternativamente, eles poderiam servir como uma fonte de citocinina ou sinalizar o estado metabólico da planta 42. </li><li> Ácidos gordos oxylipins e outros lípidos também foram encontrados no floema exsudados 3, 13, 14, 23. Jasmoácido nic, um oxylipin se move através do floema, como parte da resposta à infecção pelo patógeno 22, 29, 31, 32. Embora o papel da maioria dos lípidos floema ainda não é claro, algumas delas provavelmente têm função de sinalização 4. </li></ul> O desafio de trabalhar com o floema planta reside na sua capacidade de selar-se sobre o ferimento. Existem quatro principais métodos utilizados para recolher floema exsudato, mas eles só funcionam em selecionar espécies: 1) Em cucurbitáceas é possível obter quantidades razoáveis ​​de floema de exsudado através de cortes do pecíolo. Uma vez que a queda inicial de contaminação de células lesionadas é removido, é possível obter grandes quantidades de razoavelmente pura seiva floema 1, 15. No entanto, com o aumento do tempo de recolha, este exsudado engrossa, tornando-se cada vez inadequados para abordagens de cromatografia líquida (não publicados). Publicações recentes sugerem, que, dependendo das espécies, isto é seiva floema derivado either o fascículo (PF) ou o extrafascicular floema (PE) e que, ao mesmo tempo que contém &quot;móvel&quot; seiva floema dos elementos de peneira (PF), que é também propensas à contaminação a partir de outros tipos de células, incluindo o xilema 40, 41 . 2) A segunda abordagem é a obtenção de floema a seiva através de cortes rasos ou furos no caule ou pecíolo. Este método tem sido utilizado com sucesso no tremoço 17, 25, 36 cucurbitáceas, Brassica napus e 12. Aqui, a contaminação a partir de células lesionadas é mínima e que os exsudados muito puro. No entanto, as plantas precisam de ser saudável e bem regada, pois é muito desafiador para perfurar seletivamente apenas os elementos crivados. Se vasos do xilema são cortados, todos exsudato é atraído para o fluxo do xilema. Isso faz com que o método inadequado para as plantas com pecíolos e hastes muito frágeis ou altamente lignificado. 3) stylectomy pulgão permite pulgões para inserir seu estilete para os elementos crivados an removendo o pulgão com um laser. Floema seiva é exalava através do restante estilete 2, 9, 10, 35, 38. Em teoria, qualquer planta que pode ser infectada pelos pulgões podem ser usadas para esta abordagem. No entanto, a maioria estufa ou gerentes câmara de crescimento não vai apoiar o uso de um patógeno. Além disso, os pulgões introduzir várias proteínas no floema com a saliva 19, 33. Isto conduz a uma transcrição limitado reprogramação 30 e tem o potencial de alterar a composição do floema 26. 4) O método descrito aqui é o EDTA-exsudação facilitada de seiva floema. Este método emprega EDTA para impedir a selagem do floema 20. Quelatos de EDTA de Ca 2 + que os iões que participam nos processos de outro modo que o selo do floema. Embora o EDTA pode levar a danos nas células 30, vários grupos têm utilizado este método e observou qualquer efeito adverso de concentrações de EDTA 10 mM a 20 mM na ultra-estrutura celular, ou na phloem carregamento e transporte 5, 24. Para reduzir o efeito prejudicial assim como interferências de EDTA, com cromatografia e electroforese em gel, as plantas são movidas para a água depois de 1 h, e apenas a parte posterior do exsudado é usada 14. Assim, em vez de exsudação em EDTA, floema é exsudado em água (EDTA facilitada exsudação). É um método simples e direta, de baixo custo e baixa tecnologia para a coleta de exsudato do floema. Seiva floema obtido desta forma pode ser utilizado para analisar as proteínas, moléculas pequenas, lípidos, e RNAs e tem sido utilizado com sucesso em muitas plantas. Embora uma quantidade limitada de experiências foi realizado em 11 de monocotiledóneas, o método parece ser mais adequado para dicots Perilla (17, 20, Arabidopsis 8, 13, 14, Álamo 7). Coleção de exsudato tem que ocorrer em um ambiente úmido para evitar a perda de exsudato através da transpiração. Consoante a planta, a incubação em EDTA para uma a duas horas ésuficiente para prevenir a vedação dos elementos de floema / peneira. A coleção pode ocorrer na água. Isto tem a vantagem de evitar o efeito negativo sobre o EDTA tem a estrutura celular e estabilidade. Também elimina a interferência de EDTA, com métodos como HPLC ou SDS-PAGE. Ele é mostrado como ele se aplica a Arabidopsis. Para plantas maiores, incubação em EDTA e exsudato colecções tem que ser aumentado e é realizado em provetas em vez de tubos de reacção de 1,7 ml.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="638">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:153px;">K2-EDTA</td>
			<td style="width:152px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:111px;">ED2P-500G</td>
			<td style="width:223px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:153px;">Shallow Glass or plastic Petri Dish (7-15 cm)</td>
			<td>PYREX or Corning</td>
			<td></td>
			<td>Any clean, shallow dish will work</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Chloroform</td>
			<td>EMD</td>
			<td>CX1054-1</td>
			<td style="width:223px;">Only open containers in fume hood</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Methanol</td>
			<td style="width:152px;">J.T.Baker</td>
			<td style="width:111px;">9070-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:153px;">Screw cap tubes</td>
			<td style="width:152px;">VWR International</td>
			<td style="width:111px;">53283-800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:153px;">Screw cap tubes</td>
			<td style="width:152px;">Sun Sri</td>
			<td style="width:111px;">13-425</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:153px;">Eppendorf tubes</td>
			<td style="width:152px;">Denville</td>
			<td style="width:111px;">C2170</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

collection and analysis of arabidopsis phloem exudates using the edta-facilitated method

O floema da planta é essencial para o transporte de longa distância de (foto-) assimila, bem como de transmissão de sinais de estresse biótico ou abiótico. Ele contém açúcares, aminoácidos, proteínas, lípidos, RNA e outros metabolitos. Enquanto existe um grande interesse no entendimento da composição e função do floema, o papel de muitas destas moléculas e, assim, a sua importância no desenvolvimento das plantas e de resposta ao estresse ainda tem de ser determinado. Um obstáculo para a análise floema reside no facto de que as vedações floema ferindo-se sobre. Como resultado, o número de plantas a partir de seiva floema que podem ser obtidos é limitada. Um método que permite a recolha de floema exsudados de várias espécies de plantas sem equipamento adicional é a recolha de exsudado floema EDTA facilitada descrito aqui. Embora seja fácil de utilizar, embora promova o ferimento de células e cuidado deve ser tomado para remover o conteúdo das células danificadas. Além disso, os vários controlos para comprovar a pureza do exsudadosão necessárias. Porque é uma exsudação ao invés de uma recolha directa de seiva do floema (não é possível em muitas espécies) só quantificação relativa de seus conteúdos podem ocorrer. A vantagem deste método é que, sobre os outros, pode ser usada em muitas espécies de plantas herbáceas ou lenhosas (Perilla, Arabidopsis, choupo, etc), e requer equipamento e formação mínima. Isso leva a uma razoavelmente grandes quantidades de exsudados que podem ser utilizados para a análise subsequente das proteínas, açúcares, lípidos, RNA, vírus e metabolitos. É suficientemente simples que pode ser usado tanto em uma investigação, bem como num laboratório de ensino.

Tornou-se claro nos últimos anos que a complexidade do floema a seiva pode ser a resposta para a pergunta de como as plantas enviar vários sinais de desenvolvimento e estresse para a resposta ideal. Usando EDTA facilitada floema exsudação pode fornecer a oportunidade de analisar exsudato do floema de plantas que não são adequados para outras abordagens, mas pode ser de interesse económico ou fisiológicos. Este método permite a colheita de floema suficiente exsudados para identificar proteínas floema-localizadas e detectar alterações no seu nível em resposta ao desenvolvimento ou stress (Figura 3). Como mostra a figura, as proteínas são de muito baixa abundância, ainda, o seu nível é alto o suficiente para experimentos de proteômica subsequentes usando LC-MS/MS ou para análise de Western blot. Constatações cucurbitáceas sugerem que o corte do caule leva a uma perturbação do equilíbrio do potencial hídrico e um influxo de água e subsequentepossíveis contaminantes no apoplasto 41. No entanto, para os tempos de recolha que variam de um a oito horas não afecta o perfil de floema de proteína / composição em Arabidopsis (. Apenas a quantidade absoluta varia Guelette et ai), a quantidade de proteína recolhidas e o padrão de proteínas encontradas varia entre espécies (Arabidopsis: Na; Perilla, pista I e NI) e tratamentos (Perilla crescido em diferentes comprimentos de dia, pista I e NI). Como sinais proteicas resultado pode ser visualizado, identificados e seguidos. mRNA e micro RNAs também podem ser identificados no floema exsudados por este método. No entanto, é necessária para impedir a degradação do ARNm durante o tempo prolongado de tratamento com exsudação inibidor de RNAse. Uma vez que os elementos de peneira não contêm cloroplastos funcionais, Rubisco pequena ou grande subunidade (rbcS ou RbCl, respectivamente), os mRNAs podem ser utilizados como controlos negativos, enquanto conhecido floemaLocalizada mRNA de enzima do tipo de conjugação de ubiquitina pode ser utilizado como um controlo positivo (Figura 4). Do mesmo modo, açúcares ou de pequenos metabolitos, podem ser analisados ​​utilizando GC-MS ou LC-MS. Aqui deve-se mencionar que as exsudações do floema contêm um grande número de enzimas funcionais, incluindo quase toda a via glicolítica 12. Assim, usando vários pontos de tempo pode revelar processos metabólicos durante a coleta de exsudato. Um exemplo é mostrado na Figura 5: Em todos os exsudados, a sacarose é o metabólito mais abundante, o que é mais evidente depois de um conjunto durante 1 hora. No entanto, depois de cinco horas a sacarose em relação a frutose é ligeiramente reduzida. Se a mesma exsudado é recolhido durante uma hora e deixado na bancada durante as quatro horas seguintes, a sacarose, a frutose razão é reduzida a uma amplitude muito maior, o que sugere que as enzimas activas do floema exsudados levam a uma degradação da sacarose na sala tempetura (para mais interpretações pico ver 14). Isto é consistente com os resultados que floema carregamento e transporte de moléculas a partir de células de companhia para os elementos crivados podem continuar durante a exsudação até que o sistema perde sua vitalidade 34. Lipídios no exsudato do floema e, por extensão, a sinalização de lipídios de longa distância é um campo relativamente recente de interesse na ciência das plantas. Devido à sua natureza hidrofóbica lípidos só estão presentes em baixas concentrações e pode ser ligado a outras moléculas para solubilização. No entanto, a exsudação EDTA facilitada permite a recolha de material suficiente para visualizar (TLC; Figura 6) e identificação (LC-MS, a Figura 7) floema lípidos partir de várias espécies de plantas. Como a figura mostra que é possível identificar e separar várias espécies de lípidos. LC-MS permite identificar diferentes espécies de lipídios e monitorar as alterações no perfil lipídico dos diferegenótipos NT ou tratamentos. Isto permite o estudo da função dos lípidos durante o desenvolvimento da planta e a resposta ao estresse. <img alt="Figura 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51111/51111fig1.jpg" width="600px" /> Figura 1. Fluxograma da coleta de exsudato do floema de Arabidopsis ou Perilla. Caminhos diferentes levam a diferentes produtos finais, que são indicados em azul. Para a preparação de RNA, inibidor de RNAse (100 U / mL, Roche), é adicionado à água em que o exsudado é recolhido floema. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51111/51111fig1highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver a imagem ampliada</a> . <img alt="Figura 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51111/51111fig2.jpg" width="600px" /> Figura 2. Instalação de materiais para floema exsudato recolheríons. A instalação exibe todos os materiais necessários para o protocolo passos 3,1-3,4. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51111/51111fig2highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver a imagem ampliada</a> . <img alt="Figura 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51111/51111fig3.jpg" width="600px" /> . Figura 3 proteínas encontradas no floema exsudados de duas espécies diferentes de plantas, de Arabidopsis (a) e (Perilla I e NI; diferentes comprimentos de dia); MW: marcador de peso molecular (pista 2). As proteínas foram separadas utilizando um gradiente de 10-20% de SDS-PAGE. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51111/51111fig3highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver a imagem ampliada</a> . <img alt="Figura 4" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51111/51111fig4.jpg" width="600px" /> Figura 4. Análiseda presença de ARNm de Rubisco pequeno e grande subunidade (rbcS e rbcL, respectivamente) e de enzima de conjugação de ubiquitina (UBC). mRNA foram coletados a partir de folhas de Arabidopsis (L), pecíolos (P), e exsudados do floema (Ph), reverter transcrições transcritas e específicas visualizadas usando PCR. A figura foi modificado a partir do Guelette et al. 14. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51111/51111fig4highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver a imagem ampliada</a> . <img alt="Figura 5" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51111/51111fig5.jpg" width="600px" /> Figura GC-MS perfil de floema 5. Exsudatos recolhidos para uma quantidade diferente de vezes. Note-se como a quantidade relativa de modificações de sacarose a partir de uma colecção horas (A) e 5 horas de tempo de colheita (B). Exsudato perfil após a coleta por 1 hora, seguido de &quot;incubação&quot; no quarto<html> temperatura ambiente (RT) durante quatro horas (C). Folha perfil metabólito (D). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51111/51111fig5highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver a imagem ampliada</a> . <img alt="Figura 6" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51111/51111fig6.jpg" width="600px" /> Figura 6. Camada fina cromatograma comparando lipídios de Perilla (esquerda) e folhas de Arabidopsis (direita) e exsudados do floema. Os asteriscos indicam os lipídios específicos para floema exsudato. DGDG: digalactosildiacilglicerol; PG: phosphatidylglycerol; MGDG: monogalactosyldiacyglycerol, a parte da figura exibindo lipídios Arabidopsis tenha sido modificado a partir Guelette et al 14.. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51111/51111fig6highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver a imagem ampliada</a> . nt &quot;fo: manter-together.within-page =&quot; always &quot;&gt; <img alt="Figura 7" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51111/51111fig7.jpg" width="600px" /> Figura 7. Perfil lipídico de floema exsudatos de Arabidopsis (fase de clorofórmio) usando o modo de íons negativos LC-MS /. Os gráficos da parte superior (mutante, A) e inferior (de tipo selvagem, B) mostram as diferenças nos perfis lipídicos entre dois genótipos diferentes (indicado pelas setas). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51111/51111fig7highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver a imagem ampliada</a> .

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Collection and Analysis of Arabidopsis Phloem Exudates Using the EDTA-facilitated Method

O conhecimento da composição da seiva floema, bem como o seu mecanismo de carregamento e de longa distância de transporte é essencial para a compreensão de sinalização de longa distância no desenvolvimento das plantas e stress / agente patogénico e da resposta assimilar transporte. Este manuscrito descreve a recolha de exsudados do floema, utilizando o método de EDTA-facilitada.

Coleta e análise de<em&gt; Arabidopsis</em&gt; Floema exsudados Usando o método EDTA facilitada

The plant phloem is essential for the long-distance transport of (photo-) assimilates as well as of signals conveying biotic or abiotic stress. It ...

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Collection and Analysis of Arabidopsis Phloem Exudates Using the EDTA-facilitated Method

Complexometric Titration, Precipitation Titration, and Gravimetry

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24.2K visualizações.  Michigan State Universtiy.  O conhecimento da composição da seiva floema, bem como o seu mecanismo de carregamento e de longa distância de transporte é essencial para a compreensão de sinalização de longa distância no desenvolvimento das plantas e stress / agente patogénico e da resposta assimilar transporte. Este manuscrito descreve a recolha de exsudados do floema, utilizando o método de EDTA-facilitada. 

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A Simple Method for Imaging Arabidopsis Leaves Using Perfluorodecalin as an Infiltrative Imaging Medium

The problem of acquiring high-resolution images deep into biological samples is widely acknowledged1. In air-filled tissue such as the spongy mesophyll of plant leaves or vertebrate lungs further difficulties arise from multiple transitions in refractive index between cellular components, between cells and airspaces and between the biological tissue and the rest of the optical system. Moreover, refractive index mismatches lead to attenuation of fluorophore excitation and signal emission in fluorescence microscopy. We describe here the application of the perfluorocarbon, perfluorodecalin (PFD), as an infiltrative imaging medium which optically improves laser scanning confocal microscopy (LSCM) sample imaging at depth, without resorting to damaging increases in laser power and has minimal physiological impact2. We describe the protocol for use of PFD with Arabidopsis thaliana leaf tissue, which is optically complex as a result of its structure (Figure 1). PFD has a number of attributes that make it suitable for this use3. The refractive index of PFD (1.313) is comparable with that of water (1.333) and is closer to that of cytosol (approx. 1.4) than air (1.000). In addition, PFD is readily available, non-fluorescent and is non-toxic. The low surface tension of PFD (19 dynes cm-1) is lower than that of water (72 dynes cm-1) and also below the limit (25 - 30 dyne cm-1) for stomatal penetration4, which allows it to flood the spongy mesophyll airspaces without the application of a potentially destructive vacuum or surfactant. Finally and crucially, PFD has a great capacity for dissolving CO2 and O2, which allows gas exchange to be maintained in the flooded tissue, thus minimizing the physiological impact on the sample. These properties have been used in various applications which include partial liquid breathing and lung inflation5,6, surgery7, artificial blood8, oxygenation of growth media9, and studies of ice crystal formation in plants10. Currently, it is common to mount tissue in water or aqueous buffer for live confocal imaging. We consider that the use of PFD as a mounting medium represents an improvement on existing practice and allows the simple preparation of live whole leaf samples for imaging.

A Simple Method for Imaging Arabidopsis Leaves Using Perfluorodecalin as an Infiltrative Imaging Medium

We describe the use of perfluorodecalin as an infiltrative mounting medium. This is a simple method for improving depth of imaging in Arabidopsis thaliana leaf tissue with minimal physiological impact.

Um método simples para criação de imagens Arabidopsis Folhas Usando Perfluorodecalin como um meio de imagem infiltrativas

The problem of acquiring high-resolution images deep into biological samples is widely acknowledged1. In air-filled tissue such as the spongy mesophyll of ...

Biologia

Cell Specific Analysis of Arabidopsis Leaves Using Fluorescence Activated Cell Sorting

After initiation of the leaf primordium, biomass accumulation is controlled mainly by cell proliferation and expansion in the leaves1. However, the Arabidopsis leaf is a complex organ made up of many different cell types and several structures. At the same time, the growing leaf contains cells at different stages of development, with the cells furthest from the petiole being the first to stop expanding and undergo senescence1. Different cells within the leaf are therefore dividing, elongating or differentiating; active, stressed or dead; and/or responding to stimuli in sub-sets of their cellular type at any one time. This makes genomic study of the leaf challenging: for example when analyzing expression data from whole leaves, signals from genetic networks operating in distinct cellular response zones or cell types will be confounded, resulting in an inaccurate profile being generated.
To address this, several methods have been described which enable studies of cell specific gene expression. These include laser-capture microdissection (LCM)2 or GFP expressing plants used for protoplast generation and subsequent fluorescence activated cell sorting (FACS)3,4, the recently described INTACT system for nuclear precipitation5 and immunoprecipitation of polysomes6.
FACS has been successfully used for a number of studies, including showing that the cell identity and distance from the root tip had a significant effect on the expression profiles of a large number of genes3,7. FACS of GFP lines have also been used to demonstrate cell-specific transcriptional regulation during root nitrogen responses and lateral root development8, salt stress9 auxin distribution in the root10 and to create a gene expression map of the Arabidopsis shoot apical meristem11. Although FACS has previously been used to sort Arabidopsis leaf derived protoplasts based on autofluorescence12,13, so far the use of FACS on Arabidopsis lines expressing GFP in the leaves has been very limited4. In the following protocol we describe a method for obtaining Arabidopsis leaf protoplasts that are compatible with FACS while minimizing the impact of the protoplast generation regime. We demonstrate the method using the KC464 Arabidopsis line, which express GFP in the adaxial epidermis14, the KC274 line, which express GFP in the vascular tissue14 and the TP382 Arabidopsis line, which express a double GFP construct linked to a nuclear localization signal in the guard cells (data not shown; Figure 2). We are currently using this method to study both cell-type specific expression during development and stress, as well as heterogeneous cell populations at various stages of senescence.

Cell Specific Analysis of Arabidopsis Leaves Using Fluorescence Activated Cell Sorting

A method for producing Arabidopsis leaf protoplasts that are compatible with fluorescence activated cell sorting (FACS), allowing for studies of specific cell populations. This method is compatible with any Arabidopsis line that expresses GFP in a subset of cells.

Análise de célula específico<em&gt; Arabidopsis</em&gt; Folhas utilizando ordenação células activadas por fluorescência

After initiation of the leaf primordium, biomass accumulation is controlled mainly by cell proliferation and expansion in the leaves1. However, the ...

An Efficient Method for Quantitative, Single-cell Analysis of Chromatin Modification and Nuclear Architecture in Whole-mount Ovules in Arabidopsis

In flowering plants, the somatic-to-reproductive cell fate transition is marked by the specification of spore mother cells (SMCs) in floral organs of the adult plant. The female SMC (megaspore mother cell, MMC) differentiates in the ovule primordium and undergoes meiosis. The selected haploid megaspore then undergoes mitosis to form the multicellular female gametophyte, which will give rise to the gametes, the egg cell and central cell, together with accessory cells. The limited accessibility of the MMC, meiocyte and female gametophyte inside the ovule is technically challenging for cytological and cytogenetic analyses at single cell level. Particularly, direct or indirect immunodetection of cellular or nuclear epitopes is impaired by poor penetration of the reagents inside the plant cell and single-cell imaging is demised by the lack of optical clarity in whole-mount tissues.
Thus, we developed an efficient method to analyze the nuclear organization and chromatin modification at high resolution of single cell in whole-mount embedded Arabidopsis ovules. It is based on dissection and embedding of fixed ovules in a thin layer of acrylamide gel on a microscopic slide. The embedded ovules are subjected to chemical and enzymatic treatments aiming at improving tissue clarity and permeability to the immunostaining reagents. Those treatments preserve cellular and chromatin organization, DNA and protein epitopes. The samples can be used for different downstream cytological analyses, including chromatin immunostaining, fluorescence in situ hybridization (FISH), and DNA staining for heterochromatin analysis. Confocal laser scanning microscopy (CLSM) imaging, with high resolution, followed by 3D reconstruction allows for quantitative measurements at single-cell resolution.

An Efficient Method for Quantitative, Single-cell Analysis of Chromatin Modification and Nuclear Architecture in Whole-mount Ovules in Arabidopsis

We provide here an efficient and reliable protocol for immunostaining, Fluorescence in&#160;situ Hybridization, DNA staining followed by quantitative, high-resolution imaging in whole-mount Arabidopsis thaliana ovules. This method was successfully used to analyze chromatin modifications and nuclear architecture.

Um método eficiente para Quantitativa, Análise de células Único de cromatina Modificação e Arquitetura Nuclear em Todo-mount óvulos em<em&gt; Arabidopsis</em

In flowering plants, the somatic-to-reproductive cell fate transition is marked by the specification of spore mother cells (SMCs) in floral organs of the ...

Detection and Analysis of DNA Damage in Mouse Skeletal Muscle In Situ Using the TUNEL Method

Terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) deoxyuridine triphosphate (dUTP) nick end labeling (TUNEL) is the method of using the TdT enzyme to covalently attach a tagged form of dUTP to 3&#8217; ends of double- and single-stranded DNA breaks in cells. It is a reliable and useful method to detect DNA damage and cell death in situ. This video describes dissection, tissue processing, sectioning, and fluorescence-based TUNEL labeling of mouse skeletal muscle. It also describes a method of semi-automated TUNEL signal quantitation. Inherent normal tissue features and tissue processing conditions affect the ability of the TdT enzyme to efficiently label DNA. Tissue processing may also add undesirable autofluorescence that will interfere with TUNEL signal detection. Therefore, it is important to empirically determine tissue processing and TUNEL labeling methods that will yield the optimal signal-to-noise ratio for subsequent quantitation. The fluorescence-based assay described here provides a way to exclude autofluorescent signal by digital channel subtraction. The TUNEL assay, used with appropriate tissue processing techniques and controls, is a relatively fast, reproducible, quantitative method for detecting apoptosis in tissue. It can be used to confirm DNA damage and apoptosis as pathological mechanisms, to identify affected cell types, and to assess the efficacy of therapeutic treatments in vivo.

Detection and Analysis of DNA Damage in Mouse Skeletal Muscle In Situ Using the TUNEL Method

This video describes dissection, tissue processing, sectioning, and fluorescence-based TUNEL labeling of mouse skeletal muscle. It also describes a method for semi-automated analysis of TUNEL labeling.

Detecção e análise de danos no DNA em Rato Músculo Esquelético<em&gt; In Situ</em&gt; Usando o método TUNEL

Terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) deoxyuridine triphosphate (dUTP) nick end labeling (TUNEL) is the method of using the TdT enzyme to covalently ...

Standardized Method for High-throughput Sterilization of Arabidopsis Seeds

Arabidopsis thaliana (Arabidopsis) seedlings often need to be grown on sterile media. This requires prior seed sterilization to prevent the growth of microbial contaminants present on the seed surface. Currently, Arabidopsis seeds are sterilized using two distinct sterilization techniques in conditions that differ slightly between labs and have not been standardized, often resulting in only partially effective sterilization or in excessive seed mortality. Most of these methods are also not easily scalable to a large number of seed lines of diverse genotypes. As technologies for high-throughput analysis of Arabidopsis continue to proliferate, standardized techniques for sterilizing large numbers of seeds of different genotypes are becoming essential for conducting these types of experiments. The response of a number of Arabidopsis lines to two different sterilization techniques was evaluated based on seed germination rate and the level of seed contamination with microbes and other pathogens. The treatments included different concentrations of sterilizing agents and times of exposure, combined to determine optimal conditions for Arabidopsis seed sterilization. Optimized protocols have been developed for two different sterilization methods: bleach (liquid-phase) and chlorine (Cl2) gas (vapor-phase), both resulting in high seed germination rates and minimal microbial contamination. The utility of these protocols was illustrated through the testing of both wild type and mutant seeds with a range of germination potentials. Our results show that seeds can be effectively sterilized using either method without excessive seed mortality, although detrimental effects of sterilization were observed for seeds with lower than optimal germination potential. In addition, an equation was developed to enable researchers to apply the standardized chlorine gas sterilization conditions to airtight containers of different sizes. The protocols described here allow easy, efficient, and inexpensive seed sterilization for a large number of Arabidopsis lines.

The objective of this study was to determine the effects of bleach and chlorine gas sterilization on seed germination of a range of Arabidopsis genotypes grown on sterile media. Optimized sterilization protocols have been developed to prevent the growth of microbial contaminants while providing satisfactory seed survival.

Método padronizado para a esterilização da elevado-produção de sementes de Arabidopsis

Arabidopsis thaliana (Arabidopsis) seedlings often need to be grown on sterile media. This requires prior seed sterilization to prevent the growth of ...

A Versatile Method for Mounting Arabidopsis Leaves for Intravital Time-lapse Imaging

The plant immune response associated with a genome-wide transcriptional reprogramming is initiated at the site of infection. Thus, the immune response is regulated spatially and temporally. The use of a fluorescent gene under the control of an immunity-related promoter in combination with an automated fluorescence microscopy is a simple way to understand spatiotemporal regulation of plant immunity. In contrast to the root tissues that have been used for a number of various intravital fluorescent imaging experiments, there exist few fluorescent live-imaging examples for the leaf tissues that encounter an array of airborne microbial infections. Therefore, we developed a simple method to mount leaves of Arabidopsis thaliana plants for live-cell imaging over an extended period of time. We used transgenic Arabidopsis plants expressing the yellow fluorescent protein (YFP) genefused to the nuclear localization signal (NLS) under the control of the promoter of a defense-related marker gene, Pathogenesis-Related 1 (PR1). We infiltrated a transgenic leaf with Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 (avrRpt2) strain (Pst_a2) and performed in vivo time-lapse imaging of the YFP signal for a total of 40 h using an automated fluorescence stereomicroscope. This method can be utilized not only for studies on plant immune responses but also for analyses of various developmental events and environmental responses occurring in leaf tissues.

A Versatile Method for Mounting Arabidopsis Leaves for Intravital Time-lapse Imaging

We report a simple and versatile method for performing fluorescent live-imaging of Arabidopsis thaliana leaves over an extended period of time. We use a transgenic Arabidopsis plant expressing a fluorescent reporter gene under the control of an immunity-related promoter as an example for gaining spatiotemporal understanding of plant immune responses.

Um método versátil para a montagem de Arabidopsis deixa para Intravital imagem de lapso de tempo

The plant immune response associated with a genome-wide transcriptional reprogramming is initiated at the site of infection. Thus, the immune response is ...

Two-layered Membrane Sandwich Method for Laodelphax striatellus Saliva Collection

Rice stripe virus (RSV), which causes significant economic loss of agriculture in East Asia, entirely depends on insect vectors for its effective transmission among host rice. Laodelphax striatellus (small brown planthopper, SBPH) is the primary insect vector that horizontally transmits RSV while sucking sap from the phloem. Saliva plays a significant role in insects' feeding behavior. A convenient method that will be useful for research on insects' saliva with piercing-sucking feeding behavior is described here. In this method, insects were allowed to feed on an artificial diet sandwiched between two stretched paraffin film layers. The diet containing the saliva was collected each day, filtered, and concentrated for further analysis. Finally, the quality of collected saliva was examined by protein staining and immunoblotting. This method was exemplified by detecting the presence of RSV and a mucin-like protein in the saliva of SBPH. These artificial feeding and saliva collection method will lay a foundation for further research on factors in insect saliva related to feeding behavior and virus transmission.

Two-layered Membrane Sandwich Method for Laodelphax striatellus Saliva Collection

The present protocol describes a method to collect sufficient saliva from piercing-sucking insects using an artificial medium. This is a convenient method for collecting insect saliva and studying salivary function on insect feeding behavior and vector-borne virus transmission.

Método sanduíche de membrana de duas camadas para laodelphax striatellus saliva collection

Rice stripe virus (RSV), which causes significant economic loss of agriculture in East Asia, entirely depends on insect vectors for its effective ...

High-throughput, Robust and Highly Time-flexible Method for Surface Sterilization of Arabidopsis Seeds

Arabidopsis is by far the plant model species most widely used for functional studies. The surface sterilization of Arabidopsis seeds is a fundamental step required towards this end. Thus, it is paramount to establish high-throughput Arabidopsis seed surface sterilization methods to handle tens to hundreds of samples (e.g., transgenic lines, ecotypes, or mutants) at once. A seed surface sterilization method based on the efficient elimination of liquid in tubes with a homemade suction device constructed from a common vacuum pump is presented in this study. By dramatically reducing labor-intensive hands-on time with this method handling several hundreds of samples in one day is possible with little effort. Series time-course analyses further indicated a highly flexible time range of surface sterilization by maintaining high germination rates. This method could be easily adapted for surface sterilization of other kinds of small seeds with simple customization of the suction device according to the seed size, and the speed desired to eliminate the liquid.

A high-throughput protocol for the surface sterilization of Arabidopsisthaliana (Arabidopsis) seeds is provided, optimizing the liquid handling steps with a simple suction device constructed with a vacuum pump. Hundreds of seed samples can be surface-sterilized in one day.

Método de alta produtividade, robusto e altamente flexível para esterilização superficial de sementes arabidopsis

Arabidopsis is by far the plant model species most widely used for functional studies. The surface sterilization of Arabidopsis seeds is a fundamental ...

An Improved Chemotaxis Assay for the Rapid Identification of Rhizobacterial Chemoattractants in Root Exudates

Chemotaxis identification is very important for the research and application of rhizosphere growth-promoting bacteria. We established a straightforward method to quickly identify the chemoattractants that could induce the chemotactic movement of rhizosphere growth-promoting bacteria on sterile glass slides via simple steps. Bacteria solution (OD600 = 0.5) and sterile chemoattractant aqueous solution were added dropwise on the glass slide at an interval of 1 cm. An inoculating loop was used to connect the chemoattractant aqueous solution to the bacterial solution. The slide was kept at room temperature for 20 min on the clean bench. Finally, the chemoattractant aqueous solution was collected for bacterial counting and microscopic observation. In this study, through multiple comparisons of experimental results, the method overcame multiple shortcomings of traditional bacterial chemotaxis methods. The method reduced the error of plate counting and shortened the experimental cycle. For the identification of chemoattractant substances, this new method can save 2-3 days compared to the traditional method. Additionally, this method allows any researcher to systematically complete a bacterial chemotaxis experiment within 1-2 days. The protocol can be considered a valuable resource for understanding plant-microbe interactions.

Here, we present an improved chemotaxis assay protocol. The goal of this protocol is to reduce the steps and costs of traditional bacterial chemotaxis methods and to serve as a valuable resource for understanding plant-microbe interactions.

Um ensaio de quimiotaxis melhorado para a identificação rápida de quimioattractants rizobacterianos em Exudates radiculares

Chemotaxis identification is very important for the research and application of rhizosphere growth-promoting bacteria. We established a straightforward ...

Live Imaging of Arabidopsis Pollen Tube Reception and Double Fertilization Using the Semi-In Vitro Cum Septum Method

In flowering plants, the growth and guidance of the pollen tube (male gametophyte) within the pistil and the reception of the pollen tube by the female gametophyte are essential for double fertilization and subsequent seed development. The interactions between male and female gametophytes during pollen tube reception culminate in pollen tube rupture and the release of two sperm cells to effect double fertilization. As pollen tube growth and double fertilization are deeply hidden within the tissues of the flower, this process is difficult to observe in vivo.
A semi-in vitro (SIV) method for the live-cell imaging of fertilization in the model plant Arabidopsis thaliana has been developed and implemented in several investigations. These studies have helped to elucidate the fundamental features of how the fertilization process occurs in flowering plants and which cellular and molecular changes occur during the interaction of the male and female gametophytes. However, because these live cell imaging experiments involve the excision of individual ovules, they are limited to a low number of observations per imaging session, making this approach tedious and very time-consuming. Among other technical difficulties, a failure of the pollen tubes to fertilize the ovules in vitro is&#160;often reported, which severely confounds such analyses.
Here, a detailed video protocol for the imaging of pollen tube reception and fertilization in an automated and high-throughput manner is provided, allowing for up to 40 observations of pollen tube reception and rupture per imaging session. Coupled with the use of genetically encoded biosensors and marker lines, this method enables the generation of large sample sizes with a reduced time investment. Nuances and critical points of the technique, including flower staging, dissection, medium preparation, and imaging, are clearly detailed in video format to facilitate future research on the dynamics of pollen tube guidance, reception, and double fertilization.

Live Imaging of Arabidopsis Pollen Tube Reception and Double Fertilization Using the Semi-In Vitro Cum Septum Method

Here, we describe an improvement of the semi-in vitro (SIV) method for observing pollen tube guidance and reception in Arabidopsis thaliana,&#160;which increases the receptivity of ovules. The high-throughput SIV cum septum method may be coupled with gametophyte marker lines and genetically encoded biosensors to monitor the dynamic process of fertilization.

Imagem ao vivo da recepção do tubo polínico de Arabidopsis e dupla fertilização usando o método semi-in vitro do septo de cum

In flowering plants, the growth and guidance of the pollen tube (male gametophyte) within the pistil and the reception of the pollen tube by the female ...