Este método experimental permite o armazenamento a longo prazo das células individuais reutilizáveis para testes epigenômicos. Também permite a análise de muitas marcas epigenéticas e fatores de transcrição em uma mesma célula. Nos métodos atuais de análise do epigenoma de uma única célula, as mesmas células individuais não podem ser reanalisadas.
No entanto, com células únicas reutilizáveis, as mesmas células individuais podem ser reanalisadas muitas vezes. Esta técnica é útil para o diagnóstico e planejamento da terapia epigenética, particularmente quando as células do paciente são limitadas em número. Este método é mais adequado para o estudo do epigenoma, a regulação da expressão gênica e outros sistemas, desde que anticorpos específicos para marcas epigenéticas estejam disponíveis.
Quando você tentar essa técnica pela primeira vez, recomendamos que você pratique em amostras que não são muito preciosas e valide o experimento usando sequenciamento superficial, como MiSeq ou iSeq 100. Para começar, em uma capela de fluxo laminar limpa, misture um mililitro de suspensão celular e 199 mililitros de um milimolar EDTA PBS contendo um corante intercalador para DNA. Após a mistura, transfira 200 microlitros da suspensão celular para cada poço da placa de fundo plano de 96 poços.
Coloque a tampa na placa de 96 poços e digitalize a placa usando um microscópio de varredura. Em seguida, incline a placa e aguarde alguns minutos até que a única célula tenha afundado na borda inferior do poço. Em seguida, coloque a ponta da pipeta no canto inferior e transfira a célula única e o buffer para um tubo de PCR.
Verifique o poço usando um microscópio de fluorescência para confirmar a transferência. Se uma única célula ainda estiver no poço, adicione 200 microlitros por poço de um PBS de EDTA milimolar contendo um corante intercalador para DNA e repita a transferência. Após a transferência, coloque uma tampa na placa de PCR de 96 poços e centrifugue a placa usando um rotor oscilante sem quebra.
Após a centrifugação, coloque a placa no convés de um robô automático de manuseio de líquidos. Em seguida, arraste e solte o código suplementar um para a janela de software do robô de manuseio de líquidos e execute o programa para remover 195 microlitros do sobrenadante com uma velocidade de pipetagem muito lenta. Adicione 50 microlitros de 4%TEMED ou óleo mineral e incube a placa durante a noite à temperatura ambiente.
No dia seguinte, remova o óleo mineral por pipetagem e lave as células cinco vezes com 200 microlitros de tampão TP magnésio negativo. Após a última lavagem, retire o sobrenadante, adicione 15 microlitros de tampão de recozimento e incube no gelo por uma hora. Após a incubação, coloque os tubos de PCR em um termociclador e aqueça a 94 graus Celsius por três minutos.
Em seguida, transfira os tubos para um bloco de metal resfriado por gelo e incube por dois minutos. Em seguida, adicione quatro microlitros de sulfato de magnésio e cloreto de sódio, mistura DNTP e misture por vórtice em velocidade máxima. Em seguida, adicione um microlitro de fragmento grande de polimerase BST, misture por vórtice e incube por quatro horas em um agitador.
Após a incubação, coloque o tubo de PCR em um termociclador e execute um programa de quatro horas ou durante a noite, conforme descrito no texto. Para ligação de anticorpos, adicione 1,625 microlitros de solução de cloreto de sódio EDTA BSA ao tubo. Misture por vórtice em baixa velocidade e incube o tubo no gelo por uma hora.
Em seguida, adicione 0,1 microgramas por mililitro de anticorpo e controle a IgG conjugada com a sonda de anticorpos. Depois de adicionar os anticorpos, incube os tubos no gelo com agitação suave. No dia seguinte, lave as células duas vezes com 200 microlitros de tampão TPM-T no gelo.
Em seguida, remova o sobrenadante e lave uma vez com tampão T4 DNA ligase. Em seguida, adicione 19 microlitros de solução adaptadora de ligadura e incube por uma hora a 25 graus Celsius. Em seguida, adicione uma ligase de DNA T4 de microlitro e misture o tubo por vórtice em velocidade média.
Coloque o tubo em um termociclador e execute o programa de ligadura de proximidade. Após a corrida, lave as células duas vezes com 200 microlitros de tampão positivo para EDTA BST magnésio negativo e armazene as células durante a noite a quatro graus Celsius. No dia seguinte, lavar as células duas vezes com 200 microlitros de tampão BST magnésio negativo para EDTA negativo e adicionar 20 microlitros de uma mistura contendo BST, DNTPs e sulfato de magnésio.
Em seguida, misture com um misturador de vórtices e incube o tubo por quatro horas em um agitador orbital. Após a incubação, coloque o tubo em um termociclador e execute o programa de extensão completo conforme descrito no manuscrito do texto. Em seguida, para amplificação de deslocamento múltiplo, adicionar 0,4 microlitros de 100 micromolares segundo primer aleatório e misturar por vórtice.
Em seguida, incube o tubo por duas horas em um agitador orbital antes de colocá-lo em um termociclador para aquecimento a 94 graus Celsius. Após três minutos, coloque os tubos em um bloco metálico resfriado por gelo e adicione um microlitro de BST DNA polimerase. Vórtice os tubos em velocidade lenta.
Em seguida, coloque os tubos em um termociclador para executar o programa de amplificação de deslocamento múltiplo. Após o programa, transfira aproximadamente 20 microlitros de sobrenadante para um tubo de PCR e armazene-o a 80 graus Celsius negativos. Em seguida, adicione 20 microlitros de tampão TWEEN 20 0,05% e 0,1X TE a um tubo de PCR contendo a célula única reutilizável e incube o tubo durante a noite a quatro graus Celsius.
No dia seguinte, recolher o sobrenadante e combiná-lo com o sobrenadante coletado anteriormente. Em seguida, mergulhe o tampão reutilizável de célula única e TBS contendo 50% de glicerol, cinco milimolares de EDTA, 0,5% de BSA e 0,05% de TWEEN 20 e, em seguida, incube-o por 30 minutos em um agitador orbital. Após a incubação, armazene a célula única reutilizável a menos 20 graus Celsius até nova utilização.
Finalmente, adicione 40 microlitros de mistura mestre negativa Exo e coloque o tubo em um termociclador para executar o programa conforme descrito no manuscrito do texto. Células individuais reutilizáveis K562 foram geradas usando este protocolo. Células isoladas foram incluídas na camada externa do cordão de poliacrilamida e visualizadas usando um corante intercalador para coloração de DNA.
Produtos de DNA antes e depois da digestão BciVI são mostrados aqui. A digestão da enzima de restrição gerou os esperados 19 a 20, 31 a 32, 49 e mais de 49 fragmentos de pares de bases. Além disso, a biblioteca de DNA construída foi analisada por eletroforese capilar para os produtos desejados.
Os resultados do sequenciamento indicaram que as leituras mapeadas únicas do anti-histona H3 lisina acetilada 27 e anti-histona H3 trimetilado lisina 27 foram significativamente mais numerosas do que da IgG controle. Os sinais de sequenciamento REpi foram avaliados comparando-se os dados de sequenciamento REpi com os dados de sequenciamento ChIP em massa. Em média, aproximadamente 91% dos sinais de lisina acetilada 27 da histona H3 do sequenciamento REpi se sobrepuseram aos picos de lisina acetilada 27 da histona H-3 no sequenciamento de ChIP em massa.
A precisão do sequenciamento de REpi para a marca de histona inativa, histona H3 lisina trimetilada 27 foi de 52%A sensibilidade do sequenciamento de REpi foi analisada para medir quantos picos de sequenciamento de ChIP em massa foram detectados por leituras reproduzidas de sequenciamento de REpi. A sensibilidade do sequenciamento REpi foi de 55,30% na histona H3 lisina acetilada 27 e de 50,94% na histona H3 lisina trimetilada 27. Certifique-se de usar reagentes sem DNS.
Além disso, todas as operações que envolvam os cabos de abertura do tubo ou os condutores de reagente devem ser realizadas em uma coifa limpa. Os produtos de DNA desse procedimento são sequenciados e, em seguida, mapeados ao genoma para revelar quais modificações de histonas estão presentes, em quais regiões do genoma em células únicas. Essa tecnologia possibilitou a análise de múltiplas marcas epigenéticas em uma mesma célula e abriu caminho para a análise multiômica em uma única célula.
