Caracterizar integralmente o microambiente tumoral é essencial na pesquisa de imuno-oncologia. Este ensaio é o primeiro a usar modelos de expressão de saúde baseados em RNA para medir células imunes em tecido tumoral sólido. Este ensaio permite que os pesquisadores obtenham medidas altamente sensíveis e específicas do contexto imunológico nos tecidos tumorais sólidos da FFB e combinem esses resultados em um biomarcador multidimensional.
Todos os tratamentos contra o câncer, não apenas imunoterápicos, provocam uma resposta imune no local do tumor sólido. Medir essa resposta imune é importante para entender a progressão da doença e as respostas terapêuticas. Este protocolo combina técnicas tradicionais de preparação da biblioteca RNA com captura direcionada.
Embora demorado, seguir as etapas de lavagem e monitorar os pontos de verificação de controle de qualidade, como sugerido, é muito importante para o sucesso. Para RNA altamente degradado de amostras incorporadas de parafina fixas formalina, monte a primeira reação de síntese de fios no gelo de acordo com a tabela. Misture minuciosamente as reações ao subir e descer várias vezes antes de girar brevemente as amostras em um microcentrifuuge.
No final da centrifugação, coloque imediatamente as amostras em um cicloviário térmico pré-aquecido seguindo o programa número três da tabela. Para RNA intacto de alta qualidade, monte a primeira reação de síntese de fios no gelo em um tubo PCR sem nuclease, conforme descrito nas tabelas. Para iniciar este procedimento, misture 200 nanogramas da biblioteca de interesse com dois microgramas de DNA COT-1 e dois microliters de oligos de bloqueio em um tubo PCR sem nuclease.
Em seguida, use um concentrador de vácuo definido de 30 a 45 graus Celsius para secar o conteúdo do tubo. Após a hibridização, remova as amostras do ciclor térmico e ajuste o cicloviário térmico para incubar a 65 graus Celsius com a tampa aquecida definida para 70 graus Celsius. Use uma pipeta multicanal para transferir 17 microliters de contas totalmente homogeneizadas para as amostras e pipeta completamente para cima e para baixo 10 vezes.
Para vincular o DNA às contas, coloque os tubos no cicloviário térmico seguindo o programa 10 removendo brevemente os tubos despojados a cada 10 a 12 minutos por três segundos de vórtice suave para manter as contas resuspended. Imediatamente após a incubação de ligação, remova uma tira de tubos do ciclor térmico e adicione 100 microliters de tampão de lavagem pré-aquecido um aos tubos. Pipeta completamente para cima e para baixo 10 vezes e colocar os tubos em um rack magnético para permitir que as contas se separem totalmente da solução de lavagem antes de aspirar o DNA desvinculado contendo supernante.
Remova os tubos do rack e adicione 150 microliters de tampão de lavagem rigoroso pré-aquecido com uma mistura completa para resuspencar completamente as contas tomando cuidado para evitar bolhas. Coloque os tubos de volta no cicloviário térmico a 65 graus Celsius por cinco minutos antes de colocar os tubos de volta no rack magnético para permitir que as contas se separem totalmente dos supernantes. Descarte o DNA desvinculado contendo supernacantes, lave as contas mais uma vez com tampão de lavagem rigoroso pré-aquecido, como apenas demonstrado para um total de duas lavagens rigorosas.
Após a última lavagem, remova o supernascer e adicione 150 microliters de tampão de lavagem de temperatura ambiente um aos tubos. Pipeta a lavagem 10 a 20 vezes para resususpensar completamente as contas e incubar as amostras com a tampa selada por dois minutos alternando entre o vórtice por 30 segundos e descansando por 30 segundos. No final da incubação, centrífuga brevemente e coloque os tubos no rack magnético e remova o sobrenante uma vez que as contas tenham aderido totalmente ao ímã.
Centrifugar os tubos brevemente com as tampas fechadas e devolver as amostras ao rack magnético. Use uma pipeta de 10 microliteres para remover qualquer tampão de lavagem residual e adicione 150 microliters de tampão de lavagem de temperatura ambiente dois. Pipeta a lavagem 10 a 20 vezes para resususpensar completamente as contas e incubar as amostras com as tampas seladas por dois minutos alternando entre o vórtice por 30 segundos e descansando por 30 segundos.
Após uma breve centrifugação, transfira todo o volume de contas de cada tubo para tubos PCR limpos sem nuclease e coloque os tubos no rack magnético. Depois de descartar o DNA desvinculado contendo supernantes, centrifugar brevemente as amostras novamente e usar uma pipeta de 10 microliteres para remover qualquer tampão de lavagem residual das contas enquanto elas estão no rack magnético. Adicione 150 microliters de tampão de lavagem três aos tubos e pipeta para cima e para baixo 10 a 20 vezes para resuspensar completamente as contas.
Incubar o tubo por dois minutos alternando entre 30 segundos de vórtice suave e 30 segundos de descanso antes de centrifugar brevemente. Coloque os tubos sobre o rack magnético para aspirar os supernantes e centrifugar brevemente as amostras de contas novamente. Use uma pipeta de 10 microliteres para remover qualquer tampão de lavagem residual das contas enquanto elas estiverem no rack magnético antes de remover os tubos do rack e reutilizar as contas em 20 microlitrais de água sem nuclease por tubo.
Em seguida, pipeta as contas 10 vezes para garantir que quaisquer contas presas ao lado dos tubos foram resuspended. A presença de dimers adaptadores deve ser avaliada para determinar se a limpeza adicional é necessária. Por exemplo, este eletroferograma mostra um nível aceitável de adaptador dimer que aparece como um pico acentuado em torno de 128 pares de base, enquanto este eletroferograma mostra um nível inaceitável de adaptador dimer.
Os perfis imunológicos pré e pós-tratamento podem ser usados para entender os efeitos de uma terapia específica no microambiente tumoral como nesta análise representativa para a qual as mudanças em percentual para cada célula imune de interesse e o conteúdo imunológico total são mostradas pré e pós-quimioterapia para um único paciente. Nesta análise, as amostras entre grupos de pacientes foram comparadas de acordo com o tempo de progressão da doença após o tratamento. Um subconjunto dos pacientes apresentou recidiva da doença após 18 meses, enquanto outro subconjunto progrediu mais rápido em 18 ou menos meses.
O valor delta mediano poderia então ser comparado para cada amostra para identificar biomarcadores putativos da progressão da doença. Por exemplo, aqui dois genes de fuga imune foram identificados como diferenciais estatisticamente significativos dos agrupamentos amostrais. Como os biomarcadores genéticos individuais eram robustos com clara significância estatística, o biomarcador multidimensional não asse um valor preditivo significativo.
Certifique-se de realizar as lavagens aquecidas uma tira de cada vez para evitar o resfriamento da amostra e lembre-se de transferir as contas para tubos frescos para evitar contaminação fora do alvo. Este protocolo demonstra o uso de modelos de expressão genética para quantificar células imunes e tecido tumoral. Novos modelos estão sendo desenvolvidos para medir estados celulares, como exaustão ou ativação.
