This work was funded by Genome BC, Genome Canada, and Coastal Genomics. The authors thank Kirby Cronin and Michael Chan for their help in sample collection and processing. We also would like to acknowledge Thea Van Rossum and Dr. Fiona Brinkman for bioinformatics assistance.

1. Coleta de Água e Filtração <ol><li> Coletar amostras de água doce de vários sites (Figura 1). Passe amostras através de uma série de filtros: filtro de 1 um, 0,2 um filtro, e de 30 kDa de corte de filtro de fluxo tangencial para sistematicamente eucariótica separada, partículas de tamanho bacterianas e virais, respectivamente. Nota: Apenas a purificação e análise do material recuperado nos filtros de 0,2 um (bactérias de vida livre) é descrito neste relatório, mas estratégias semelhantes podem ser usadas para outras partículas recuperadas a partir dos filtros. </li></ol> 2. Concentração bacteriana, ADN Extracção e Purificação <ol><li> Remover o filtro de membrana de 0,2 um (s) a partir do sistema de filtração de água (diagrama esquemático, Figura 2). Dobre o filtro de 0,2 um disco ao meio e coloque-o em um tubo de 50 ml com o lado aberto para cima. Adicionar 5 ml de solução tamponada com fosfato (PBS 1x) e 0,01% de Tween, pH 7,4 emo tubo. Se mais do que um filtro é utilizado durante o processo de empregar um tubo diferente por filtro. Tubo (s) de loja com filtro a 4 ° C até serem processadas. Caso contrário, vá para o passo 2.2. </li><li> Remover o filtro de membrana de 0,2 um a partir do tubo de 50 ml com uma pinça estéril. Ponto de filtro (s) em uma placa de Petri (deixar o tampão PBS no tubo). <ol><li> Com uma pinça estéril e tesoura estéril, cortou o filtro em pequenas tiras (1 cm x 1 cm). Desinfetar pinça e tesouras por imersão em 70% isopropanol, limpando com uma superfície descontaminante DNA e enxaguar com água ultrapura do tipo 1 entre as diferentes amostras. </li></ol></li><li> Colocar o filtro de corte em tiras de volta para o mesmo tubo de 50 ml. Adicionar 10 ml de 1x PBS e 0,01% de Tween, pH 7,4 para o filtro, de modo que há um total de 15 mL de tampão no tubo de 50 ml. </li><li> Adicione 6 esferas de tungstênio limpo (3 mm de diâmetro) para cada tubo de 50 ml, cobrir o tubo com Parafilm e vortex vigorosamente durante 20 min (use 50 ml tubos adaptador vortex). Se multiple filtros são processados ​​a partir de uma amostra, e transferência da piscina todo o homogeneizado para um tubo limpo de 50 ml. Centrifugar os tubos a 3300 xg durante 15 min a 4 ° C. </li><li> Ressuspender o sedimento de células bacterianas e alíquotas (~ 1 ml) em aliquotas de 1,7 ml tubos de microcentrífuga. Note-se que haverá cinco microtubos por amostra. </li><li> Girar os tubos de microcentrífuga a 10000 xg durante 10 min, e remover a maior parte do sobrenadante para baixo de ~ 200 ul marca. </li><li> Armazenar as amostras a -80 ° C, ou prosseguir para extrair ADN bacteriano usando um kit de isolamento de ADN comercialmente disponíveis de acordo com as instruções do fabricante. Durante a utilização de bactérias de extracção de ADN PBS ou água como um controlo negativo de extracção, e E. coli como controlo positivo extracção. </li><li> Como o DNA de vários tubos estão a ser extraídos, piscina sub-alíquotas paralelas a partir de uma mesma amostra em um tubo de 2 ml. Em seguida, conduzir uma precipitação S / N usando uma solução composta por 0,1volumes de acetato de sódio 3M, 2 volumes de etanol a 100%, e 5 uL de 5 ug / ul acrilamida linear. Misturar bem e armazenar amostras a -80 ° C. </li><li> Centrifuga-se a velocidade máxima (17000 xg) durante 30 min a 4 ° C. Lavar pelete com 1 ml de etanol a 70% arrefecido com gelo, ar seco numa câmara de biosegurança para não mais do que 5 minutos e ressuspender o sedimento de ADN em 34 ul de 10 mM Tris-Cl, pH 8,5. Nota: acrilamida linear irá ajudar a visualizar sedimento de DNA após a precipitação S / N. </li><li> Determinar a quantidade de ADN e de qualidade utilizando uma alta sensibilidade do ensaio de quantificação de ácidos nucleicos fluorescente e um espectrofotómetro microvolume, respectivamente, seguindo as instruções do fabricante (ver o quadro de Materiais). Nota: Se várias amostras são preparadas na hora, um ensaio nucleico fluorescente ultrasensitive ácido para quantificar dsDNA e baseado em placa fluorometer / espectrofotômetro pode ser usado em seu lugar. </li></ol> 3. Preparação de ADN da biblioteca <ol><li&gt; Normalizar o ADN genómico bacteriano extraído de amostras de água a uma concentração de ~ 0,2 ng / mL. </li><li> Enzimaticamente fragmento de um nanograma de ADN bacteriano usando um método baseado em transposões (tagmentation). Adicionar sequências de adaptador e de índice para DNA fragmentado seguindo as instruções do fabricante. Objecto tagmented amostras a 12 ciclos de PCR, como indicado nas instruções do fabricante, no ponto em que os índices de sequenciação são incorporados. </li></ol> 4. Automated Gel Seleção Tamanho <ol><li> Ir padrão pós-PCR passo de limpeza descrito nas instruções do fabricante (Ver Tabela de Materiais). Tamanho selecione amostras pós-PCR diretamente usando uma plataforma automatizada de seleção de tamanho com base em gel. <ol><li> Adicionar 3,5 uL de tampão de carga para cada amostra. </li><li> Seguindo o protocolo do fabricante, carregar as amostras para a estação de trabalho electroforese, especificando um tamanho alvo-selecção de 500-800 pb, num extracto de 300 uldo volume de iões, utilizando um pré-moldado de 1,5% de agarose a cassete. </li><li> Concentra-se o material resultante em bruto (300 uL) para baixo para 25 ul por precipitação com etanol. Nota: Como alternativa, use a estação de trabalho de eletroforese para automatizar concentração para um maior número de amostras através de placa de filtro e tubo de vácuo. <ol><li> Precipitar o volume de eluição em bruto utilizando 0,1 volumes de acetato de sódio 3M, 2 volumes de etanol a 100% e 5 uL de 5 ug / ul acrilamida linear. Misture bem, coloque as amostras a -80 ° CO / N. Centrifugar as amostras a 17.000 xg durante 30 min. </li><li> Rejeitar sobrenadante e prosseguir a lavagem sedimento de DNA com 1 mL de etanol gelado a 70%. </li><li> Centrifugar as amostras novamente a 17.000 xg durante 30 min, os sobrenadantes descartar, ar seco, e finalmente ressuspender pelota de ADN em 25 ul de 10 mM Tris-Cl, pH 8,5. </li></ol></li></ol></li><li> (Opcional) Use 1 ml de tamanho bibliotecas de DNA selecionado com a plataforma de seleção de tamanho de gel automatizado para fazer um cincodiluição -fold usando uma solução tampão de Tris-EDTA, pH 8,0. Analisar bibliotecas utilizando um instrumento de eletroforese capilar baseada em chip para analisar a qualidade de dsDNA de acordo com as instruções do fabricante. </li></ol> 5. Biblioteca Normalização e Sequencing <ol><li> Prossiga para normalizar amostras utilizando contas de normalização de biblioteca (incluído no kit de preparação biblioteca baseada transposon), conforme descrito no guia de preparação do fabricante. <ol><li> Alternativamente, bibliotecas de dsDNA medir utilizando um ensaio de quantificação de ácido nucleico de alta sensibilidade fluorescente, seguido por agrupamento em proporções equimolares até atingir uma concentração final de 2 nM dsDNA. Avance para desnaturar bibliotecas utilizando 10 ul de bibliotecas reunidas e 10 ul de NaOH 0,2 N, incubar durante 5 min à TA. Diluir bibliotecas desnaturados utilizando tampão de hibridação (incluída com o kit de preparação à base de transposão) para um volume final de 1 ml e a concentração de 23:05. </li></ol></li><li> Amostra de cargas em uma plataforma de sequenciamento de próxima geração, seguindo os protocolos de seqüenciamento padrão do fabricante. </li></ol>

<ol>
	<li>Siuda, W., Chrost, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concentration+and+susceptibility+of+dissolved+DNA+for+enzyme+degradation+in+lake+water+-+some+methodological+remarks.">Concentration and susceptibility of dissolved DNA for enzyme degradation in lake water - some methodological remarks.</a> Aquatic Microbial Ecology. 21, 195-201 (2000).</li><li>Ficetola, G. F., Miaud, C., Pompanon, F., Taberlet, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Species+detection+using+environmental+DNA+from+water+samples.">Species detection using environmental DNA from water samples.</a> Biology letters. 4, 423-425 (2008).</li><li>Liles, M. 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A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+large+genome+center's+improvements+to+the+Illumina+sequencing+system.">A large genome center's improvements to the Illumina sequencing system.</a> Nature methods. 5, 1005-1010 (2008).</li><li>Marine, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+a+transposase+protocol+for+rapid+generation+of+shotgun+high-throughput+sequencing+libraries+from+nanogram+quantities+of+DNA.">Evaluation of a transposase protocol for rapid generation of shotgun high-throughput sequencing libraries from nanogram quantities of DNA.</a> Applied and environmental microbiology. 77, 8071-8079 (2011).</li><li>Rohland, N., Reich, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cost-effective+high-throughput+DNA+sequencing+libraries+for+multiplexed+target+capture.">Cost-effective high-throughput DNA sequencing libraries for multiplexed target capture.</a> Genome research. 22, 939-946 (2012).</li><li>Lamble, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+workflows+for+high+throughput+library+preparation+using+the+transposome-based+nextera+system.">Improved workflows for high throughput library preparation using the transposome-based nextera system.</a> Bmc Biotechnology. 13, (2013).</li><li>Picelli, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tn5+transposase+and+tagmentation+procedures+for+massively+scaled+sequencing+projects.">Tn5 transposase and tagmentation procedures for massively scaled sequencing projects.</a> Genome research. , (2014).</li><li>Rhodes, J., Beale, M. A., Fisher, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Illuminating+Choices+for+Library+Prep:+A+Comparison+of+Library+Preparation+Methods+for+Whole+Genome+Sequencing+of+Cryptococcus+neoformans+Using+Illumina+HiSeq.">Illuminating Choices for Library Prep: A Comparison of Library Preparation Methods for Whole Genome Sequencing of Cryptococcus neoformans Using Illumina HiSeq.</a> PloS One. 9, e113501 (2014).</li></ol>

Jared R. Slobodan e Matthew J. Nesbitt tanto deter ações da Coastal Genomics, uma empresa British Columbia propriedade privada oferecendo a tecnologia Ranger.

A presença de dímeros de adaptador e aglomeração de pequenas dimensões de inserção preferencialmente sendo sequenciados em plataformas atuais representam uma diminuição nos rendimentos utilizáveis ​​e subutilização da capacidade do equipamento 15. A utilização de métodos de batimento grânulos combinados com uma abordagem baseada no transposão para preparar bibliotecas podem resultar em mais de cisalhamento de ADN em comparação com os outros métodos de extracção de 4,5. No ...

Metagenomics involves the sequencing of all the genetic material in a sample to characterize the microbial communities present. It is a complex and expensive process which involves the conversion of extracted nucleic acids into DNA libraries followed by next-generation sequencing. High quality libraries are essential for maximal data output and accurate metagenomics analysis. Environmental samples, such as water samples, often pose significant challenges to generating high quality libraries, due to low amounts of DNA that may also be degraded1-3 and the presence of inhibitors of PCR4-6. 
High quality libraries ideally consist of longer segments of DNA within a narrow range of lengths. In order to maximize the amount of useful data generated per sequencing run, the length of the DNA in the library should be at least as long as the maximum read length of the sequencing method being used. When using a sequencing-by-synthesis technology such as the Illumina MiSeq, the size of the DNA fragments affects the efficiency at which clusters are generated on the flow cell. For instance, when a library contains both shorter and longer DNA fragments, the shorter ones will be over-represented in the sequencing data7,8. In contrast, a library with similarly sized DNA fragments will be proportionally represented in the sequencing data. Many library preparation kits use ligation-based methods to add adapters to the DNA fragments and size selection is necessary to remove adapter dimers that do not contain an insert9,10. There are numerous methods11,12 to achieve this but the one technique that gives the most consistent results is the electrophoretic separation of DNA followed by the recovery of the desired lengths of DNA13,14. This process can be performed manually for a small number of samples, but when faced with processing hundreds of samples, automated solutions are required. The currently available platforms for automated gel size selection are low throughput and new platforms are needed to process large numbers of samples for sequencing. The Ranger Technology can be integrated with existing liquid handling workstations to enable the use of agarose gel electrophoresis for size selection and analytical purposes on a scale that satisfies today&#8217;s high throughput environment.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Peristaltic pump Masterflex P/S 1400 Series</td>
			<td>Thermo Scientific&#160;</td>
			<td>1400-1620</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.2 &#181;m Supor Membrane</td>
			<td>VWR</td>
			<td>CA28143-969</td>
			<td>Pall Corporation, Ann Harbor, MI</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tungsten carbide beads 3 mm (200)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>69997</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl alcohol 70%</td>
			<td>Jedmon Products</td>
			<td>825751</td>
			<td>Healthcare Plus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA away</td>
			<td>VWR</td>
			<td>7010</td>
			<td>Molecular BioProducts, Inc. San Diego, CA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Milli-Q water purification system</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>ZMQS6VF0Y</td>
			<td>Merck Millipore. This system has been discontinued.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 X PBS pH 7.5</td>
			<td>VWR</td>
			<td>E703-1L</td>
			<td>Amresco, Inc., Solon, OH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP337-100</td>
			<td>Fisher chemicals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex adapter for 2 (50 ml) tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>13000-V1-50</td>
			<td>MoBio, Carlsbad, CA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex-Genie 2, 120V (Model G560)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>SI-0236</td>
			<td>Scientific Industries, Inc.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beckman Centrifuge</td>
			<td>Raeyco Lab Equipment Systems Management Ltd</td>
			<td>Model J-6B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PowerLyzer Powersoil DNA isolation kit</td>
			<td>VWR</td>
			<td>12855-100</td>
			<td>MoBio, Carlsbad, CA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex adapter for 24 (1.5-2 ml) tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>13000-V1-24</td>
			<td>MoBio, Carlsbad, CA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microfuge 18 centrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>367160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nimbus Select workstation with Ranger Technology</td>
			<td>Hamilton Robotics</td>
			<td>92720-01</td>
			<td>Includes the liquid handling workstation and integrated Ranger Tech (electrophoresis hardware)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ranger reagent kit</td>
			<td>Coastal Genomics</td>
			<td>CG-10600-150-12-21</td>
			<td>Includes loading buffer and cassettes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl alcohol (anhydrous)</td>
			<td>Commercial Alcohols</td>
			<td>P016EAAN</td>
			<td>Greenfield Ethanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium acetate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2889-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Linear acrylamide (5 mg/ml)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>AM9520</td>
			<td>Ambion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf refrigerated centrifuge</td>
			<td>Raeyco Lab Equipment Systems Management Ltd.</td>
			<td>5417R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffer EB (250 ml)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>19086</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop 1000 Spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>ND-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit fluorometer</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Q32857</td>
			<td>Invitrogen. This product has been discontinued.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit dsDNA HS assay kit</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Q32854</td>
			<td>Invitrogen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High sensitivity DNA reagent</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>5067-4626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High sensitivity DNA chips</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>5067-4626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent 2011 Bioanalyzer</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>G2938B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nextera XT DNA sample preparation kit</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>FC-131-1024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nextera XT index kit</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>FC-131-1001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MiSeq reagent kit v2 (500-cycles)</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>MS-102-2003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Miseq system</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>SY-410-1003</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

automated gel size selection to improve the quality of next-generation sequencing libraries prepared from environmental water samples

Next-generation sequencing of environmental samples can be challenging because of the variable DNA quantity and quality in these samples. High quality DNA libraries are needed for optimal results from next-generation sequencing. Environmental samples such as water may have low quality and quantities of DNA as well as contaminants that co-precipitate with DNA. The mechanical and enzymatic processes involved in extraction and library preparation may further damage the DNA. Gel size selection enables purification and recovery of DNA fragments of a defined size for sequencing applications. Nevertheless, this task is one of the most time-consuming steps in the DNA library preparation workflow. The protocol described here enables complete automation of agarose gel loading, electrophoretic analysis, and recovery of targeted DNA fragments. 
In this study, we describe a high-throughput approach to prepare high quality DNA libraries from freshwater samples that can be applied also to other environmental samples. We used an indirect approach to concentrate bacterial cells from environmental freshwater samples; DNA was extracted using a commercially available DNA extraction kit, and DNA libraries were prepared using a commercial transposon-based protocol. DNA fragments of 500 to 800 bp were gel size selected using Ranger Technology, an automated electrophoresis workstation. Sequencing of the size-selected DNA libraries demonstrated significant improvements to read length and quality of the sequencing reads.

Concentração DNA, e Avaliação da Qualidade As concentrações de DNA bacterianas, variou de 0,01-0,11 ng ​​/ ml por amostra de água dos diferentes sítios de bacias (Tabela 1). O ADN isolado a partir de uma fracção bacteriana teve 260/280 e 260/230 A rácios de 1,4 a 1,8 e 0,3 a 1,6, respectivamente. Enquanto alguns dos rácios Um 260/230 foram relativamente baixos, não foi observada inibição aparente na bibliot...

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Automated Gel Size Selection to Improve the Quality of Next-generation Sequencing Libraries Prepared from Environmental Water Samples

This manuscript describes an automated gel size selection approach for purifying DNA fragments for next-generation sequencing. The Ranger Technology provides complete automation of the entire process of agarose gel loading, electrophoretic analysis, and recovery of targeted DNA fragments allowing for high-throughput and high quality next-generation sequencing libraries.

Automated Gel seleção de tamanho para melhorar a qualidade das bibliotecas de sequenciação de próxima geração Preparado a partir de amostras de água do ambiente

Next-generation sequencing of environmental samples can be challenging because of the variable DNA quantity and quality in these samples. High quality DNA ...

automated-gel-size-selection-to-improve-quality-next-generation

Research

JoVE Journal

Environment

10.4K visualizações.  The University of British Columbia. This manuscript describes an automated gel size selection approach for purifying DNA fragments for next-generation sequencing. The Ranger Technology provides complete automation of the entire process of agarose gel loading, electrophoretic analysis, and recovery of targeted DNA fragments allowing for high-throughput and high quality next-generation sequencing libraries. 