Em vídeo, apresentamos um protocolo para fratura de congelamento de vesículas extracelulares originárias de células cancerígenas de bexiga in vitro. Vesículas extracelulares são vesículas limitadas por membrana que derivam das células são liberadas em espaço extracelular e têm um papel na comunicação intercelular. Dentro de vesículas extracelulares, discriminamos três populações, exosomos, microvesículos e corpos apoptóticos, que diferem por sua origem, tamanho e composição molecular.
A composição molecular das vesículas extracelulares reflete o perfil molecular da célula doadora e interfere nos processos biológicos na célula receptora. No entanto, a composição da membrana limitante das vesículas celulares é crucial para a interação com a membrana celular receptora. Para analisar a organização da membrana limitante, as vesículas extracelulares devem ser primeiro isoladas e, em seguida, abordadas para a técnica de fratura congelante.
A fratura congelante é uma técnica microscópica eletrônica dedicada a estudar a organização bidimensional de membranas biológicas, incluindo vesículas. Os passos da fratura congelante são o congelamento rápido do espécime, fraturando o espécime, fazendo a réplica da superfície fraturada congelada, e limpando a réplica para remover materiais biológicos. Réplicas são finalmente visualizadas com microscópio eletrônico de transmissão.
Nosso objetivo era usar a técnica de fratura congelante para caracterizar microvesculas em termos de forma, tamanho e composição da membrana. Comece com células em crescimento na incubadora celular. Inspecione células sob o microscópio para confirmar sua variabilidade e confluência.
Colete mídia cultural com microvesículos em tubos, e centrífuga a 300 g-forces por 10 minutos. Colecionar supernante. Posteriormente, centrífugas supernasas a 2000 g-forces e 10.000 g-forces.
Depois disso, observe a ponta do tubo para uma pelota esbranquiçada indicando microvesculas. Remova cuidadosamente o supernatante. Adicione 1,5 mililitros de PBS e suspenda a pelota contendo microvesculas.
Em seguida, centrífuga a 10.000 g-forces. Observe para a pelota esbranquiçada. Remova o supernatante e adicione suavemente fixação.
Deixe por 20 minutos a 4 graus Celsius. Em seguida, remova o fixador e adicione o tampão de lavagem para enxaguar a pelota sem suspendê-la de nova. Deixe por 10 minutos a 4 graus Celsius.
Remova o tampão de lavagem e adicione 30% de glicerol à pelota. Suspenda a pelota em suspensão homogênea e incubar por 30 minutos a 4 graus Celsius. Prepare os transportadores de cobre limpos com um poço central e desenvolva frasco com carranca e nitrogênio líquido.
Sob microscópio, transfira a amostra para o poço central do transportador de cobre. Misture o freon solidificado para ficar liquefeito. Pegue o anel externo do porta-aviões com pinças e mergulhe-o em freon resfriado.
Após oito segundos, transfira rapidamente o portador para desenvolver frasco com nitrogênio líquido. Mark crio vil e esfriá-lo. Sob nitrogênio líquido, colete os portadores no vil, feche-o e guarde no recipiente de nitrogênio líquido até congelar a fratura.
Prepare a unidade de fração de congelamento de acordo com as instruções de operação dos fabricantes. Inicie o sistema de vácuo e esfrie a câmara da unidade a menos 150 graus Celsius. Transfira os transportadores de cobre com amostras congeladas para a unidade de fracionamento congelado.
Coloque a temperatura da faca em menos 100 graus Celsius e espere pelo vácuo. Comece a seccionar a amostra ligando o movimento motorizado da faca até que a superfície da amostra esteja lisa. Para fraturar desligue o movimento motorizado da faca e prossiga com o controle manual lento da faca.
Continue com a sombra de platina no ângulo de 45 graus. Ligue a alta tensão e aumente a corrente para a arma de platina. Faíscas de platina devem começar a sombrear a amostra.
Supervisione a posição de platina no monitor de espessura de cristal de quartzo. A espessura recomendada de platina é de 2,5 nanômetros. Desligue a corrente e a alta tensão.
Prossiga com sombra de carbono em um ângulo de 90 graus. Ligue a alta tensão e aumente a corrente para a arma de carbono. Faíscas de carbono devem começar a sombrear a amostra.
Quando 2,5 nanômetros de carbono são obtidos, desligue a corrente e a alta tensão. Transfira essas amostras com as réplicas da unidade de fratura congelante para uma placa de 12 válvulas cheia de água duplamente destilada. Réplicas flutuarão na superfície da água enquanto os porta-aviões afundarem.
Transfira réplicas com laço de arame para uma placa de 12 válvulas cheia de hipoclorite de sódio e incubar durante a noite. Lave réplicas em água duplamente destilada. Colete-os em uma grade TM de cobre de malha e deixe-os secar no ar por duas horas.
Use um microscópio eletrônico de transmissão para réplicas de imagens e obtenha micrografias. Para uma interpretação precisa de réplicas e micrografias, siga as diretrizes para a orientação adequada sobre a nomenclatura. Análises de réplicas mostraram que o meio de condições isoladas continha fração enriquecida de vesículas.
Vesículas isoladas foram coletadas em aglomerados de três ou mais ou muito distribuídos individualmente. As vesículas tinham forma esfericamente. O diâmetro das vesículas correspondia ao diâmetro dos microvesículos.
A fratura congelante também revelou a organização bidimensional da membrana microvesículas. A fase exoplasmática dos microvesículos teve aparência lisa e uniforme, enquanto na fase de protoplastos observamos partículas inter-membranas. Partículas intermo membranas apareceram esporadicamente, o que implica que microvesculas isoladas de células cancerosas contêm apenas baixa quantidade de proteínas de membrana ou conjuntos de proteínas.
Resumindo, a técnica de fratura congelante utilizada no protocolo apresentado prova ser a técnica ideal para a caracterização de vesículas extracelulares e pode ser utilizada para a avaliação de outras populações de vesículas extracelulares. Uma vantagem crucial da técnica de fratura congelante é seu poder de resolver a organização interna da membrana limitante de vesículas, que determina a função biológica das vesículas extracelulares.
