Este trabalho foi financiado por uma concessão do CIHR (MOP394808) e um Research Chair Canadá para CMCEWO foi o destinatário de uma Bolsa de Pós-Graduação do NSERC.

Nota: Este protocolo é amplamente compatível com vários modelos banhados a monocamada de células / tecidos cultura, os regimes de tratamento de drogas e metas em matéria de rotulagem. Assim, em utilização real, muitos parâmetros específicos variam de acordo com delineamento experimental. Aqui, as referências a esses parâmetros definidos pelo usuário são genéricos. Condições exemplo, como utilizado para obter os resultados representativos, são incluídas em itálico. 1. Soluções <ol><li> Preparar o tampão de lavagem através da mistura de 0,1 M Tris-tamponada hipertónica (300 mM) Salino e 0,05% de polissorbato 20; pH 7,4 à temperatura ambiente. </li><li> Preparar um tampão de bloqueio. Para a 0,05 M Tris-tamponada hipertónica (300 mM) Salino adicionar 0,05% de Polissorbato 20, 3% de albumina de soro bovino (BSA) e 0,1% de gelatina de pele de peixe fria e ajustar o pH a 7,4 à temperatura ambiente. </li><li> Prepare diluente de anticorpo através da adição de 0,05% de Polissorbato 20, 1% de BSA, 0,1% de gelatina de pele de peixe fria a 0,05 M de Tris-tamponada hipertónica (300 mM) de solução salina e ajustar o pH para 7,4 a 4 o C. Nota: O pH de tampões Tris é dependente da temperatura. Isto é, uma mudança na temperatura irá alterar o pH da solução. Por razões de consistência, estes tampões de pH deve ser sempre ajustada à temperatura à qual eles vão ser utilizados. </li></ol> 2. Cultura celular Nota: Os protocolos de cultura de células apropriadas irão variar com base no tipo (s) de células utilizado. Estes procedimentos devem ser otimizados separadamente. Metodologias de cultura de células detalhadas estão disponíveis, incluindo 16. Um procedimento semelhante foi utilizado para obter os resultados representativos, com as diferenças notáveis: <ol><li> Cultura neurônios do gânglio dorsal raiz de animais adultos como descrito 12. Use meio de crescimento adulto-neurônio a cultura das células. Reduzir a densidade de células da glia por preplating, em vez de glutamato. Isso resulta em uma cultura neurónio-glia mista cultivadas em 12-lamelas de vidro redondas com, pelo menos, 30-60 neurónios por placa e que acompanham as células gliais cultivadas para approximately confluência de 40%. Deve notar-se que os neurónios em cultura primária não irá replicar e será empurrado para fora da placa por glia co-cultivadas se as células gliais são deixadas crescer excessivamente. A fim de evitar afectar os neurónios, redução física do número gliais é preferível a métodos farmacológicos químicas /. Nota: Para os fins do presente protocolo, assumimos que as células de interesse são cultivadas para sua experimentalmente desejado estado e banhado a monocamada. Nós achamos que plaqueamento em 12-redondas lamelas de vidro em placas de 24 poços para ser mais conveniente. Todos os volumes e os procedimentos descritos são apropriados para uma lamela em um poço de uma placa de 24 poços. </li></ol> 3. Drogas Tratamento das células em cultura Nota: seqüencial múltipla, ou sobreposição, tratamentos medicamentosos são possíveis. As drogas, as doses / concentrações, e durações de exposição utilizado dependerá da experiência específica. <ol><li> Remover o meio de crescimento original é 16 </sup&gt; e substituí-la por meio contendo a droga (s) de interesse, na concentração escolhida (s). Neste caso, usar 10 | iM de morfina solubilizado em soro fisiológico ou solução salina como controlo usar. Nota: É importante que cada repetição independente (geralmente um único de 24 poços de cultura placa) contêm a mesma condição de controlo comum. Isto irá permitir a normalização dos dados através das repetições, que corrige a variabilidade inter-julgamento. </li><li> Incubam-se as células nas condições de crescimento original de 16 para 48 h. </li><li> Para tratamentos com medicamentos seguintes, repita os passos 3.1 e 3.2 com deltorfina 1 PM, SNC80 1 ï¿½, ou veículo e incubar durante 60 min 12. Solubiliza-deltorfina II em água e solubilizar SNC80 a 10 mM em 40 uM HCl e sonicado, diluiu-se a 1 mM em água. Nota: Este protocolo assume a droga (s) foram solubilizados de tal modo que eles podem ser dissolvidos na concentração (ões) desejada no meio de crescimento escolhido. Procedimentos adequados paratais solubilização variará dependendo do fármaco em causa e deve ser optimizado separadamente. </li><li> Lavam-se as células cuidadosamente, três vezes, com ~ 1 ml de tampão de lavagem por lavagem. Executar cada lavagem por aspiração suave do líquido a partir do poço, então, prontamente e suavemente, reenchendo o poço com solução fresca, como desejado (neste caso, com tampão de lavagem). </li></ol> 4. Fixação e Immunocytochemistry Nota: Os objectivos específicos de rotulagem variam de acordo com experiência. Em nosso uso, nós marcado delta receptores opióides (DOR) e Rab5, Rab 11, e LAMP1, como discutido. Os anticorpos específicos utilizados dependerá da experiência específica. Condições óptimas de rotulagem são dependentes do anticorpo específico (s) utilizado. Uma discussão muito mais completa desse tópico é abaixo. <ol><li> Fixar as células por imersão em ~ 300 ul de 4% de paraformaldeído em 0,1 M de solução salina tamponada com fosfato durante 10 min a 37 ºC. Nota: É importante que o parágrafo 4%formaldeído ser preparada devido à autofluorescência causada pelo uso de paraformaldeído previamente congelados. </li><li> Lavam-se as células cuidadosamente, três vezes, com ~ 1 ml de tampão de lavagem por lavagem, como descrito em 3.3. </li><li> Incubar as células em 300 ul de tampão de bloqueio durante 2 horas à TA. </li><li> Incubar as células com anticorpos primários em 300 ml de diluente de anticorpo para 48 horas a 4 ºC. Em nosso uso, os anticorpos primários contra DOR (coelho anti-dor) e um dos seguintes: Rab5 (mouse anti-Rab5), Rab 11 (mouse anti-Rab11), e LAMP1 (cabra anti-LAMP1). </li><li> Lavam-se as células cuidadosamente, três vezes, com ~ 1 ml de tampão de lavagem por lavagem, como descrito em 3.3. </li><li> Incubam-se as células com anticorpos secundários conjugados com fluoróforos diferentes (ver discussão abaixo) em 300 ul de diluente de anticorpo durante 1 hora à TA. Neste, e todos os passos subsequentes, proteger as células da luz. Para obter os resultados representativos, use verde-emitting anti-coelho e eith fluoróforo conjugadoer um fluoróforo-conjugado anti-ratinho-emissor de vermelho ou vermelho-emitting fluoroforo conjugado de anti-cabra. </li><li> Lavam-se as células cuidadosamente, três vezes, com ~ 1 ml de tampão de lavagem por lavagem, como descrito em 3.3. </li><li> Retirar as lamelas 12-redondas de placas de 24 poços, deixando ~ 1 ml de tampão de lavagem em cada poço, segurando a placa em ~ 45º, e alavancar a lamela do chão bem usando uma pinça fina. A lamela venha a assentar contra a parede do poço, de onde ele pode ser facilmente removido usando os fórceps. </li><li> Monte o lamelas, célula-side-down, em lâminas de microscópio com anti-desbotamento meio de montagem. </li></ol> 5. Configurações Microscópio <ol><li> Usando um objetivo grande aumento (100X), primeiro localizar uma célula representante para ser fotografada usando epifluorescência. </li><li> Defina as configurações de captura de imagem para gravar 8 bits imagens TIFF não comprimidos de cada canal marcado (para detecção de cada fluoróforo utilizado, por exemplo, 488 nm e 594 nm), a imagem de cada canal em seqüência (ou por linha ou frame), ea média de 4 a 6 varreduras para a imagem final. Resolução de imagem ideal será específica do microscópio, mas 1024 x 1024 normalmente produz bons resultados. </li><li> Mudar para o caminho de imagem confocal e concentrar a um plano z através do centro da célula. </li><li> Otimizar pinhole (tipicamente uma unidade de Airy), potência de laser, e tensão de tubo fotomultiplicador (ganho) e deslocamento para cada canal. Salvar / gravar essas configurações. Use as mesmas configurações de microscópio para imagiologia todas as células marcadas para qualquer par alvo dada na mesma repetição. Nota: Este processo geralmente resultam em fotodegradação suficientes de que este celular não deve ser trabalhada para análise. </li></ol> 6. Criação de Imagens <ol><li> Utilizando uma objectiva de ampliação elevada (por exemplo, 100x), primeiro localizar uma célula a ser trabalhada utilizando epifluorescência. </li><li> Mudar para o caminho de imagem confocal e concentrar a um plano z através do centro da célula. EUf disponível, zoom software uso / safra para restringir a área de digitalização para a célula de interesse. </li><li> Capturar imagens para cada canal marcado usando as configurações previamente estabelecido. Repita os passos 6.1 a 6.3 para a imagem 15 ou mais células por condição por repetição para assegurar uma amostra suficiente. </li></ol> 7. Análise de co-localização <ol><li> Abra o par de imagens (por exemplo, &#39;verde&#39; e &#39;vermelho&#39;) de uma célula em ImageJ. Use a Imagem&gt; Cor&gt; Mesclar Canais ... comando para gerar uma imagem RGB. </li><li> Desenhe uma seleção em torno da célula de interesse. Use o ImageJ plugin &quot;PSC co-localização&quot; (11; disponível a partir de https://www.cpib.ac.uk/tools-resources/software/psc-colocalization-plugin/) para quantificar as metas de co-localização na célula selecionada. </li><li> Grave a medida co-localização desejada (tipicamente r de Pearson 17). Repita os passos de 7,1-7,3 para cada célula fotografada. </li></ol&gt; 8. Normalização de dados <ol><li> Calcula-se a média dos valores registados de colocalização as condições de controlo comuns de cada réplica de cada condição de rotulagem. Nota: Por exemplo, a média dos valores de co-localização de neurónios no &quot;veículo de 48 horas, veículo de 60 min&quot; condição da droga em cada uma das três repetições independentes em cada uma das três condições de rotulagem (receptor e cada um dos compartimentos 3). </li><li> Multiplicar os meios por (-1), para se obter o deslocamento para cada replicado em cada condição de rotulagem. Adicione o deslocamento para cada replicar em cada condição de rotulagem para cada valor de co-localização em que replicar. Nota: Isto irá normalizar os dados de tal forma que a medida co-localização média para a condição de controlo comum é 0 em cada repetição de cada condição de rotulagem. </li><li> Reúnem-se os dados de todas as repetições de cada condição de rotulagem. Nota: Alterações na co-localização podem agora ser analisado em repetições. Anal estatísticaysis dependerá de concepção experimental, mas tipicamente envolverá a análise de variância (ANOVA) seguido por testes post-hoc apropriados (por exemplo, teste de Tukey). Para obter recursos estatísticos, ver, por exemplo, 18. </li></ol>

<ol>
	<li>Drake, M. T., Shenoy, S. K., Lefkowitz, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trafficking+of+G+protein-coupled+receptors.">Trafficking of G protein-coupled receptors.</a> Circ. Res. 99 (6), 570-582 (2006).</li><li>Hanyaloglu, A. C., von Zastrow, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+GPCRs+by+endocytic+membrane+trafficking+and+its+potential+implications.">Regulation of GPCRs by endocytic membrane trafficking and its potential implications.</a> Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 48, 537-568 (2008).</li><li>Hislop, J. N., von Zastrow, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+ubiquitination+in+endocytic+trafficking+of+G-protein-coupled+receptors.">Role of ubiquitination in endocytic trafficking of G-protein-coupled receptors.</a> Traffic. 12 (2), 137-148 (2011).</li><li>Nagi, K., Pi&#241;eyro, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+opioid+receptor+signalling:+implications+for+the+development+of+analgesic+tolerance.">Regulation of opioid receptor signalling: implications for the development of analgesic tolerance.</a> Mol. Brain. 4 (1), 25 (2011).</li><li>Whistler, J. L., Enquist, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+postendocytic+sorting+of+G+protein-coupled+receptors.">Modulation of postendocytic sorting of G protein-coupled receptors.</a> Science. 297 (5581), 615-620 (2002).</li><li>Von Zastrow, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+opioid+receptors+by+endocytic+membrane+traffic:+mechanisms+and+translational+implications.">Regulation of opioid receptors by endocytic membrane traffic: mechanisms and translational implications.</a> Drug Alcohol Depend. 108 (3), 166-171 (2010).</li><li>Milan-Lobo, L., Whistler, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heteromerization+of+the+&#181;-+and+&#948;-opioid+receptors+produces+ligand-biased+antagonism+and+alters+&#181;-receptor+trafficking.">Heteromerization of the &#181;- and &#948;-opioid receptors produces ligand-biased antagonism and alters &#181;-receptor trafficking.</a> J. Pharmacol. Exp. Ther. 337 (3), 868-875 (2011).</li><li>Wang, H. -. B., Guan, J. -. S., Bao, L., Zhang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+subcellular+distribution+of+delta-opioid+receptor+fused+with+various+tags+in+PC12+cells.">Distinct subcellular distribution of delta-opioid receptor fused with various tags in PC12 cells.</a> Neurochem. Res. 33 (10), 2028-2034 (2008).</li><li>Scherrer, G., Tryoen-T&#243;th, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Knockin+mice+expressing+fluorescent+delta-opioid+receptors+uncover+G+protein-coupled+receptor+dynamics+in+vivo.">Knockin mice expressing fluorescent delta-opioid receptors uncover G protein-coupled receptor dynamics in vivo.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 103 (25), 9691-9696 (2006).</li><li>He, S. -. Q., Zhang, Z. -. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Facilitation+of+&#181;-opioid+receptor+activity+by+preventing+&#948;-opioid+receptor-mediated+codegradation.">Facilitation of &#181;-opioid receptor activity by preventing &#948;-opioid receptor-mediated codegradation.</a> Neuron. 69 (1), 120-131 (2011).</li><li>French, A. P., Mills, S., Swarup, R., Bennett, M. J., Pridmore, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Colocalization+of+fluorescent+markers+in+confocal+microscope+images+of+plant+cells.">Colocalization of fluorescent markers in confocal microscope images of plant cells.</a> Nat. Protoc. 3 (4), 619-628 (2008).</li><li>Ong, E. W., Xue, L., Olmstead, M. C., Cahill, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prolonged+morphine+treatment+alters+&#948;+opioid+receptor+post-internalization+trafficking.">Prolonged morphine treatment alters &#948; opioid receptor post-internalization trafficking.</a> Br. J. Pharmacol. 172 (2), 615-629 (2014).</li><li>Schnell, U., Dijk, F., Sjollema, K. a. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunolabeling+artifacts+and+the+need+for+live-cell+imaging.">Immunolabeling artifacts and the need for live-cell imaging.</a> Nature Methods. 9 (2), 152-158 (2012).</li><li>Rozenfeld, R., Gupta, A., Devi, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+surface+targeting+of+mu-delta+opioid+receptor+heterodimers+by+RTP4.">Cell surface targeting of mu-delta opioid receptor heterodimers by RTP4.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 105 (41), 16045-16050 (2008).</li><li>Gupta, A., Mulder, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+abundance+of+opioid+receptor+heteromers+after+chronic+morphine+administration.">Increased abundance of opioid receptor heteromers after chronic morphine administration.</a> Sci. Signal. 3 (131), ra54 (2010).</li><li>Seibenhener, M. L., Wooten, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+hippocampal+neurons+from+prenatal+mice.">Isolation and culture of hippocampal neurons from prenatal mice.</a> J. Vis. Exp. (65), 1-7 (2012).</li><li>Bolte, S., Cordeli&#232;res, F. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+guided+tour+into+subcellular+colocalization+analysis+in+light+microscopy.">A guided tour into subcellular colocalization analysis in light microscopy.</a> J. Microsc. 224 (Pt 3), 213-232 (2006).</li><li>Field, A., Miles, J., Field, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Discovering Statistics Using R. , (2012).</li><li>Mattioli, T. -. A. M., Milne, B., Cahill, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultra-low+dose+naltrexone+attenuates+chronic+morphine-induced+gliosis+in+rats.">Ultra-low dose naltrexone attenuates chronic morphine-induced gliosis in rats.</a> Mol. Pain. 6, 22 (2010).</li><li>Vogt, R. F., Phillips, D. L., Henderson, L. O., Whitfield, W., Spierto, F. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+differences+among+various+proteins+as+blocking+agents+for+ELISA+microtiter+plates.">Quantitative differences among various proteins as blocking agents for ELISA microtiter plates.</a> J. Immunol. Methods. 101 (1), 43-50 (1987).</li><li>Johnson, I., Spence, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Molecular Probes Handbook. , (2010).</li><li>Morris, T. J., Stanley, E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+for+immunocytochemical+staining+with+multiple+rabbit+polyclonal+antibodies.">A simple method for immunocytochemical staining with multiple rabbit polyclonal antibodies.</a> J. Neurosci. Methods. 127 (2), 149-155 (2003).</li><li>Pawley, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Handbook of Biological Confocal Microscopy. , (2006).</li><li>North, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Seeing+is+believing?+A+beginners&#8217;+guide+to+practical+pitfalls+in+image+acquisition.">Seeing is believing? A beginners&#8217; guide to practical pitfalls in image acquisition.</a> J. Cell Biol. 172 (1), 9-18 (2006).</li><li>Zinchuk, V., Zinchuk, O., Okada, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+colocalization+analysis+of+multicolor+confocal+immunofluorescence+microscopy+images:+pushing+pixels+to+explore+biological+phenomena.">Quantitative colocalization analysis of multicolor confocal immunofluorescence microscopy images: pushing pixels to explore biological phenomena.</a> Acta Histochem. Cytochem. 40 (4), 101-111 (2007).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Nós otimizamos este protocolo para a análise de culturas primárias de adultos neurônios do gânglio da raiz dorsal (neurônios sensoriais primários). Ele também pode ser usado, com pouca ou nenhuma modificação, para células de cultura em monocamada banhado a amplamente. A análise colocalizational também é possível em fatias de tecido e outras preparações 11, no entanto os componentes de tratamento de droga e a fixação do tecido / de preparação não seria adequado. <p class="jove_content...

Receptores, especialmente receptores acoplados a proteína G (GPCRs), são rotineiramente tráfico intracelularmente, de e para a superfície da célula 1. Estes processos complexamente orquestradas e rigidamente controlados ditar complementos de receptores disponíveis das células e regulam a atividade do receptor temporais, a dessensibilização, e ressensibilização 2-4. Mais importante, estes processos são sensíveis a ambientes celulares, incluindo a actividade do receptor induzida por drogas ou inactividade. Isto é, as acções de ligandos nos receptores podem alterar o tráfico intracelular desses receptores, alterando desse modo a capacidade de resposta celular. Desta forma, ligantes externos exercer ainda mais efeitos sobre a função das células, mesmo para além clássicos mensageiro-a-efetoras cascatas 5,6. Examinando tais mudanças no tráfico receptor induzida é difícil. Todas as técnicas disponíveis envolvem limitações. Ensaios de protecção de Biotina foram usadas para monitor receptores de superfície populações. Estes receptores são biotinilados e um curso temporal de imunoprecipi tacões é realizada para quantificar a redução em receptores biotinilados ao longo do tempo. Esta técnica essencialmente monitora a degradação progressiva de um inicial, marcado, a população de receptores 7, e é muito útil na construção de campos de tempo deste processo. Infelizmente, este ensaio não é capaz de monitorar qualquer outro processo de degradação do conjunto inicial de receptores, tais como a internalização, reciclagem, ou novos receptores. Além disso, a adição de um anticorpo na gama de 150kDa para um receptor na gama de 50 kDa pode alterar o tráfico do receptor de 8,9, e esta técnica podem ser difíceis de usar com receptores de baixa nível de expressão. Outros procedimentos usar vários métodos para identificar compartimentos de tráfego intracelular (por exemplo, endosomes, etc.) e avaliar a sua co-localização com os receptores de interesse. Isto inclui os EUAe de sistemas heterólogos que expressam a proteína fluorescente-etiquetados construções quiméricas dos receptores e marcadores compartimento (GTPases por exemplo, Rab-familiares). Isso potencialmente permite o uso de imagens ao vivo de células, removendo questões relacionadas com a fixação e permeabilização. Enquanto poderosa, tal estratégia sofre das mesmas limitações dos sistemas heterólogos em geral: tag e nível de expressão de efeitos no tráfico de comportamento e incompatibilidade com tipos de células mais fisiologicamente representativos. Mais popularmente, corantes são utilizados para marcar facilmente compartimentos intracelulares (por exemplo, lisossomos, ostensivamente) 10. Corantes, no entanto, pode faltar especificidade (todos os organelos acidicos, no caso de corantes para lisossomas) e não avaliam o tráfico através de outros compartimentos. Ainda assim, estas técnicas permitem um controle considerável sobre o sistema e as condições experimentais e podem beneficiar os métodos de análise de co-localização aqui apresentados, abaixo. O método we presentes aqui refina o rastreamento do tráfico receptor por co-localização. Usando imunocitoquímica (ICC) para rotular os marcadores apropriados, é possível identificar os múltiplos compartimentos intracelulares distintos. Isto também permite a utilização de culturas de células primárias fisiologicamente relevantes no lugar de sistemas heterólogos. Este protocolo envolve ICC, que fixa as células de interesse antes da marcação; isso permite rotulagem em um ponto de tempo específico após o tratamento (s) droga. Isso produz um &quot;instantâneo&quot; das associações compartimentos receptor globais naquele ponto no tempo. Com vários momentos, um timecourse de alterações de tráfego também podem ser construídos. Resumidamente, as células são tratadas com droga, marcado para o receptor e o compartimento intracelular de interesse, confocally fotografada, e as fotomicrografias são analisados ​​matematicamente para quantificar a co-localização do receptor e do compartimento 11. No nosso uso, examinámos a co-localização de um receptor com Rab5, Rab11, e lisossomais-associado proteína de membrana 1 (LAMP1). Estes marcadores identificar endosomes cedo, endosomes reciclagem, e os lisossomos, respectivamente. Estas medidas co-localização atuar como proxies para os processos abrangentes de internalização, reciclagem e degradação 12. Tal como acontece com todas as técnicas, algumas limitações devem ser consideradas. Devido à necessidade de imagem cada neurónio individuais analisados, esta técnica pode tornar-se bastante trabalhoso, dependendo do número de condições e pontos de tempo envolvidos. Todos imunomarcação também devem lidar com os efeitos sobre a ultra-estrutura celular, localização de proteínas, e acessibilidade epitopo causados ​​pela fixação e permeabilização 13. Embora originalmente otimizado para uso com culturas primárias de neurônios sensoriais primários, este método é amplamente compatível com outros modelos de cultura banhado a monocamada. O uso de um MEASUR quantificados matematicamentee de co-localização é, nomeadamente, muito mais metodologicamente rigorosas do que as técnicas anteriores utilizados para avaliar alterações de tráfego receptor, que muitas vezes dependiam de medidas vagos, subjetivos, como visualmente inspecionados sobreposições multi-canal 14. Esta técnica é particularmente útil devido à sua grande compatibilidade com in vivo intervenções (antes da geração de cultura primária), in vitro intervenções (durante o crescimento da cultura), e uma variedade de rotulagem como alvo 15. Como tal, ele pode ser adaptado a muitas perguntas de investigação diferentes.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Trizma Base</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T1503-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S9888-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP337-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric Acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td align="right">258148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Albumin from Bovine Serum</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A7906-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin from cold water fish skin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G7041-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Costar Cell Culture Plates: 24-well</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td align="right">720084</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12 circle Microscope Cover Glass</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td align="right">1254580</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aqua/Poly-Mount</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>18606-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Phosphate Monobasic</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S9638-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Phosphate Dibasic</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S9763-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>00380-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 Forceps - Standard/Dumoxel</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11251-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-DOR antibody</td>
			<td>MyBioSource</td>
			<td>MBS316175</td>
			<td>Used at 1:1500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-Rab5 antibody</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>R7904</td>
			<td>Used at 1:750</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-Rab11 antibody</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>05-853</td>
			<td>Used at 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-LAMP1 antibody</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>SC8098</td>
			<td>Used at 1:750</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-rabbit Alexa 488 conjugated antibody</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A-21206</td>
			<td>Used at 1:200 to 1:2000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-mouse Alexa 594 conjugated antibody</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A-11005</td>
			<td>Used at 1:200 to 1:2000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-goat Alexa 594 conjugated antibody</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A-11058</td>
			<td>Used at 1:200 to 1:2000</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

tracking drug-induced changes in receptor post-internalization trafficking by colocalizational analysis

The intracellular trafficking of receptors is a collection of complex and highly controlled processes. Receptor trafficking modulates signaling and overall cell responsiveness to ligands and is, itself, influenced by intra- and extracellular conditions, including ligand-induced signaling. Optimized for use with monolayer-plated cultured cells, but extendable to free-floating tissue slices, this protocol uses immunolabelling and colocalizational analysis to track changes in intracellular receptor trafficking following both chronic/prolonged and acute interventions, including exogenous drug treatment. After drug treatment, cells are double-immunolabelled for the receptor and for markers for the intracellular compartments of interest. Sequential confocal microscopy is then used to capture two-channel photomicrographs of individual cells, which are subjected to computerized colocalizational analysis to yield quantitative colocalization scores. These scores are normalized to permit pooling of independent replicates prior to statistical analysis. Representative photomicrographs may also be processed to generate illustrative figures. Here, we describe a powerful and flexible technique for quantitatively assessing induced receptor trafficking.

Usando esta técnica, é possível quantificar mudanças no receptor tráfico de pós-interiorização seguintes ambos os tratamentos com drogas crônicas / prolongada e agudas. Após os tratamentos de drogas, fixação e rotulagem, de alta resolução microfotografias de dois canais são capturados de cada célula de interesse. Imagens representativas podem ser combinadas com co-localização de cores falsas para gerar figuras ilustrativas (Figura 1). Colocalizational análise subsequente, conforme des...

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Tracking Drug-induced Changes in Receptor Post-internalization Trafficking by Colocalizational Analysis

Tráfico receptor modula a sinalização celular e a capacidade de resposta a ligandos e é, em si, que respondem a condições de células, incluindo a sinalização induzida por ligando. Aqui, descrevemos uma técnica poderosa e flexível para avaliar quantitativamente o tráfico receptor induzida por drogas utilizando imunomarcação ea análise colocalizational.

Rastreando alterações induzidas pela droga em Receptor de Pós-internalização Tráfico de Análise Colocalizational

The intracellular trafficking of receptors is a collection of complex and highly controlled processes. Receptor trafficking modulates signaling and ...

tracking-drug-induced-changes-receptor-post-internalization

Research

JoVE Journal

Biology

8.7K visualizações.  University of California Irvine.  Tráfico receptor modula a sinalização celular e a capacidade de resposta a ligandos e é, em si, que respondem a condições de células, incluindo a sinalização induzida por ligando. Aqui, descrevemos uma técnica poderosa e flexível para avaliar quantitativamente o tráfico receptor induzida por drogas utilizando imunomarcação ea análise colocalizational. 

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Tracking Dynamics of Muscle Engraftment in Small Animals by In Vivo Fluorescent Imaging

Muscular dystrophies are a group of degenerative muscle diseases characterized by progressive loss of contractile muscle cells. Currently, there is no curative treatment available. Recent advances in stem cell biology have generated new hopes for the development of effective cell based therapies to treat these diseases. Transplantation of various types of stem cells labeled with fluorescent proteins into muscles of dystrophic animal models has been used broadly in the field. A non-invasive technique with the capability to track the transplanted cell fate longitudinally can further our ability to evaluate muscle engraftment by transplanted cells more accurately and efficiently.
In the present study, we demonstrate that in vivo fluorescence imaging is a sensitive and reliable method for tracking transplanted GFP (Green Fluorescent Protein)-labeled cells in mouse skeletal muscles. Despite the concern about background due to the use of an external light necessary for excitation of fluorescent protein, we found that by using either nude mouse or eliminating hair with hair removal reagents much of this problem is eliminated. Using a CCD camera, the fluorescent signal can be detected in the tibialis anterior (TA) muscle after injection of 5 x 105 cells from either GFP transgenic mice or eGFP transduced myoblast culture. For more superficial muscles such as the extensor digitorum longus (EDL), injection of fewer cells produces a detectable signal. Signal intensity can be measured and quantified as the number of emitted photons per second in a region of interest (ROI). Since the acquired images show clear boundaries demarcating the engrafted area, the size of the ROI can be measured as well. If the legs are positioned consistently every time, the changes in total number of photons per second per muscle and the size of the ROI reflect the changes in the number of engrafted cells and the size of the engrafted area. Therefore the changes in the same muscle over time are quantifiable. In vivo fluorescent imaging technique has been used primarily to track the growth of tumorogenic cells, our study shows that it is a powerful tool that enables us to track the fate of transplanted stem cells.

Tracking Dynamics of Muscle Engraftment in Small Animals by In Vivo Fluorescent Imaging

We describe an in vivo fluorescence imaging protocol to monitor muscle regeneration by GFP-labeled myoblasts after transplantation into skeletal muscles of both healthy and dystrophic mice. This protocol can be adapted to study muscle regeneration by transplantation of other types of cells and in other muscular conditions as well.

Rastreamento de Dinâmica de enxerto muscular em animais de pequeno In Vivo Fluorescent Imagem

Muscular dystrophies are a group of degenerative muscle diseases characterized by progressive loss of contractile muscle cells. Currently, there is no ...

Biologia

Environmentally Induced Heritable Changes in Flax

Some flax varieties respond to nutrient stress by modifying their genome and these modifications can be inherited through many generations. Also associated with these genomic changes are heritable phenotypic variations 1,2. The flax variety Stormont Cirrus (Pl) when grown under three different nutrient conditions can either remain inducible (under the control conditions), or become stably modified to either the large or small genotroph by growth under high or low nutrient conditions respectively. The lines resulting from the initial growth under each of these conditions appear to grow better when grown under the same conditions in subsequent generations, notably the Pl line grows best under the control treatment indicating that the plants growing under both the high and low nutrients are under stress. One of the genomic changes that are associated with the induction of heritable changes is the appearance of an insertion element (LIS-1) 3, 4 while the plants are growing under the nutrient stress. With respect to this insertion event, the flax variety Stormont Cirrus (Pl) when grown under three different nutrient conditions can either remain unchanged (under the control conditions), have the insertion appear in all the plants (under low nutrients) and have this transmitted to the next generation, or have the insertion (or parts of it) appear but not be transmitted through generations (under high nutrients) 4. The frequency of the appearance of this insertion indicates that it is under positive selection, which is also consistent with the growth response in subsequent generations. Leaves or meristems harvested at various stages of growth are used for DNA and RNA isolation. The RNA is used to identify variation in expression associated with the various growth environments and/or t he presence/absence of LIS-1. The isolated DNA is used to identify those plants in which the insertion has occurred.

Growing some flax varieties under nutrient stress results in genomic variation within a subset of the genome and phenotypic variation. A complex insertion at a specific site is associated with growth under various nutrient regimes and with changes in gene expression around this site.

Ambientalmente induzido mudanças hereditárias em Linho

Some flax varieties respond to nutrient stress by modifying their genome and these modifications can be inherited through many generations. Also ...

Monitoring Equilibrium Changes in RNA Structure by 'Peroxidative' and 'Oxidative' Hydroxyl Radical Footprinting

RNA molecules play an essential role in biology. In addition to transmitting genetic information, RNA can fold into unique tertiary structures fulfilling a specific biologic role as regulator, binder or catalyst. Information about tertiary contact formation is essential to understand the function of RNA molecules. Hydroxyl radicals (&bull;OH) are unique probes of the structure of nucleic acids due to their high reactivity and small size.1 When used as a footprinting probe, hydroxyl radicals map the solvent accessible surface of the phosphodiester backbone of DNA1 and RNA2 with as fine as single nucleotide resolution. Hydroxyl radical footprinting can be used to identify the nucleotides within an intermolecular contact surface, e.g. in DNA-protein1 and RNA-protein complexes. Equilibrium3 and kinetic4 transitions can be determined by conducting hydroxyl radical footprinting as a function of a solution variable or time, respectively. A key feature of footprinting is that limited exposure to the probe (e.g., 'single-hit kinetics') results in the uniform sampling of each nucleotide of the polymer.5
In this video article, we use the P4-P6 domain of the Tetrahymena ribozyme to illustrate RNA sample preparation and the determination of a Mg(II)-mediated folding isotherms. We describe the use of the well known hydroxyl radical footprinting protocol that requires H2O2 (we call this the 'peroxidative' protocol) and a valuable, but not widely known, alternative that uses naturally dissolved O2 (we call this the 'oxidative' protocol). An overview of the data reduction, transformation and analysis procedures is presented.

Monitoring Equilibrium Changes in RNA Structure by &#039;Peroxidative&#039; and &#039;Oxidative&#039; Hydroxyl Radical Footprinting

This protocol describes how to quantify the Mg(II)-dependent formation of RNA tertiary structure by two methods of hydroxyl radical footprinting.

Monitoramento de mudanças na estrutura Equilibrium RNA por &quot;peroxidativo&quot; e &quot;oxidativo&quot; Footprinting Radical Hidroxila

RNA molecules play an essential role in biology. In addition to transmitting genetic information, RNA can fold into unique tertiary structures fulfilling ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) maintain the turnover of all mature blood cell lineages. The coordination of the complex signals leading to specific HSC fates relies upon the interaction between HSCs and the intricate bone marrow microenvironment, which is still poorly understood[1-2].
We describe how by combining a newly developed specimen holder for stable animal positioning with multi-step confocal and two-photon in vivo imaging techniques, it is possible to obtain high-resolution 3D stacks containing HSPCs and their surrounding niches and to monitor them over time through multi-point time-lapse imaging. High definition imaging allows detecting ex vivo labeled hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) residing within the bone marrow. Moreover, multi-point time-lapse 3D imaging, obtained with faster acquisition settings, provides accurate information about HSPC movement and the reciprocal interactions between HSPCs and stroma cells.
Tracking of HSPCs in relation to GFP positive osteoblastic cells is shown as an exemplary application of this method. This technique can be utilized to track any appropriately labeled hematopoietic or stromal cell of interest within the mouse calvarium bone marrow space.

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

The nature of the interactions between hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) and bone marrow niches is poorly understood. Custom hardware modifications and a multi-step acquisition protocol allow the use of two-photon and confocal microscopy to image ex vivo labeled HSPCs homed within bone marrow areas, tracking interactions and movement.

In Vivo Rastreamento 4-Dimensional de tronco hematopoéticas e células progenitoras em adultos mouse na calota craniana de Medula Óssea

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Fecal Glucocorticoid Analysis: Non-invasive Adrenal Monitoring in Equids

Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. During a potentially aversive situation, corticotrophin releasing hormone (CRH) is released from the hypothalamus in the brain. This stimulates the release of adrenocorticotrophic hormone (ACTH) from the pituitary gland, which in turn stimulates release of glucocorticoids from the adrenal gland. In horses the glucocorticoid corticosterone is responsible for several adaptations needed to support equine flight behaviour and subsequent removal from the aversive situation. Corticosterone metabolites can be detected in the feces of horses and assessment offers a non-invasive option to evaluate long term patterns of adrenal activity. Fecal assessment offers advantages over other techniques that monitor adrenal activity including blood plasma and saliva analysis. The non-invasive nature of the method avoids sampling stress which can confound results. It also allows the opportunity for repeated sampling over time and is ideal for studies in free ranging horses. This protocol describes the enzyme linked immunoassay (EIA) used to assess feces for corticosterone, in addition to the associated biochemical validation.

Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. The method offers a non-invasive option to assess long term patterns in both domestic and free ranging horses. This protocol describes the enzyme linked immunoassay involved and the associated biochemical validation.

Fecal Análise de glicocorticóides: Non-invasive Monitoring Adrenal em eqüídeos

Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. During a potentially aversive situation, ...

Analysis of SCAP N-glycosylation and Trafficking in Human Cells

Elevated lipogenesis is a common characteristic of cancer and metabolic diseases. Sterol regulatory element-binding proteins (SREBPs), a family of membrane-bound transcription factors controlling the expression of genes important for the synthesis of cholesterol, fatty acids and phospholipids, are frequently upregulated in these diseases. In the process of SREBP nuclear translocation, SREBP-cleavage activating protein (SCAP) plays a central role in the trafficking of SREBP from the endoplasmic reticulum (ER) to the Golgi and in subsequent proteolysis activation. Recently, we uncovered that glucose-mediated N-glycosylation of SCAP is a prerequisite condition for the exit of SCAP/SREBP from the ER and movement to the Golgi. N-glycosylation stabilizes SCAP and directs SCAP/SREBP trafficking. Here, we describe a protocol for the isolation of membrane fractions in human cells and for the preparation of the samples for the detection of SCAP N-glycosylation and total protein by using western blot. We further provide a method to monitor SCAP trafficking by using confocal microscopy. This protocol is appropriate for the investigation of SCAP N-glycosylation and trafficking in mammalian cells.

Analysis of SCAP N-glycosylation and Trafficking in Human Cells

We describe a modified method for membrane fraction isolation from human cells and sample preparation for the detection of SCAP N-glycosylation and total protein by using western blot. We further introduce a GFP-labeling method to monitor SCAP trafficking using confocal microscopy. This protocol can be used in regular biology laboratories.

Análise do SCAP<em&gt; N</em&gt; -glycosylation E Tráfico de Células Humanas

Elevated lipogenesis is a common characteristic of cancer and metabolic diseases. Sterol regulatory element-binding proteins (SREBPs), a family of ...

Live Cell Imaging and 3D Analysis of Angiotensin Receptor Type 1a Trafficking in Transfected Human Embryonic Kidney Cells Using Confocal Microscopy

Live-cell imaging is used to simultaneously capture time-lapse images of angiotensin type 1a receptors (AT1aR) and intracellular compartments in transfected human embryonic kidney-293 (HEK) cells following stimulation with angiotensin II (Ang II). HEK cells are transiently transfected with plasmid DNA containing AT1aR tagged with enhanced green fluorescent protein (EGFP). Lysosomes are identified with a red fluorescent dye. Live-cell images are captured on a laser scanning confocal microscope after Ang II stimulation and analyzed by software in three dimensions (3D, voxels) over time. Live-cell imaging enables investigations into receptor trafficking and avoids confounds associated with fixation, and in particular, the loss or artefactual displacement of EGFP-tagged membrane receptors. Thus, as individual cells are tracked through time, the subcellular localization of receptors can be imaged and measured. Images must be acquired sufficiently rapidly to capture rapid vesicle movement. Yet, at faster imaging speeds, the number of photons collected is reduced. Compromises must also be made in the selection of imaging parameters like voxel size in order to gain imaging speed. Significant applications of live-cell imaging are to study protein trafficking, migration, proliferation, cell cycle, apoptosis, autophagy and protein-protein interaction and dynamics, to name but a few.

Here we present a protocol to image cells expressing green fluorescent protein-tagged angiotensin type 1a receptors during endocytosis initiated by angiotensin II treatment. This technique includes labeling lysosomes with a second fluorescent marker, and then utilizing software to analyze the co-localization of receptor and lysosome in three dimensions over time.

Imagens de células vivas e Análise 3D da angiotensina Receptor Tipo Tráfico 1a em células do rim Transfectados embrionárias humanas usando microscopia confocal

Live-cell imaging is used to simultaneously capture time-lapse images of angiotensin type 1a receptors (AT1aR) and intracellular compartments in ...

Detection of Ligand-activated G Protein-coupled Receptor Internalization by Confocal Microscopy

Confocal laser scanning microscopy (CLSM) is an optical imaging technique for high-contrast imaging. It is a powerful approach to visualize fluorescent fusion proteins, such as green fluorescent protein (GFP), to determine their expression, localization, and function. The subcellular localization of target proteins is important for identification, characterization, and functional analyses. Internalization is one of the predominant mechanisms controlling G protein-coupled receptor (GPCR) signaling to ensure the appropriate cellular responses to stimuli. Here, we describe an experimental method to detect the subcellular localization and internalization of GPCR in HEK293 cells with confocal microscopy. In addition, this experiment provides some details about cell culture and transfection. This protocol is compatible with a variety of widely available fluorescent markers and is applicable to the visualization of the subcellular localization of a majority of proteins, as well as of the internalization of GPCR. This technique should enable researchers to efficiently manipulate GPCR gene expression in mammalian cell lines and should facilitate studies on GPCR subcellular localization and internalization.

This protocol describes confocal microscopy detection of G protein-coupled receptor (GPCR) internalization in mammalian cells. It includes the basic cell culture, transfection, and confocal microscopy procedure and provides an efficient and easily interpretable method to detect the subcellular localization and internalization of fusion-expressed GPCR.

Detecção de activados por ligandos L acoplado a proteína do receptor de internalização por Microscopia Confocal

Confocal laser scanning microscopy (CLSM) is an optical imaging technique for high-contrast imaging. It is a powerful approach to visualize fluorescent ...

A Graphical User Interface for Software-assisted Tracking of Protein Concentration in Dynamic Cellular Protrusions

Filopodia are dynamic, finger-like cellular protrusions associated with migration and cell-cell communication. In order to better understand the complex signaling mechanisms underlying filopodial initiation, elongation and subsequent stabilization or retraction, it is crucial to determine the spatio-temporal protein activity in these dynamic structures. To analyze protein function in filopodia, we recently developed a semi-automated tracking algorithm that adapts to filopodial shape-changes, thus allowing parallel analysis of protrusion dynamics and relative protein concentration along the whole filopodial length. Here, we present a detailed step-by-step protocol for optimized cell handling, image acquisition and software analysis. We further provide instructions for the use of optional features during image analysis and data representation, as well as troubleshooting guidelines for all critical steps along the way. Finally, we also include a comparison of the described image analysis software with other programs available for filopodia quantification. Together, the presented protocol provides a framework for accurate analysis of protein dynamics in filopodial protrusions using image analysis software.

We present a software solution for semi-automated tracking of relative protein concentration along the length of dynamic cellular protrusions.

Uma interface de usuário gráfica para rastreamento assistido por software da concentração de proteínas em protrusões celulares dinâmicas

Filopodia are dynamic, finger-like cellular protrusions associated with migration and cell-cell communication. In order to better understand the complex ...

Real Time In Vivo Tracking of Thymocytes in the Anterior Chamber of the Eye by Laser Scanning Microscopy

The purpose of the method being presented is to show, for the first time, the transplant of newborn thymi into the anterior eye chamber of isogenic adult mice for in vivo longitudinal real-time monitoring of thymocytes&#180; dynamics within a vascularized thymus segment. Following the transplantation, laser scanning microscopy (LSM) through the cornea allows in vivo noninvasive repeated imaging at cellular resolution level. Importantly, the approach adds to previous intravital T-cell maturation imaging models the possibility for continuous progenitor cell recruitment and mature T-cell egress recordings in the same animal. Additional advantages of the system are the transparency of the grafted area, permitting macroscopic rapid monitoring of the implanted tissue, and the accessibility to the implant allowing for localized in addition to systemic treatments. The main limitation being the volume of the tissue that fits in the reduced space of the eye chamber which demands for lobe trimming. Organ integrity is maximized by dissecting thymus lobes in patterns previously shown to be functional for mature T-cell production. The technique is potentially suited to interrogate a milieu of medically relevant questions related to thymus function that include autoimmunity, immunodeficiency and central tolerance; processes which remain mechanistically poorly defined. The fine dissection of mechanisms guiding thymocyte migration, differentiation and selection should lead to novel therapeutic strategies targeting developing T cells.

Real Time In Vivo Tracking of Thymocytes in the Anterior Chamber of the Eye by Laser Scanning Microscopy

The goal of the protocol is to show longitudinal intravital real-time tracking of thymocytes by laser scanning microscopy in thymic implants in the anterior chamber of the mouse eye. The transparency of the cornea and vascularization of the graft allows for continuously recording progenitor cell recruitment and mature T-cell egress.

No Vivo controle de timócitos na Câmara Anterior do olho a Laser, microscopia eletrônica de varredura em tempo real

The purpose of the method being presented is to show, for the first time, the transplant of newborn thymi into the anterior eye chamber of isogenic adult ...