A análise do transcriptoma em uma única célula ou tipos celulares pode detectar a sutil diferença da expressão gênica sendo mascarada pela heterogeneidade, que é uma ferramenta poderosa para descobrir os elaborados mecanismos regulatórios intracelulares. A classificação de células ativadas por fluorescência seguida de análise RN-seq pode ser realizada em modo de célula única ou tipo de célula em massa com alta sensibilidade de detecção de transcrito e compatibilidade com outras abordagens multi-ômicas. Usuários iniciantes deste protocolo precisam prestar atenção a algumas etapas na classificação de protoplastos e preparação da biblioteca RNA-seq.
Junto com Jun Zhang, o Dr. Rongrong Xie, pós-doutor em nosso laboratório, ajudará na demonstração do procedimento. Para começar, coloque as sementes de Arabidopsis thaliana wild type e fluorescent marker line em água sanitária a 20% e incube em estufa rotativa à temperatura ambiente por 15 minutos para esterilizar as sementes. Enquanto trabalha em uma bancada estéril, enxágue as sementes de três a cinco vezes em água bidestilada.
Plaquear as sementes do tipo selvagem e da linhagem repórter em meio MS de meia resistência com 0,8% em peso por volume de ágar. Estratificar as plantas por dois dias a quatro graus Celsius. Em seguida, cultivá-los verticalmente por cinco dias a 23 graus Celsius sob ciclos claros de 16 horas e escuros de 18 horas.
Descongelar suavemente as soluções de protoplasting referidas como solução A e solução B no gelo antes da experiência. Corte as raízes das plantas usando uma lâmina ou tesoura limpa e pique as raízes em pedaços de aproximadamente 0,5 centímetro. Submergir as raízes picadas em 1,5 mililitros da solução B, seguido de rotação suave à temperatura ambiente por 1,5 a 2 horas.
Filtrar os protoplastos radiculares resultantes através de uma malha de filtro de 40 mícrons e enxaguar a malha com um a dois mililitros de solução A.Centrifugar os filtrados combinados a 300 G durante cinco minutos a quatro graus Celsius. Descarte o sobrenadante usando uma pipeta, ressuspenda o pellet de célula em 500 a 600 microlitros de solução A e coloque-o no gelo imediatamente. Para a classificação celular, transfira a solução de células ressuspensas para um novo tubo de ensaio de cinco mililitros.
Encha o tanque de fluido da bainha e verifique o tanque de resíduos. Em seguida, ligue a máquina de classificação de células ativadas por fluorescência ou FACS. Execute as etapas de configuração do instrumento e calibração automática no classificador.
Selecione os canais de fluorescência e use uma planta selvagem sem fluorescência como controle de linha de base. Ajuste a porta de classificação com base na intensidade da fluorescência e nos singlets de dispersão direta e lateral. Depois de adicionar 500 microlitros de solução A em um tubo de coleta de 1,5 mililitro, comece a classificar e colete 2.000 a 3.000 células por tubo.
Após a triagem, coloque imediatamente as amostras no gelo. Centrifugar o tubo de recolha contendo as células a 300 G e quatro graus Celsius durante cinco minutos e remover o sobrenadante com uma pipeta. Pegue dois microlitros de células classificadas e verifique se há fluorescência usando um microscópio de fluorescência.
Armazene as células classificadas a menos 80 graus Celsius se não for usado imediatamente. Para a classificação do índice de célula única, coloque a placa de 96 poços com membrana no adaptador. Calibre a posição da placa de modo que a gotícula caia no orifício central da placa.
Remova a membrana da placa de 96 poços e coloque a placa de 96 poços no adaptador. Selecione o modo de classificação de célula única ao classificar. Insira o número de destino de células classificadas como uma e comece a classificar.
Antes de iniciar o experimento, limpe a bancada com um descontaminante de superfície e etanol 75%. Use todos os equipamentos apenas para a preparação da biblioteca de sequenciamento. Depois de adicionar um microlitro de mistura A recém-preparada na amostra classificada, triture-a com um pilão estéril.
Usando água livre de RNAse, perfaça o volume para 14 microlitros. Em seguida, transfira cada amostra para um tubo de PCR de parede fina de 0,2 mililitro. Em seguida, prepare a mistura B.Adicione 4,4 microlitros na mistura B a cada tubo de PCR contendo amostras e misture por pipetagem suave.
Incubar as amostras a 72 graus Celsius durante três minutos. Após a incubação, colocar imediatamente as amostras em gelo para hibridizar o oligo dT à cauda poli-A. Preparar a mistura de reação de transcrição reversa ou mistura C em 21,6 microlitros para cada tubo contendo as amostras.
Submeter as amostras à reação de transcrição reversa em um instrumento comum de PCR de acordo com o programa de transcrição reversa. Adicione 40,8 microlitros da mistura de reação de pré-amplificação recém-preparada ou mistura D ao produto da reação de transcrição reversa e execute o programa de pré-amplificação. O ciclo de amplificação pode ser determinado por PCR quantitativo quando a reação entra na fase exponencial.
Para purificar os produtos da reação de pré-amplificação, transfira os produtos pré-amplificados de um tubo de PCR para um tubo de 1,5 mililitro. Adicione 48 microlitros de contas AMPure XP em cada amostra e misture suavemente por pipetagem antes da incubação. Coloque os tubos de 1,5 mililitro contendo as amostras e contas em um suporte de separação magnética por cinco minutos.
Descarte cuidadosamente o sobrenadante das amostras sem perturbar as contas. Após ressuspendê-los em 200 microlitros de etanol 80%, coloque-os no suporte de separação magnética por mais três minutos. Após o descarte do sobrenadante contendo etanol, secar ao ar as amostras em tubo por 10 minutos.
Ressuspender as esferas em 20 microlitros de água livre de nucleases e incubar à temperatura ambiente por cinco minutos. Em seguida, coloque-os no suporte de separação magnética por cinco minutos. Usando uma pipeta, transfira 18 microlitros do sobrenadante de cada tubo para um novo tubo centrífugo de 1,5 mililitros.
Finalmente, siga os passos descritos no texto para caracterizar a pré-biblioteca, seguido da construção, purificação e quantificação da biblioteca. As linhagens de marcadores fluorescentes de Arabidopsis thaliana foram desenvolvidas pela fusão de proteínas fluorescentes com genes expressos especificamente em tipos celulares alvo ou pelo uso de linhas de armadilhas intensificadoras. Os protoplastos marcados específicos para fluorescência foram classificados com sucesso com base na intensidade da fluorescência e singletes de dispersão direta e lateral.
As células classificadas foram visualizadas usando imagens de campo claro e fluorescência. Os resultados representativos da biblioteca de sequenciamento de RNA de cerca de 2.000 células do periciclo do xilema, células primordiais da raiz lateral, células da endoderme ou córtex e células da calota radicular lateral são mostrados. Uma biblioteca de tamanho pequeno com picos de dímeros de primer ou adaptador ainda poderia ser sequenciada após a seleção de tamanho.
Uma biblioteca com uma distribuição de tamanho anormal indicou uma preparação malsucedida da biblioteca. Os padrões de expressão gênica foram analisados. Os genes enriquecidos em qualquer um dos quatro tipos celulares radiculares foram agrupados e representados em um mapa de calor mostrando a especificidade da expressão gênica entre diferentes tipos celulares.
A alta qualidade e pureza das células-alvo por meio de corretas amarrações e classificação e prevenção da degradação de RNA são fundamentais para o sucesso da construção de bibliotecas. Para RNA-seq no modo de célula única, vários métodos integrados com o identificador molecular único foram relatados recentemente que melhoraram significativamente o desempenho.
