Os autores gostariam de agradecer ao Dr. Brent Harris para a prestação de revisão crítica do manuscrito. Estes estudos foram realizados no Lombardi Comprehensive Cancer Center Histopatologia &amp; Tissue recurso compartilhado que é apoiado em parte pelo NIH / NCI subvenção P30-CA051008. O conteúdo é da exclusiva responsabilidade dos autores e não representam necessariamente as opiniões oficiais do Instituto Nacional do Câncer ou o National Institutes of Health.

1. Construção do local <ol><li> Adicionar 50 mg de Albumina de Soro Bovino (BSA) a 1 ml de tecido corante de marcação num tubo de 15 ml ou 2 ml tubo de microcentrífuga e vortex durante 1 minuto ou até estar completamente dissolvido. Nota: Para este protocolo, utilize bioquímica Grade BSA. Enquanto outros graus e purezas não foram testados, espera-se que o grau ea pureza não teria um impacto significativo sobre o sucesso do local. </li><li> De calor 9 ml hidroxietil gel de agarose de processamento em um tubo de 15 ml em um micro-ondas a 30% de potência para incrementos de 10 seg até que o gel esteja completamente derretida. </li><li> Combine o gel processamento derretido e solução de corante-BSA em um único tubo de 15 ml e misture bem com uma pipeta. Vortex a solução. </li><li> Colocar o tubo cónico num frigorífico durante algumas horas ou até que o sólido. </li><li> Use um, magro, espátula de metal longo ou sonda para liberar suavemente a camada de gel colorido do tubo cônico. </li><li> Use uma lâmina de bisturi ou navalha para cut do gel ligar transversalmente em cinco milímetros de espessura. Retire as extremidades arredondadas e as trate como lixo (Figura 2A). </li><li> Coloque as seções de plug gel planas em cassetes de histologia e segure em etanol a 70% durante 1 hora. Alterar a solução de etanol a 70% a cada 2-4 horas durante pelo menos três mudanças ao longo de um período de 24 horas. </li><li> Processar manualmente as secções de gel através de uma série de etanol (1 hora cada: etanol a 70%, etanol a 80%, etanol a 95%, etanol a 100% (alterações 3x), em seguida, solução clara na limpeza 3x durante 1 hora cada um (por exemplo, hidrocarbonetos alifáticos ( xilenos substituto)) foram utilizados no presente protocolo, xilenos também são aceitáveis), e infiltrar-se com parafina fundida (3x durante 1 h cada), manualmente ou em processadora de tecido. Nota: antes da desidratação completa em etanol a 100%, o corante pode vazar a partir da camada de gel que pode afectar outros tecidos e os reagentes líquidos num processador automatizado de tecidos. Como tal, a reidratação manual é altamente recomendado, no entanto processamento automatizado é equaliado eficaz. </li><li> Várias seções gel processado Incorporar usando parafina padrão incorporação de metodologia (Figura 2B). Permitir blocos para esfriar e endurecer e, em seguida, voltar à temperatura ambiente. </li><li> Utilize uma agulha de punção dérmica tamanho desejado para remover núcleos local das secções embutidas em gel até que o bloco se esgota (Figura 2C). Um único bloco pode fornecer até 20 x 2 milímetros 2 núcleos. Armazenar os núcleos em local fresco. Use dérmica perfurador neste protocolo ver Figuras, um 1,5 mm (Figuras 1D e 2D) ou 2 mm (Figuras 1B, 1C e 2C). </li></ol> 2. Usando pontos para Blocos Orient Non-dispostas <ol><li> Criar um diagrama de orientação do tecido para indicar os locais e as identidades de todos os pedaços de tecido individuais a serem incorporados em conjunto desejados, e a localização do local. NOTA: O diagrama orientação tecido é um mapa ilustrado que inclui o physical locais de todos os pedaços de tecido rotulados com identificadores ea localização do local. Ele pode ser criado eletronicamente ou pode ser desenhado à mão. O diagrama deve ser criado usando qualquer método que melhor se adequa ao técnico e pesquisador de utilizar o produto final. O mapa servirá como guia para o pesquisador tão amostras podem ser facilmente identificados durante a análise microscópica. O mapa utilizado neste protocolo foi desenhada à mão. Descreve um bloco de tecido e vidro lâmina de microscópio com cada peça de tecido eo ponto desenhado e rotuladas na mesma posição que o bloco de tecido real e slide. </li><li> Processar os pedaços de tecido, normalmente, garantir que se mantêm devidamente identificados durante todas as etapas de processamento e extrapolação. Para este protocolo, processar os tecidos durante 1 hora cada em: 70% de etanol, etanol a 80%, etanol a 95%, etanol a 100% (alterações x3), hidrocarbonetos alifáticos (xilenos) de substituição (alterações x3), e fundido a infiltração de tecido em parafina 60 ° C (mudanças x3). NOTA: Atecidos ll devem ser processados ​​de acordo com procedimentos de laboratório de histologia padrão. Isso pode ser variável devido a procedimento laboratorial individual, a dimensão eo tipo de tecido, mas isso não afetará a capacidade de usar o local como uma ferramenta de orientação. </li><li> Disponha pedaços de tecido sobre a estação de incorporação nos locais corretas atribuídas de acordo com o diagrama de orientação tecido. Use o diagrama orientação tecido como uma referência para orientar o técnico sobre como organizar as peças local e tecidos em cada bloco. NOTA: Neste protocolo o técnico incorporação de colocar a orientação do mapa desenhado à mão ao lado da estação de incorporação e organizados os pedaços de tecido na estação de incorporação em exatamente o mesmo arranjo como desenhado no diagrama. Isto assegura que todos os pedaços de tecido permanecem correctamente identificáveis ​​no produto final. Isto é absolutamente essencial para o sucesso do uso de blocos multi-tecido. </li><li> Certifique-se o núcleo local é mais alto do que todos os pedaços de tecido para ser incorporado no bloco. </li><li> Incorporar os pedaços de tecido e, em seguida, a mancha na final (transversal) nos locais apropriados de acordo com o diagrama de orientação tecido usando a metodologia de incorporação padrão. Conforme o necessário, segurar o lugar (s) na posição vertical com uma pinça até a parafina tem solidificado o suficiente para que o local (s) não vai cair (1-2 min). </li><li> Seção de parafina e mancha seções com o local utilizando metodologia padrão. <ol><li> Permitir que as secções a flutuar num banho de água a 40 ° C e aderida a uma lâmina de vidro carregadas positivamente (lâminas não carregadas não foram testados). Secam-se as lâminas em um forno de secagem a 60 ° C durante pelo menos 20 min. </li><li> Colocar as lâminas em um corante automático e transformados por meio dos seguintes reagentes: xilenos (xilenos 1-5 min, xilenos 2 e 3-2 minutos, cada), etanol a 100% (2 min), etanol a 95% (1 min), 80 % de etanol (30 seg), etanol a 70% (30 seg), em água corrente (2 min), Hematoxilina (1,5 min), água corrente (3 minutos), o álcool do ácido (1 min), água da torneira corrente (2 min ), blreagente sional (1 min), água corrente (2 min), etanol a 80% (30 seg), eosina (1 min), água corrente (10 seg), etanol a 80% (1 min), etanol a 100% (3 mudanças, 2 min cada), xilenos (3 mudanças, 30 s cada). </li><li> Cobrir as lâminas com lamelas de vidro, montado com meio de montagem. NOTA: Neste protocolo, o histotechnician seccionados os blocos de parafina em um micrótomo em 5 mm seções. Para este protocolo foi utilizado um corante automática, no entanto resultados iguais pode ser obtido através de coloração manual. </li></ol></li></ol> 3. natural em TMA (Manual TMA Kit) <ol><li> Criar um diagrama de orientação do tecido, como descrito em 2.1 e atribuir o local desejado (s) do local. </li><li> Encha o molde TMA com parafina derretida em uma estação de incorporação. À medida que o molde é de arrefecimento, incorporar o local (s) no fim das margens do molde TMA nos locais desejados indicados pelo diagrama de orientação tecido. Conforme o necessário, segurar o lugar (s) na posição vertical com uma pinça até o ha parafinas solidificado o suficiente para que o local (s) não vai cair (1-2 min). </li><li> Monte os núcleos TMA acordo com as instruções do fabricante e no que respeita à localização do ponto (s) nas margens de matriz (Figura 2D), e seguir os protocolos de seccionamento e coloração padrão. NOTA: Por favor consulte o passo 2.6 para ver os métodos de seccionamento e coloração utilizados neste protocolo. </li></ol>

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	<li>Jawhar, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+microarray:+a+rapidly+evolving+diagnostic+and+research+tool.">Tissue microarray: a rapidly evolving diagnostic and research tool.</a> Ann. Saudi. Med. 29 (2), 123-127 (2009).</li><li>Dhir, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+microarrays:+an+overview.">Tissue microarrays: an overview.</a> Methods Mol. Bio. 441, 91-103 (2008).</li><li>Parsons, M., Grabsch, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+to+make+tissue+microarrays.">How to make tissue microarrays.</a> Diagn. 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M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+new+players+in+hepatocarcinogenesis:+Limits+and+opportunities+of+using+tissue+microarray+(TMA).">Identification of new players in hepatocarcinogenesis: Limits and opportunities of using tissue microarray (TMA).</a> Microarray. 3, 91-102 (2014).</li><li>Miettinen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+for+generating+multitissue+blocks+without+special+equipment.">A simple method for generating multitissue blocks without special equipment.</a> Immunohistochem. Mol. Morphol. 20 (4), 410-412 (2012).</li><li>Jones, M., Calabresdi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agar-gelatin+for+embedding+tissues+prior+to+paraffin+processing.">Agar-gelatin for embedding tissues prior to paraffin processing.</a> BioTechniques. 42, 569-570 (2007).</li><li>Carson, F., Hladik, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Histotechnology: A Self-Instructional Text. , (2009).</li><li>Suvarna, S., Layton, C., Bancroft, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Bancroft&#8217;s Theory and Practice of Histological Techniques. 7th ed. , (2013).</li></ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Preparação bem sucedida e utilização dos pontos exige a adesão cuidado para algumas etapas técnicas. Fusão do agarose hidroxietil deve ser feito lentamente e em fogo baixo. Derretendo rapidamente no calor elevado pode resultar em alguma repartição do agarose por menos de ótimos resultados. Ao cortar as fichas de corantes de carga em partes para processamento, assegurar que a espessura de cada peça é superior a 4,5 mm e não superior a 7 mm. As extremidades arredondadas são removidas como desperdício uma ve...

A capacidade de incorporar amostras de tecido de várias pessoas em um único bloco de parafina permite fácil comparação lado a lado entre os tratamentos e indivíduos, elimina a variabilidade entre os slides, e reduz o custo ea carga de trabalho de corte e coloração espécimes. Estes blocos multi-tecidos são tipicamente produzidos quer como micromatrizes de tecidos (TMA) ou blocos de parafina contendo tecido de vários indivíduos num esquema não-matriz. Manutenção de identidade amostra é crítica para o sucesso de qualquer análise multi-tecido. Os investigadores têm vindo a utilizar TMAs desde o seu desenvolvimento para melhorar a eficiência da análise, reduzir a variação entre os slides, conservar os recursos de tecidos valiosos, e reduzir o tempo eo custo de experimentos 1. A orientação correcta de TMA pode ser conseguida utilizando uma variedade de métodos, incluindo os espaços em branco, linhas ou colunas entre núcleos dos tecidos, 2-4 disposição assimétrica dos grupos principais 3, 5 (por exemplo, control vs. tratamento), &quot;baliza&quot; núcleos 6, e núcleos de orientação designados situados fora da matriz TMA 3. Embora estes métodos funcionam bem para TMAs, mais consomem valioso espaço TMA núcleo e TMAs com lacunas e espaços como identificadores pode tornar-se confuso para enchimento de tecido estão esgotados ao longo do tempo. Além disso, estes métodos não são apropriados para uso em blocos multi-tecido sem um formato de matriz porque dependem de anomalias no padrão bem ordenada de núcleos de microarray uniformes como identificadores. A maioria dos blocos não vestiu multi-tecido deve acomodar tecidos não uniformes e, por definição, não exibir a grade de matriz estruturada que faz com que essas aberrações destacam-se como pontos de referência. Embora existam muitas vantagens em usar uma TMA, uma das maiores desvantagens é o tamanho pequeno dos núcleos o que nem sempre é representativa de tecido 1, em grande parte heterogénea. Blocos multi-tecido não-dispostas fornecer muitas das tele se beneficia de um TMA, mas contêm amostras de tecidos maiores, ou órgãos inteiros a partir de estudos com animais. Tissue microarrays utilizando núcleos individuais têm diferentes concordância com seções inteiras de tecidos com base na proteína de interesse e muitos exigem múltiplos núcleos para maior concordância 7-11. Devido à complexidade e heterogeneidade de alguns fenótipos de biomarcadores, TMAs usando até mesmo um grande número de núcleos (&gt; 10) podem ainda ser insuficiente e pode exigir que não sejam microarrays para a análise de oito métodos. Além disso, TMA construção é demorado, tecnicamente exigente, e exige que o custo inicial eo investimento em ou acesso a um arrayer tecido. Blocos multi-tecido não dispostas pode ser feita em qualquer laboratório de base com significativamente menos tempo e esforço e é uma alternativa válida para os estudos que exigem mais do que matrizes de tecido permitir ou como um meio para reduzir custos e simplificar a análise. Blocos não-vestida multi-tecido semelhante requerem um ou fiávelientation marcador para monitorar a identificação da amostra, no entanto, o desenvolvimento desses marcadores tem sido limitada. Muita da literatura que descreve a orientação se concentra na orientação do tecido fisiológico correcto para a incorporação de peças de tecidos individuais, tais como o tecido de tatuagem com 12 de tinta, pré-incorporação de tecidos em meio de ágar-gelatina antes de processamento 13, e marcação certos tecidos com entalhes 14 ou 15 Suturas . Embora funcionais, estes métodos não são ideais como marcadores em blocos multi-tecido, devido às suas limitações. A sutura será seccionada por meio rápido e talvez não sejam visíveis em cada seção. Usando técnicas de ágar-gelatina pode manter o tecido na orientação adequada durante o processamento e incorporação pré-incorporação, mas não fornece uma indicação visual para diferenciar entre múltiplas amostras no bloco de parafina e lâminas. Entalhes ou corante no tecido pode complicar a análise ou ocluir importantes detalhes morfológicos. Alternativamente, a identidade dos tecidosem um bloco não-vestida multi-tecido pode ser mantida através da incorporação de peças de tecido numa disposição assimétrica, mas isto requer três ou mais peças de tecido e pode não permitir a disposição óptima dos tecidos para análise. A Orientação Tag Specimen (spot) foi desenvolvido como um método fácil e barato para identificar claramente tecidos em blocos multi-tecidos e oferece muitas vantagens sobre os métodos de orientação existentes. O local é um pequeno, colorido, núcleo composto por Hydroxyethyl gel de agarose e processamento de corante marcação de tecidos, e infiltrado com parafina (Figura 2C). O núcleo local é incorporado na extremidade próxima de um único tecido num bloco de parafina de multi-tecido e aparece como um ponto brilhantemente colorido no bloco e em cada secção (Figura 1A - D), indicando claramente a orientação correcta do bloco e secções para a identificação de tecidos fácil.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>HistogelTM Specimen Processing Gel</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>HG-4000-012</td>
			<td><a href="http://www.thermoscientific.com/en/product/richard-allan-scientific-histogel-specimen-processing-gel.html">http://www.thermoscientific.com/en/product/richard-allan-scientific-histogel-specimen-processing-gel.html&#160;</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Marking Dye</td>
			<td>Triangle Biomedical Sciences, Inc.</td>
			<td>TMD-5</td>
			<td>Any tissue marking dye would most likely be sufficient.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Arraymold Kit A 2 mm (60 core)</td>
			<td>Arraymold</td>
			<td>20015A</td>
			<td>Any manual tissue arrayer would work similarly.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

spot the correct tissue every time in multi-tissue blocks

Blocos de parafina do tecido multi-proporcionar análise de alto rendimento com o aumento da eficiência, uniformidade experimental, e redução do tempo e custo. Tissue microarrays compõem a maioria dos blocos de parafina multi-tecido, mas cada vez mais, os pesquisadores estão usando blocos não vestiu contendo tecidos maiores a partir de vários indivíduos que podem fornecer muitas das vantagens de microarrays de tecido sem investimento substancial no planejamento e equipamentos. Um componente crítico de qualquer análise multi-tecido é o método de orientação utilizados para identificar todos os tecidos. Embora existam métodos para manter a orientação e a identificação de tecidos em blocos multi-tecido adequado, mais não são adequados para os blocos não formado, pode consumir espaço valioso dentro de uma matriz e / ou são difíceis de produzir em laboratório histologia padrão. A Orientação Tag Specimen (spot) é uma ferramenta de baixo simples, orientação para os custos que é claramente visível em todos os blocos de parafina e cortes de tecidos for identificação espécime confiável em layouts dispostos e não dispostos. O local proporciona vantagens sobre os métodos existentes de orientação para blocos não-vestida, uma vez que não exige qualquer modificação directa ao tecido e permite flexibilidade na disposição dos pedaços de tecido.

O local aparece como um círculo, ponto brilhantemente colorido no bloco de parafina (Figura 1A e 2D), em todas as secções de parafina, e mantém-se na lâmina de vidro por meio do procedimento de H &amp; E ou IHC coloração (Figuras 1B - 1D e 2D). Este óbvias auxiliares de sinalização visuais tanto o histotechnician e pesquisador na identificação de cada peça de tecido individuais e simplifica a comunicação como o histotechn...

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SpOT the Correct Tissue Every Time in Multi-tissue Blocks

O objectivo da orientação da etiqueta de amostra (SPOT) é para funcionar como uma ferramenta de orientação para auxiliar na identificação de manipulação de tecidos em blocos de parafina multi-tecido. Estes protocolos demonstrar como ela é construída facilmente de histologia, materiais de baixo custo comuns e serve como um marcador visual confiável em blocos de parafina e secções.

Manchar o tecido correto Every Time nos Blocos Multi-tecidos

Multi-tissue paraffin blocks provide high throughput analysis with increased efficiency, experimental uniformity, and reduced time and cost. Tissue ...

spot-the-correct-tissue-every-time-in-multi-tissue-blocks

Research

JoVE Journal

Biology

11.7K visualizações.  Frederick National Laboratory for Cancer Research.  O objectivo da orientação da etiqueta de amostra (SPOT) é para funcionar como uma ferramenta de orientação para auxiliar na identificação de manipulação de tecidos em blocos de parafina multi-tecido. Estes protocolos demonstrar como ela é construída facilmente de histologia, materiais de baixo custo comuns e serve como um marcador visual confiável em blocos de parafina e secções. 

Vídeo: SpOT the Correct Tissue Every Time in Multi-tissue Blocks

Actin Co-Sedimentation Assay; for the Analysis of Protein Binding to F-Actin

The actin cytoskeleton within the cell is a network of actin filaments that allows the movement of cells and cellular processes, and that generates tension and helps maintains cellular shape.  Although the actin cytoskeleton is a rigid structure, it is a dynamic structure that is constantly remodeling.  A number of proteins can bind to the actin cytoskeleton.  The binding of a particular protein to F-actin is often desired to support cell biological observations or to further understand dynamic processes due to remodeling of the actin cytoskeleton. The actin co-sedimentation assay is an in vitro assay routinely used to analyze the binding of specific proteins or protein domains with F-actin.  The basic principles of the assay involve an incubation of the protein of interest (full length or domain of) with F-actin, ultracentrifugation step to pellet F-actin and analysis of the protein co-sedimenting with F-actin.  Actin co-sedimentation assays can be designed accordingly to measure actin binding affinities and in competition assays.

Proteins bind to filamentous actin (F-actin) through distinct actin binding modules. In this video we demonstrate the procedure of actin co-sedimentation, which is an in vitro assay routinely used to analyze proteins or specific domains that bind F-actin.

Actina Ensaio Co Sedimentação; para a Análise da proteína de ligação a F-Actina

The actin cytoskeleton within the cell is a network of actin filaments that allows the movement of cells and cellular processes, and that generates ...

Biologia

The Importance of Correct Protein Concentration for Kinetics and Affinity Determination in Structure-function Analysis 

In this study, we explore the interaction between the bovine cysteine protease inhibitor cystatin B and a catalytically inactive form of papain (Fig. 1), a plant cysteine protease, by real-time label-free analysis using Biacore X100. Several cystatin B variants with point mutations in areas of interaction with papain, are produced. For each cystatin B variant we determine its specific binding concentration using calibration-free concentration analysis (CFCA) and compare the values obtained with total protein concentration as determined by A280. After that, the kinetics of each cystatin B variant binding to papain is measured using single-cycle kinetics (SCK). We show that one of the four cystatin B variants we examine is only partially active for binding. This partial activity, revealed by CFCA, translates to a significant difference in the association rate constant (ka) and affinity (KD), compared to the values calculated using total protein concentration. Using CFCA in combination with kinetic analysis in a structure-function study contributes to obtaining reliable results, and helps to make the right interpretation of the interaction mechanism.

The Importance of Correct Protein Concentration for Kinetics and Affinity Determination in Structure-function Analysis

We apply label-free protein interaction analysis using Biacore X100 for structure-function analysis of the binding of several cystatin B mutants to papain through kinetic characterization. Calibration-free concentration analysis (CFCA) measures the concentration of protein with retained binding activity without the need for a standard curve. We show that confirmation of concentrations using CFCA increases the reliability of the kinetic analysis and that kinetic constants can reliably be determined even if the activity of a recombinant protein is reduced.

A importância da concentração de proteína correta para Cinética e Determinação Affinity na estrutura-função Análise

In this study, we explore the interaction between the bovine cysteine protease inhibitor cystatin B and a catalytically inactive form of papain (Fig. 1), ...

Analysis of Gene Expression in Emerald Ash Borer (Agrilus planipennis) Using Quantitative Real Time-PCR

Emerald ash borer (EAB, Agrilus planipennis) is an exotic invasive pest, which has killed millions of ash trees (Fraxinus spp) in North America. EAB continues to spread rapidly and attacks ash trees of different ages, from saplings to mature trees. However, to date very little or no molecular knowledge exists for EAB. We are interested in deciphering the molecular-based physiological processes at the tissue level that aid EAB in successful colonization of ash trees. In this report we show the effective use of quantitative real-time PCR (qRT-PCR) to ascertain mRNA levels in different larval tissues (including midgut, fat bodies and cuticle) and different developmental stages (including 1st-, 2nd-, 3rd-, 4th-instars, prepupae and adults) of EAB. As an example, a peritrophin gene (herein named, AP-PERI1) is exemplified as the gene of interest and a ribosomal protein (AP-RP1) as the internal control. Peritrophins are important components of the peritrophic membrane/matrix (PM), which is the lining of the insect gut. The PM has diverse functions including digestion and mechanical protection to the midgut epithelium.

Analysis of Gene Expression in Emerald Ash Borer Agrilus planipennis Using Quantitative Real Time-PCR

Quantitative real-time PCR (qRT-PCR) is an effective tool to diagnose mRNA levels in different insect tissues and developmental stages. In this report we show the use of qRT-PCR to ascertain mRNA levels in different larval tissues and developmental stages of the invasive insect species, emerald ash borer.

Análise de Expressão Gênica em Emerald Borer Ash ( Agrilus planipennis) Usando Quantitativa em Tempo Real-PCR

Emerald ash borer (EAB, Agrilus planipennis) is an exotic invasive pest, which has killed millions of ash trees (Fraxinus spp) in North America. EAB ...

Quantitation of &gamma;H2AX Foci in Tissue Samples

DNA double-strand breaks (DSBs) are particularly lethal and genotoxic lesions, that can arise either by endogenous (physiological or pathological) processes or by exogenous factors, particularly ionizing radiation and radiomimetic compounds. Phosphorylation of the H2A histone variant, H2AX, at the serine-139 residue, in the highly conserved C-terminal SQEY motif, forming &gamma;H2AX, is an early response to DNA double-strand breaks1. This phosphorylation event is mediated by the phosphatidyl-inosito 3-kinase (PI3K) family of proteins, ataxia telangiectasia mutated (ATM), DNA-protein kinase catalytic subunit and ATM and RAD3-related (ATR)2. Overall, DSB induction results in the formation of discrete nuclear &gamma;H2AX foci which can be easily detected and quantitated by immunofluorescence microscopy2. Given the unique specificity and sensitivity of this marker, analysis of &gamma;H2AX foci has led to a wide range of applications in biomedical research, particularly in radiation biology and nuclear medicine. The quantitation of &gamma;H2AX foci has been most widely investigated in cell culture systems in the context of ionizing radiation-induced DSBs. Apart from cellular radiosensitivity, immunofluorescence based assays have also been used to evaluate the efficacy of radiation-modifying compounds. In addition, &gamma;H2AX has been used as a molecular marker to examine the efficacy of various DSB-inducing compounds and is recently being heralded as important marker of ageing and disease, particularly cancer3. Further, immunofluorescence-based methods have been adapted to suit detection and quantitation of &gamma;H2AX foci ex vivo and in vivo4,5. Here, we demonstrate a typical immunofluorescence method for detection and quantitation of &gamma;H2AX foci in mouse tissues.

Quantitation of &amp;#947;H2AX Foci in Tissue Samples

Quantitation of DNA double-strand breaks on the basis of &gamma;H2AX foci has become an invaluable tool, particularly in radiation biology, for the evaluation of tissue radiosensitivity and effects of radiation modifying compounds. Here we demonstrate the use of an immunofluorescence assay for quantitation of &gamma;H2AX foci in tissue samples.

Quantificação de γH2AX Focos em amostras de tecido

DNA double-strand breaks (DSBs) are particularly lethal and genotoxic lesions, that can arise either by endogenous (physiological or pathological) ...

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans has often been used as a model system in studies of early developmental processes. The transparency of the 
embryos, the genetic resources, and the relative ease of transformation are qualities that make C. elegans an excellent model for early embryogenesis. Laser-based 
confocal microscopy and fluorescently labeled tags allow researchers to follow specific cellular structures and proteins in the developing embryo. For example, 
one can follow specific organelles, such as lysosomes or mitochondria, using fluorescently labeled dyes. These dyes can be delivered to the early embryo by means 
of microinjection into the adult gonad. Also, the localization of specific proteins can be followed using fluorescent protein tags. Examples are presented here 
demonstrating the use of a fluorescent lysosomal dye as well as fluorescently tagged histone and ubiquitin proteins. The labeled histone is used to visualize 
the DNA and thus identify the stage of the cell cycle. GFP-tagged ubiquitin reveals the dynamics of ubiquitinated vesicles in the early embryo. Observations 
of labeled lysosomes and GFP:: ubiquitin can be used to determine if there is colocalization between ubiquitinated vesicles and lysosomes. A technique for 
the microinjection of the lysosomal dye is presented. Techniques for generating transgenenic strains are presented elsewhere (1, 2). For imaging, embryos 
are cut out of adult hermaphrodite nematodes and mounted onto 2% agarose pads followed by time-lapse microscopy on a standard laser scanning confocal 
microscope or a spinning disk confocal microscope. This methodology provides for the high resolution visualization of early embryogenesis.

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

This article describes a technique for the visualization of the early events of embryogenesis in the nematode Caenorhabditis elegans.

Lapso de tempo Microscopia de embriogênese inicial em Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans has often been used as a model system in studies of early developmental processes.  The transparency of the 
embryos, the genetic ...

Manipulating the Murine Lacrimal Gland

The lacrimal gland (LG) secretes aqueous tears necessary for maintaining the structure and function of the cornea, a transparent tissue essential for vision. In the human a single LG resides in the orbit above the lateral end of each eye delivering tears to the ocular surface through 3 - 5 ducts. The mouse has three pairs of major ocular glands, the most studied of which is the exorbital lacrimal gland (LG) located anterior and ventral to the ear. Similar to other glandular organs, the LG develops through the process of epithelial branching morphogenesis in which a single epithelial bud within a condensed mesenchyme undergoes multiple rounds of bud and duct formation to form an intricate interconnected network of secretory acini and ducts. This elaborate process has been well documented in many other epithelial organs such as the pancreas and salivary gland. However, the LG has been much less explored and the mechanisms controlling morphogenesis are poorly understood. We suspect that this under-representation as a model system is a consequence of the difficulties associated with finding, dissecting and culturing the LG. Thus, here we describe dissection techniques for harvesting embryonic and post-natal LG and methods for ex vivo culture of the tissue.

The lacrimal gland (LG) is a branching organ that produces the aqueous components of tears necessary for maintaining vision and ocular health. Here we describe murine LG dissection and ex vivo culture techniques to decipher signaling pathways involved in LG development.

Manipulando o Murino lacrimais Gland

The lacrimal gland (LG) secretes aqueous tears necessary for maintaining the structure and function of the cornea, a transparent tissue essential for ...

Specificity Analysis of Protein Lysine Methyltransferases Using SPOT Peptide Arrays

Lysine methylation is an emerging post-translation modification and it has been identified on several histone and non-histone proteins, where it plays crucial roles in cell development and many diseases. Approximately 5,000 lysine methylation sites were identified on different proteins, which are set by few dozens of protein lysine methyltransferases. This suggests that each PKMT methylates multiple proteins, however till now only one or two substrates have been identified for several of these enzymes. To approach this problem, we have introduced peptide array based substrate specificity analyses of PKMTs. Peptide arrays are powerful tools to characterize the specificity of PKMTs because methylation of several substrates with different sequences can be tested on one array. We synthesized peptide arrays on cellulose membrane using an Intavis SPOT synthesizer and analyzed the specificity of various PKMTs. Based on the results, for several of these enzymes, novel substrates could be identified. For example, for NSD1 by employing peptide arrays, we showed that it methylates K44 of H4 instead of the reported H4K20 and in addition H1.5K168 is the highly preferred substrate over the previously known H3K36. Hence, peptide arrays are powerful tools to biochemically characterize the PKMTs.

Peptide arrays synthesized by the SPOT method can be used to analyze the substrate specificity of Protein lysine methyltransferases (PKMTs) and to define the substrate spectrum of PKMTs to understand their biological role. This protocol describes how to synthesize peptide arrays, methylate them with PKMTs, and analyze the results.

Especificidade Análise de Proteína Lisina Metiltransferases Usando SPOT Peptide Arrays

Lysine methylation is an emerging post-translation modification and it has been identified on several histone and non-histone proteins, where it plays ...

High-resolution Time-lapse Imaging and Automated Analysis of Microtubule Dynamics in Living Human Umbilical Vein Endothelial Cells

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes within individual endothelial cells (ECs). These processes are critical for homeostatic maintenance such as wound healing, and are also crucial in promoting tumor growth and metastasis. EC morphology is defined by the organization of the cytoskeleton, a tightly regulated system of actin and microtubule (MT) dynamics that is known to control EC branching, polarity and directional migration, essential components of angiogenesis. To study MT dynamics, we used high-resolution fluorescence microscopy coupled with computational image analysis of fluorescently-labeled MT plus-ends to investigate MT growth dynamics and the regulation of EC branching morphology and directional migration. Time-lapse imaging of living Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVECs) was performed following transfection with fluorescently-labeled MT End Binding protein 3 (EB3) and Mitotic Centromere Associated Kinesin (MCAK)-specific cDNA constructs to evaluate effects on MT dynamics. PlusTipTracker software was used to track EB3-labeled MT plus ends in order to measure MT growth speeds and MT growth lifetimes in time-lapse images. This methodology allows for the study of MT dynamics and the identification of how localized regulation of MT dynamics within sub-cellular regions contributes to the angiogenic processes of EC branching and migration.

Protocols for Human Umbilical Vein Endothelial Cell (HUVEC) culture, transient transfection of fluorescently-labeled markers of microtubule growth, live-cell imaging and automated analysis of interphase microtubule growth dynamics are detailed.

De alta resolução de imagem Time-lapse e análise automatizada de microtúbulos Dynamics em Viver umbilical humano Células Endoteliais da Veia

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes ...

Dissection of the Auditory Bulla in Postnatal Mice: Isolation of the Middle Ear Bones and Histological Analysis

In most mammals, auditory ossicles in the middle ear, including the malleus, incus and stapes, are the smallest bones. In mice, a bony structure called the auditory bulla houses the ossicles, whereas the auditory capsule encloses the inner ear, namely the cochlea and semicircular canals. Murine ossicles are essential for hearing and thus of great interest to researchers in the field of otolaryngology, but their metabolism, development, and evolution are highly relevant to other fields. Altered bone metabolism can affect hearing function in adult mice, and various gene-deficient mice show changes in morphogenesis of auditory ossicles in utero. Although murine auditory ossicles are tiny, their manipulation is feasible if one understands their anatomical orientation and 3D structure. Here, we describe how to dissect the auditory bulla and capsule of postnatal mice and then isolate individual ossicles by removing part of the bulla. We also discuss how to embed the bulla and capsule in different orientations to generate paraffin or frozen sections suitable for preparation of longitudinal, horizontal, or frontal sections of the malleus. Finally, we enumerate anatomical differences between mouse and human auditory ossicles. These methods would be useful in analyzing pathological, developmental and evolutionary aspects of auditory ossicles and the middle ear in mice.

We present a protocol to isolate the auditory bulla, capsule, and ossicles from postnatal mice for whole mount and histological analysis.

Dissecção da Auditivo Bulla em ratos pós-natais: Isolamento dos ossos do ouvido médio e da análise histológica

In most mammals, auditory ossicles in the middle ear, including the malleus, incus and stapes, are the smallest bones. In mice, a bony structure called ...

Adipo-Clear: A Tissue Clearing Method for Three-Dimensional Imaging of Adipose Tissue

Adipose tissue plays a central role in energy homeostasis and thermoregulation. It is composed of different types of adipocytes, as well as adipocyte precursors, immune cells, fibroblasts, blood vessels, and nerve projections. Although the molecular control of cell type specification and how these cells interact have been increasingly delineated, a more comprehensive understanding of these adipose-resident cells can be achieved by visualizing their distribution and architecture throughout the whole tissue. Existing immunohistochemistry and immunofluorescence approaches to analyze adipose histology rely on thin paraffin-embedded sections. However, thin sections capture only a small portion of tissue; as a result, the conclusions can be biased by what portion of tissue is analyzed. We have therefore developed an adipose tissue clearing technique, Adipo-Clear, to permit comprehensive three-dimensional visualization of molecular and cellular patterns in whole adipose tissues. Adipo-Clear was adapted from iDISCO/iDISCO+, with specific modifications made to completely remove the lipid stored in the tissue while preserving native tissue morphology. In combination with light-sheet fluorescence microscopy, we demonstrate here the use of the Adipo-Clear method to obtain high-resolution volumetric images&#160;of an entire adipose tissue.

Due to the high lipid content, adipose tissue has been challenging to visualize using traditional histological methods. Adipo-Clear is a tissue clearing technique that allows robust labeling and high-resolution volumetric fluorescent imaging of adipose tissue. Here, we describe the methods for sample preparation, pretreatment, staining, clearing, and mounting for imaging.

Adipo-Clear: Um método de compensação por imagem tridimensional do tecido adiposo tecido

Adipose tissue plays a central role in energy homeostasis and thermoregulation. It is composed of different types of adipocytes, as well as adipocyte ...

Methods Article

Manchar o tecido correto Every Time nos Blocos Multi-tecidos