Animais transgênicos são fundamentais para a pesquisa biomédica moderna, pois permitem estudos da função genética em organismos vivos. Vários métodos de modificações genéticas têm sido aplicados em estudos em animais. Aqui, apresentamos uma técnica amplamente acessível e eficaz que utiliza vetores lentivirais como ferramenta de incorporação transgênica no genoma de um embrião de rato.
Após a administração de gonadotropina coriônica humana, mate cinco semanas de idade Wistar ratos fêmeas um-para-um com sexualmente fértil machos Wistar de três a 10 meses de idade. Às oito às 10.m da manhã seguinte, verifique as fêmeas para a presença de um plugue vaginal e colde os ovidutos das fêmeas com um plugue de acasalamento por no máximo 10.m.
em um prato de coleta contendo meio M2 pré-aquecido. Quando todos os ovidutos tiverem sido coletados, transfira os tecidos para um prato de 35 milímetros contendo meio M2 pré-aquecido complementado com 0,5 miligramas por mililitro de hialuronidase de testículos bovinos e coloque o prato sob um microscópio estéreo. Use fórceps finos para abrir as paredes do oviduto e pressione a ampulla até que os embriões sejam libertados.
Para facilitar a liberação dos embriões das células cumulus, use uma pipeta de transferência de vidro conectada a um tubo aspirador operado pela boca para in pipeta suavemente os embriões para cima e para baixo. Quando todos os embriões tiverem sido liberados, lave as células algumas vezes em meio M2 fresco para remover a hialuronidase e detritos celulares. Transfira os embriões para 50 gotas de microliter individuais de meio M16 pré-equilibrado coberto por óleo mineral em um prato de 60 milímetros.
Em seguida, coloque o prato em uma incubadora umidificada de 37 graus Celsius com uma atmosfera de dióxido de carbono de 5% até sua injeção. Para microinjeção vetorial lentiviral sob a zona pellucida dos embriões de estágio de uma célula, use um puxador de pipeta para preparar capilares de vidro borossilicato de microinjeção com um filamento. Depois de cada vez que o filamento é alterado ou um novo capilar de vidro é usado, execute um teste de rampa para definir os parâmetros ideais.
Em seguida, use uma ponta de microcarregador para carregar aproximadamente dois microliters de solução lentiviral recém-descongelada por pipeta de microinjeção sob uma capa de fluxo laminar de biossegurança. Adicione uma gota de 100 microliter de m2 médio ao centro da tampa de uma placa de Petri de 60 milímetros. Cubra o meio com óleo mineral e monte a pipeta de retenção e o vírus carregou capilar de microinjeção em um micromanipulador.
Coloque o prato de microinjeção sob um microscópio invertido e transfira de 15 a 20 embriões de estágio de uma célula para a gota M2 no prato de microinjeção. Capture um embrião com a pipeta de retenção e use a ampliação 400 vezes e o capilar de vidro para injetar a solução lentiviral sob a zona pellucida no espaço perivitelline segurando o capilar sob a zona pellucida por um momento após a entrega do vírus. Quando todos os embriões forem injetados, use uma pipeta fina para devolver as células injetadas ao prato de cultura e devolver o prato à incubadora de cultura celular até sua implantação.
Para preparar as mães adotivas para a transferência de embriões, mate fêmeas sexualmente maduras de Sprague-Dawley com machos vasectomizados e verifique as fêmeas na manhã seguinte para um plugue vaginal. Depois de confirmar a falta de resposta ao reflexo do pedal nas fêmeas anestesiadas com um plugue viável, aplique pomada nos olhos do animal e raspe a pele da parte de trás de cada animal. Coloque o primeiro rato na posição propensa em uma superfície limpa em uma almofada de aquecimento sob um microscópio cirúrgico.
Cubra o rato com uma cortina estéril com um pequeno orifício cortado sobre a parte inferior das costas e faça uma incisão de pele de aproximadamente dois centímetros paralela à coluna vertebral lombar. Use uma tesoura afiada para fazer um corte na parede abdominal e use fórceps para agarrar uma almofada de gordura ovariana. Puxe o ovário e oviduto para fora da cavidade abdominal em um pedaço de gaze encharcada de cloreto de sódio de 0,9%.
Carregue m2 médio, três bolhas de ar, e os embriões em uma transferência capilar. Use microscisores para fazer uma pequena incisão no oviduto entre o infundibulum e ampulla e inserir a ponta da pipeta de transferência na incisão. Expulse suavemente os embriões e bolhas de ar para dentro do oviduto, em seguida, use fórceps contundentes para colocar o trato reprodutivo de volta na cavidade abdominal.
Suturar a parede abdominal com suturas absorvíveis de ácido poliglicólico e fechar a incisão da pele com clipes de ferida e colocar o animal em uma gaiola limpa em uma placa de aquecimento com monitoramento até a recumbência total. Para vasectomizar potenciais companheiros, depois de preparar o rato macho para cirurgia como demonstrado, use 70% de etanol e um esfoliante cirúrgico para desinfetar a pele sobre os testículos. Pressione suavemente o abdômen para expor os testículos no saco escrotal e cubra o rato com uma cortina estéril com um pequeno orifício sobre o local cirúrgico e use uma tesoura escrotal para fazer uma incisão de 0,5 centímetros no meio do saco.
Empurre cuidadosamente o testífero para a esquerda e localize os vasos deferimento entre os testíferos e a linha média como um duto branco com um único vaso sanguíneo. Use fórceps para puxar suavemente os vasos aferir do saco escrotal e segurar o vaso com fórceps, use uma tesoura fina para remover um fragmento de um centímetro do duto. Repita o procedimento para o segundo teste como apenas demonstrado e feche a pele com suturas absorvíveis de ácido poliglicólico.
Em seguida, coloque o rato em uma gaiola limpa em uma placa de aquecimento com monitoramento até a recumbência total. Neste experimento representativo em que embriões únicos foram injetados várias vezes, oito ratos nasceram de embriões que foram injetados duas vezes, três dos quais foram confirmados para transportar o transgene. Um dos fundadores não transferiu o transgene para a prole e três fêmeas adotivas foram usadas para cada configuração experimental.
A abordagem escolhida permitiu a geração de linhas de ratos transgênicos estáveis que expressavam a proteína de fusão TDP-43-eGFP sob o controle da sinapse neuronal em um promotor em todo o sistema nervoso central. A transgênese baseada em lentivírus resultou em uma única inserção de cópia do transgêgênio, como demonstrado pelo PCR quantitativo. Quando este método foi utilizado para outros vetores lentivirais, observou-se uma taxa de sobrevivência de aproximadamente 90%.
A porcentagem de embriões que sobreviveram às injeções pronucleares foi significativamente menor. No geral, esses resultados sugerem que ratos gestantes podem ser usados como mães adotivas com uma eficiência comparável. Notavelmente, os dados numéricos analisados para rodadas individuais de microinjeção indicaram que a eficácia da implantação dependia diretamente do número de injeções em um embrião e indiretamente na carga viral.
O uso de vetores lentivirais garante a integração genômica e a transmissão do transgênico e facilita uma alta taxa de sobrevivência dos embriões micromanípulos mesmo quando múltiplas injeções subdérmicas são realizadas. Este procedimento pode ser efetivamente aplicado a outras espécies e pode ser considerado uma alternativa para a transgênese convencional.
