A fusão de membrana media muitas funções biológicas. Este protocolo descreve um método para detectar a abertura de poros de fusão e a dinâmica de liberação do transmissor e distinguir três modos de fusão;fusão próxima, fusão de estadia e redução da fusão. A combinação de microscópio confocal e a gravação de grampo de remendo facilita a visualização da abertura e fechamento de poros de fusão e determinação de sua cinética.
Embora descrito para células cromafinas, o princípio do método descrito aqui pode ser aplicado amplamente a muitas células secretas muito além das células cromafinas. A implementação bem-sucedida deste método depende de várias etapas gerais, como a geração de cultura celular primária saudável, eficiência de transfecção plasmida suficiente e alta taxa de sucesso de registro eletrofisiológico. Escolha três glândulas intactas sem cortes ou sangramentos na superfície e remova o tecido adiposo com uma tesoura.
Lave as glândulas por perfusão com a solução de Locke até que não saia sangue. Para digestão, injete a solução enzimada através da veia adrenal usando uma seringa de 30 milímetros presa com um filtro de 0,22 micrômetros até que a glândula comece a inchar. Em seguida, deixe as glândulas a 37 graus Celsius por 10 minutos.
Injete novamente e deixe as glândulas a 37 graus Celsius por mais 10 minutos. Após a digestão, corte a glândula longitudinalmente da veia adrenal para a outra extremidade com uma tesoura para desdobrar a glândula. Isole a medula branca, tweezing-lo em pedaços em uma placa de Petri de 10 centímetros contendo a solução de Locke.
Corte e pique a medula com uma tesoura. Filtre a suspensão da medula com uma malha de nylon de 80 a 100 micrômetros em um béquer. Transfira o filtrado para um tubo cônico de 50 mililitros e centrífugas a 48 x g de temperatura ambiente por três minutos com uma desaceleração de três.
Após a centrifugação, remova o supernascedor e resuspenque a pelota celular com a solução de Locke por pipetação. Filtre a suspensão celular com um coador de 80 a 100 micrômetros e centrífugas a 48 x g de temperatura ambiente por três minutos com desaceleração três. Remova o supernatante e resuspende a pelota celular com 30 mililitros de meio de cultura.
Determine o número da célula usando uma câmara de contagem de hemótmetros. Transfira 2.800.000 células para um tubo de 15 mililitros. Pelota as células por centrifugação a 48 x g por dois minutos com a desaceleração de três.
Adicione 100 microliters de tampão de transeção fornecidos pelo fabricante à pelota celular. E, em seguida, adicionar dois microgramas de plasmídeo PH-mNG. Misture suavemente a suspensão encanando a solução para cima e para baixo e transfira a mistura para um cuvette de eletroporação sem demora.
Transfira imediatamente a cuvette para o eletroporador, selecione o programa 005 na lista de tela e pressione Enter para realizar a eletroporação. Após a eletroporação, adicione imediatamente 1,8 mililitros de meio ao cuvette e misture suavemente com uma micropipette equipada com uma ponta estéril. Adicione 300 microliters da suspensão das células eletroporadas no deslizamento de cobertura em cada prato emplacando de cinco a seis pratos no total para uma reação de eletroporação.
Transfira cuidadosamente os pratos para uma incubadora umidificada a 37 graus Celsius com dióxido de carbono de 9% por 30 minutos e adicione suavemente dois mililitros de meio pré-enfersedo a cada prato após 30 minutos. Prepare pipetas de remendo de capilares de vidro borossilicato, puxando-as com um puxador de pipeta, revestindo suas pontas com cera líquida e polindo-as com um microforge. Ligue o amplificador de gravação do grampo de remendo e inicie o software.
Defina os parâmetros apropriados de corrente de cálcio e de capacidade de registro do software. Defina um protocolo de gravação de 60 segundos de duração no total onde a estimulação começa em 10 segundos. Defina o potencial de retenção para gravação do grampo de tensão em 80 milvolts.
Defina uma despolarização de um segundo de menos 80 milivolts a 10 milivolts como o estímulo para induzir o fluxo de cálcio e o salto de capacitância. Ligue o sistema de microscópio confocal e defina os parâmetros apropriados no software. Ligue os lasers, incluindo 458 nanômetros, 514 nanômetros e 633 nanômetros e defina o intervalo de coleta de emissões para cada laser de acordo com cada sonda de fluorescência.
Escolha um prato com bom estado celular e expressão adequada e adicione dois microliters de fluorescência falso neurotransmissor FFN511 no meio no prato. Coloque o prato de volta na incubadora por 20 minutos. Depois de carregar FFN511, prepare a câmara de gravação e adicione dois microliters de corante de fluorescência A655 em 50 microliters de solução de banho.
Transfira o deslizamento de tampa do prato para a câmara de gravação com pinças e adicione imediatamente a solução de banho contendo A655. Coloque uma gota de óleo no objetivo de imersão de óleo 100X. Monte a câmara no microscópio e use o botão de ajuste para fazer com que o óleo entre em contato com a parte inferior da tampa.
Leve as células ao foco e use imagens de campo brilhante e confocal para encontrar uma célula adequada com expressão mNG. Amplie a célula selecionada e centralize-a no campo de visão, minimizando regiões em branco. Defina parâmetros para imagens confocal de plano XY em um plano Z fixo de FFN511, PH-mNG e A665 com um intervalo de tempo minimizado.
Ajuste o foco na parte inferior da célula com um botão de ajuste fino. Ajuste a potência do laser de excitação no software para encontrar uma configuração para obter a melhor relação sinal-ruído e evitar branqueamento significativo de fluorescência. Adicione nove microliters de solução interna em uma pipeta de remendo e conecte a pipeta ao suporte do estágio do amplificador do remendo.
Aplique uma pequena quantidade de pressão positiva com uma seringa e mova a ponta da pipeta para tocar a solução de banho com um micromanipulador. Certifique-se de que o amplificador mostra que a resistência da pipeta está aproximadamente entre dois a quatro megaohms com um teste de pulso de tensão. Pressione LJ/Auto para cancelar a junção líquida.
Mova a pipeta para a célula selecionada com um micromanipulador. Para formar um modo de conexão celular, mova a ponta da pipeta para tocar a célula. Altere o potencial de retenção de zero para menos 80 milivolts enquanto aplica pressão negativa suave com uma seringa.
Uma vez que a resistência passe um gigaohm, espere aproximadamente 30 segundos para que a configuração se estabilize. Pressione C-fast/Auto para compensar a capacidade rápida. Para formar um modo atacado, aplique pulsos curtos, mas poderosos, de pressão negativa com a seringa até que a membrana se rompa.
Pressione C-slow/Auto para compensar a capacidade lenta. Ajuste o foco de imagem ligeiramente para se concentrar na parte inferior da célula. Inicie a imagem de lapso de tempo confocal e a gravação do grampo de correção simultaneamente clicando nos botões Iniciar com dois aplicativos de software diferentes.
Após a gravação, certifique-se de que os dados sejam salvos. Mude o potencial de retenção para zero milvolts. Tire a pipeta da solução do banho e descarte-a.
Abra os arquivos de imagem bruto com qualquer fabricante ou software fornecido. Vá para Process, clique em ProcessTools e use as ferramentas para gerar arquivos médios de rolagem para cada imagem de lapso de tempo. Salve esses arquivos.
Em quantify, vá para Ferramentas e clique nos botões Stack Profile para verificar os pontos de tempo antes e depois da estimulação e identificar alterações de fluorescência em cada canal. Clique no botão Desenhar elipse para circular regiões de interesse para eventos de fusão. Clique com o botão direito do mouse na imagem e clique em Salvar ROIs para salvar.
Clique em Abrir projetos para localizar o arquivo bruto. Clique com o botão direito do mouse na imagem e clique em Carregar ROIs para carregar o arquivo ROI no arquivo de imagem bruta para medir as intensidades de fluorescência. Vá para Ferramentas e clique em Classificar ROIs no software e plotar os traços para todos os três canais de cada ROI.
Clique em Reportar para salvar os dados do ROI, incluindo dados digitais e rastreamentos de imagem para cada ROI em uma pasta de arquivos. Toda a gravação de grampo de remendo celular e aplicação de uma despolarização de um segundo de 80 a 10 milívolos foi realizada para evocar exo e endocitose. A despolarização aplicada induziu uma corrente de cálcio interior, um salto de capacitância, indicando exocite, e uma decadência de capacitância após o salto, indicando endocitose.
Com a imagem do lapso de tempo no fundo celular, os eventos de fusão induzidos pelo protocolo de despolarização de um segundo foram indicados como diminuição do FFN refletindo a liberação de FFN511, acompanhados pelo aumento da fluorescência de fph e a655, refletindo a difusão ph-mNG e A655 da membrana plasmática e a solução de banho na vesícula fusível. A figura apresenta fusão próxima identificada como f655 escurecimento, enquanto FPH sustentado ou deteriorado com um atraso. A figura representa a fusão de permanência detectada pela presença de ambos os pontos PH-mNG e A655.
A figura representa a fusão de encolhimento detectada como decadência de FPH e F655 paralelas acompanhada de uma redução de tamanho paralelo do ponto PH-mNG e o registro de tração A655 O sucesso da gravação requer gerar toda a configuração celular com grampo de remendo e imagem na parte inferior celular com intensidade fluorescente adequada para cada canal. A combinação de eletrofisiologia e microscopia de super resolução descrita aqui é uma ferramenta valiosa para medir a dinâmica dos poros de fusão e neurocircuitos.
