We thank Wendy Zhang, Austin Tom, Jacquie Janney, Erin Lemley, and Brittany Janney for assistance with plant growth and extractions, Dr. Anatoli Lygin for assistance with chromatographic analyses, and Syngenta Crop Protection for funding.

1. Planta Material, condições de crescimento, e vegetativo Clonagem Nota: Três populações waterhemp foram investigados nesta pesquisa: MCR (do Condado de McLean, IL), ACR (a partir de Adams County, IL), e WCS (a partir de Wayne County, IL) (Tabela 1). <ol><li> Coletar e suspender sementes waterhemp em 0,1 g L -1 de ágar: solução de água a 4 ° C durante pelo menos 30 dias para melhorar a germinação. Nota: Algumas populações waterhemp estão dormentes, mas este passo ajuda a superar a dormência de sementes e fazer germinar mais uniformemente. </li><li> Germinar sementes de cada população waterhemp (como na Tabela 1) em 12 x 12 cm tabuleiros contendo um meio de envasamento em estufa. <ol><li> Manter condições de estufa em 28/22 ° C temperaturas dia / noite dentro de um fotoperíodo 16/8 hr 12. </li><li> Suplemento de luz natural da estufa com luz de lâmpadas de halogeneto de mercúrio para fornecer um mínimo de 500 umol m -2 </sup&gt; fluxo seg1 fóton no nível da planta dossel. </li></ol></li><li> Transplante mudas surgiu quando eles são 2 cm de altura em 80 cm 3 vasos em casa de vegetação. </li><li> O transplante das plântulas em 950 cm 3 vasos contendo uma mistura 3: 1 de mistura de envasamento:: 1: 1 de solo: areia de turfa: quando mudas são 4 cm de altura. Adicionar 5 g de grânulos de libertação lenta de fertilizantes para cada vaso e misturar esta mistura com o solo. </li><li> Cortar e remover o meristema apical contendo as três folhas mais novas a partir de 7 cm plantas altas para eliminar dominância apical. Nota: Esta etapa garante que cada planta vai crescer o suficiente tiros três centímetros axilares para clonar. </li><li> Especiais de Consumo cinco rebentos axilares (3 cm de comprimento), quando mudas são cerca de 14 cm de altura de cada população waterhemp (como na Tabela 1). Remover a maior parte das folhas de rebentos axilares desses para diminuir a perda de água após a subsequente manuseamento, mas mantêm as duas folhas mais jovens para permitir um maior crescimento em cima do transplante. <br/&gt; Nota: Manusear com cuidado e tentar não danificar os rebentos quando a remoção das folhas. Etiquetar cada planta com uma estaca. </li><li> Transplante axilar atira em 80 cm 3 vasos (uma de mudas por vaso) em substrato, que é o mesmo meio utilizado para a germinação. Substrato deve ser saturado inicialmente até formar raízes na câmara de crescimento, em seguida, manter a umidade e coloque panelas constantes na câmara de crescimento durante 7 dias para estabelecer raízes. Nota: As plantas são muito sensíveis, neste ponto e não deve ser salientado. <ol><li> Manter o crescimento em condições de câmara 28/22 ° C temperaturas dia / noite dentro de um fotoperíodo 16/8 hr 12. </li><li> Uma combinação de lâmpadas incandescentes e fluorescentes pode ser utilizada para fornecer a luz na câmara de crescimento e deve fornecer, pelo menos, 550? Mol m -2 s -1 fluxo de fotões em planta nível calote 12. </li></ol></li><li> Transplante de novo em 950 cm 3 potes (uma muda por vaso) containing uma mistura 3: 1 de mistura de envasamento:: 1: 1 de solo: turfa: areia (também incluem 5 g de liberação lenta grânulos de fertilizantes) quando as plantas clonadas são 4 cm de altura, em seguida, transferir de volta para o efeito estufa. </li><li> Clonar as plantas uma segunda vez usando o mesmo método descrito acima (ou seja, repetir as etapas 1,5-1,8, e, em seguida, vá para o passo 2.1). Para um estudo típico curso de tempo, gerar clones a partir de, pelo menos, seis usinas independentes de cada população waterhemp e gravá-los como linhas MCR 1-6, 1-6 e ACR WCS 1-6. <ol><li> Estabelecer pelo menos seis &quot;pai&quot; linhas clonais distintos, a fim de repetir a experiência e adequadamente representar a variabilidade genética dentro de cada população waterhemp. </li><li> Dependendo de quantos pontos serão analisados ​​tempo, gerar sub-clones suficientes de cada um &quot;pai&quot; linha clonal para realizar um estudo curso de tempo. </li></ol></li></ol> 2. Realização de um estudo de metabolismo com extirpado Waterhemp Leaves <ol><li> Extirpar o terceiro mais jovens folhas (2 a 3 cm de comprimento; incluem 0,5 cm de pecíolo ligado) quando as plantas waterhemp clonados são de 10 a 12 cm de altura para o metabolismo do herbicida ea DT 50 análise. </li><li> Pecíolos Cut folha de cada planta waterhemp uma segunda vez (assegurando que 0,3 cm de pecíolo permanece) sob a água, e coloque estas extremidades cortadas em 1,5 ml frascos de plástico (uma folha por frasco) 15. Nota: Cortando uma segunda vez sob a água impede a formação de bolhas de ar e conectar vasos do xilema. <ol><li> Em primeiro lugar, submergir parcialmente folhas excisadas com corte pecíolo em tampão de pré-incubação (200 ul) de 0,1 M de Tris-HCl (pH 6) durante 1 h. </li><li> Em segundo lugar, cada folha se mover para um novo frasco contendo 1,5 ml de um tampão de incubação (200 ul) de 0,1 M de Tris-HCl (pH 6), além de 150 fiM [URL-14 C] herbicida, e incuba-se a 28 ° C durante 1 h para permitir a absorção do herbicida nas folhas. Nota: A C-14 e mesotriona <sup&gt; 14 C-primisulfurão-metil foram utilizados em nossos estudos em actividades específicas de cerca de 20 mCi mmol -1. Ambos difusão e absorção através da corrente xilema transpiração contribuem para a quantidade de herbicida retomado por folha. Nota: O efeito de inibidores metabólicos sobre o metabolismo do herbicida pode ser determinada, modificando passos 2.2.1 e 2.2.2. Adicionar 100 uM do inibidor para o tampão de pré-incubação e deixar incubar durante 2 horas, em seguida, transferir para tampão de incubação com o herbicida e adicionar novamente 100 uM de inibidor. Por exemplo, malathion e tetcyclacis inibir certas actividades do citocromo P450 em plantas 15-17. </li><li> Lave a parte imersa das folhas excisadas com água deionizada e transferir folhas excisadas para um quarto de força Murashige e Skoog (MS) solução sais (500 mL) para 0 h, 5 h, 11 h, 23 h, ou 35 horas, respectivamente, na câmara de crescimento durante o estudo do metabolismo curso de tempo. </li></ol></li><li> Colheita removendo licenças a partir da solução de incubação no ponto de tempo apropriado e moer manualmente cada folha do tecido em azoto líquido usando um tubo de polipropileno (15 ml) e pilão de vidro. </li><li> Extrair herbicida marcado radioactivamente e os seus metabolitos de cada folha com 7 ml de acetona a 90% com um homogeneizador de tecidos laboratorial no mesmo tubo de polipropileno como acima. Lavar homogeneizador de tecidos com um adicional de 7 ml de 90% de acetona, e continuar a homogeneizar até que o tecido está completamente pulverizado (geralmente cerca de 2 min). Nota: 90% de acetona pode ser utilizado para a extracção da maior parte dos herbicidas a partir de tecidos de plantas. No entanto, se este método é possível extrair mais do que 90% dos compostos radiomarcados absorvidas, em seguida, 90% de metanol ou 90% de acetonitrilo pode ser substituído, tal como o solvente de extracção. </li><li> Etiqueta 90% extractos de acetona (14 mL no total) e armazenar a 4 ° C durante 16 horas para permitir a extracção adicional para ocorrer. Nota: Após esta extração de folhas tratadas, a quantidade de rad extraívelioactivity é tipicamente pelo menos 98% de compostos radiomarcados absorvidos pela folha tratada. Radioactividade não extractável (resíduos ligados) em folhas excisadas em média apenas 0,3% em todos os pontos de tempo no nosso estudo anterior 12, mas esta quantidade pode variar de acordo com o herbicida utilizado e ponto de tempo examinado. </li><li> Centrifugar as amostras a 5000 xg durante 10 min e concentrar-se os sobrenadantes a 40 ° C com um evaporador rotativo até um volume final de 0,5 ml é obtida. Transfira este volume para um tubo de plástico de 2,0 ml. </li><li> Adicionar acetonitrilo: água (1: 1, por volume) para ajustar o volume final da planta extrai a 1,25 ml e re-centrifugar a 10000 xg durante 10 minutos para remover quaisquer partículas. </li><li> Medir radioactividade total em uma alíquota de cada amostra (dpm ul -1) por espectroscopia de cintilação líquida (LSS) 12 e normalizar valores de [marcado com 14 C] compostos injectados para análise por HPLC (por exemplo, 10,000 total de dpm / amostra / run) para y-eixos será uniforme entre as amostras ao representar graficamente os resultados. </li></ol> 3. HPLC Análise do herbicida nas folhas excisadas Metabolismo Nota: Resolva radioatividade extraível total de herbicidas em pai e herbicidas metabólitos utilizando as seguintes condições RP-HPLC 12. <ol><li> Realizar RP-HPLC com uma coluna C 18 (4,6 x 250 mm, 5 um de tamanho de partícula, por HPLC analítica) com um caudal de 1 ml min -1 para a maioria dos herbicidas não-polares. Nota: as colunas C 4 ou C 12 de RP-HPLC pode também ser utilizado para optimizar a separação do herbicida parente de seus metabolitos. Um filtro pré-coluna e / ou pré-coluna também pode ser usado para proteger e aumentar a vida útil da coluna RP. <ol><li> Utilize a seguinte fase móvel para RP-HPLC: Eluente A, 0,1% de ácido fórmico (v / v) em água, e Eluente B 100% de acetonitrilo de grau HPLC. Nota: metanol de grau HPLC, também pode ser utilizado como Elafluente B para a resolução de compostos mais polares e metabolitos, mas esteja ciente de que os tempos de retenção também pode mudar. Nota: O perfil de eluição usado para resolver a mesotriona ou primi sul furão-metilo a partir dos seus metabolitos polares em nossa pesquisa 12 é a seguinte: Etapa 1, A: B (4: 1, v / v) a A: B (3: 2, v / v ) num gradiente linear (12 min); Passo 2, A: B (3: 2, v / v) a A: B (3: 7, v / v) num gradiente linear (5 min); Passo 3, A: B (3: 7, v / v) a A: B (1: 9, v / v) em um gradiente linear durante 2 minutos (num total de 19 min). Nota: Gradientes isocráticas e passos podem ter de ser ajustadas com base nas propriedades físicas do material de origem, de modo a optimizar a resolução. </li><li> Seguir os passos de gradiente linear acima, com A: B (1: 9, v / v) A: B (4: 1, v / v) num gradiente linear (3 min) e A: B (4: 1, v / v) passo isocrático (durante pelo menos 2 min) para re-equilibrar a coluna RP antes de injectar o seguinte extracto 12. </li></ol></li><li> Detectar e visualizar compostos radiomarcados com um fluxo Scintillation Analyzer. Registar a quantidade de herbicida-mãe restante em cada amostra como uma percentagem da radioactividade total em cada amostra (detectados e quantificados pelo fluxo de cintilação Analisador de acordo com as instruções do fabricante) para determinar as taxas de metabolismo herbicida em cada população waterhemp durante o curso do tempo. </li></ol> 4. Procedimentos Estatísticos <ol><li> Organizar tratamentos em um delineamento inteiramente ao acaso (ou outro arranjo adequado para análise estatística). </li><li> Realizar duas experiências independentes com cada tratamento, composta de três réplicas biológicas para cada experimento. Os dois experimentos independentes incluem seis repetições biológicas no total. Se o efeito de experiência não é significativa (α = 0,05), combinar e analisar os dados de cada experiência independente. Se o efeito experimento é significativo, em seguida, analisar cada experiência em separado. Nota: Inclua os primeiros três repetições biológicas in Experimento 1 e os próximos três repetições biológicas no Experimento 2. Cada repetição biológica representa um &quot;pai&quot; distinta linha clonal derivada de cada população (MCR 1-6, 1-6 ACR, e WCS 1-6), de modo que cada tempo- Curso de Análise utiliza plantas geneticamente idênticas. Os dois experimentos independentes incluem seis repetições biológicas no total, o que permite uma representação adequada da variabilidade genética ea determinação de um mediano DT 50 para cada população waterhemp. </li><li> Analisar os dados com análise não linear de regressão dos mínimos quadrados e encaixá-los com uma curva simples de primeira ordem, a fim de estimar a DT 50 s. A equação abaixo descreve o modelo: <img alt="Equação 1" src="/files/ftp_upload/53236/53236eq1.jpg" /></li><li> onde, neste modelo de Y representa a percentagem de herbicida-mãe remanescente no tempo t, μ i é a DT para cada 50waterhemp população i, eo parâmetro C 0 é o valor estimado do pai herbicida presente em t = 0 12. </li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

O método extirpado-leaf aqui descrito foi usado anteriormente em pesquisar metabolismo primisulfurão no milho deixa 15, mas os nossos resultados demonstram que este protocolo é igualmente eficaz, preciso e reprodutível para medir o metabolismo do herbicida em um dicot 12 espécies de plantas daninhas. Uma grande vantagem da técnica de folha excisada em comparação com os estudos da planta inteira de uma folha que é excisada é independente de padrões de translocação da planta inteira de p...

Resistência a herbicidas em ervas daninhas apresenta uma séria ameaça para a produção mundial de alimentos e fibras 1,2. Atualmente, milhares de populações resistentes e biótipos de mais de cem espécies de plantas daninhas em todo o mundo têm sido documentadas e estudadas 3. Um importante mecanismo que confere resistência a herbicida em plantas, é a alteração de herbicidas genes e proteínas do local-alvo, incluindo as mutações genéticas que afectam a cinética de ligação proteína-herbicida ou amplificação do gene-alvo local 2. Desintoxicação metabólica via actividades elevados de mono-oxigenase citocromo P450 (P450) ou glutationa S -transferase (GST) enzimas é outro mecanismo que confere resistência a herbicidas em ervas daninhas, que é distinto de várias formas de mecanismos baseados em local de destino 2. Resistência à base metabólica tem ramificações significativas para se os custos de fitness planta (aka sanções aptidão) pode resultar dos mechanis de resistência ao herbicidam, bem como em relação ao potencial para um único mecanismo de desintoxicação para conferir resistência cruzada ou de vários herbicidas em populações de plantas daninhas 1,2,4. Geralmente, o metabolismo do herbicida em plantas pode ser dividida em três fases distintas 5. Fase I envolve a conversão herbicida ou de activação tal como hidroxilação P450-mediada de anéis aromáticos ou grupos alquilo, ou por N - ou reacções de desalquilação O-, levando ao aumento da polaridade e herbicida parcial desintoxicação 5,6. Recentemente introduzido grupos funcionais na Fase I podem proporcionar sítios de ligação para conjugação de glutationa reduzida por GSTs ou para glicose pelo glicosiltransferases UDP-dependentes na Fase II 5,7. Por exemplo, o principal metabolito inicial de primi sul furão-metilo no milho é hidroxi-primi sul furão-metilo 8, que pode ser posteriormente metabolizado para hidroxi-primisulfurão-glucósido (Fase II) e, em seguida, transportados para o vacúolo para armazenamento a longo prazo ou mais metabólica prócessamento 5,6 (Fase III). Waterhemp (Amaranthus tuberculatus) é uma de difícil controle, dicot espécies de plantas daninhas anuais que dificulta a produção de milho (Zea mays), soja (Glycine max) e algodão (Gossypium hirsutum) nos Estados Unidos. O alto grau de diversidade genética de waterhemp é facilitada pela sua biologia dióico e de longa distância vento polinização, e uma única planta waterhemp fêmea pode produzir até um milhão de sementes 9. Estas sementes são pequenas e facilmente se espalhar, o que naturalmente dotar waterhemp com um mecanismo de dispersão eficaz. Waterhemp exibe germinação contínua durante todo o período de crescimento 9, e suas sementes são capazes de germinar após vários anos de dormência. Waterhemp é uma planta C 4 que possui uma taxa de crescimento mais elevada do que a maioria das ervas daninhas de folha larga em sistemas de culturas arvenses 10. Além disso, numerosas populações waterhemp são resistentes a múltiplos famílias de herbicidas 3. Uma população de waterhemp (designado MCR) de Illinois é resistente à 4-hidroxi-fenilpiruvato dioxigenase (HPPD) herbicidas -inhibiting 11, tais como a mesotriona, bem como a atrazina e acetolactato sintase (ALS) -inhibiting herbicidas, incluindo primi sul furão-metilo , devido à não-alvo do local mecanismos baseados 12,13. Uma população diferente de waterhemp designado ACR 14, que é-primi sul furão-metilo resistentes (devido a uma mutação no gene de ALS) e atrazina-resistentes, mas sensível a mesotriona, e uma população waterhemp designado WCS 14 que é sensível à primi sul furão-metilo, mesotriona, atrazina e foram usadas em comparação com MCR na nossa pesquisa anterior 12 e experiências actuais (resumidas na Tabela 1). Estudos iniciais não detectaram alterações nos níveis de sequências genéticas HPPD ou expressão, ou reduzida absorção mesotriona, no MCRpopulação quando comparados com populações sensíveis à mesotriona 12. No entanto, estudos de metabolismo com plantas inteiras mostraram níveis significativamente mais baixos de pai mesotriona herbicida em comparação com o ACR MCR e WCS, o que se correlacionou com respostas fenotípicas anteriores para mesotrione 11,12. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Waterhemp População </td><td> Abreviatura </td><td> Fenótipo para Mesotriona </td><td> Mecanismo de resistência mesotriona </td><td> Fenótipo para primisulfurão </td><td> Mecanismo de resistência primisulfurão </td></tr><tr><td> O Condado de McLean-Resistant </td><td> MCR </td><td> Resistente </td><td> Metabolismo * </td><td> Resistente </td><td> Metabolismo </td></tr><tr><td> Adams County-Resistant </td><td> ACR </td><td> Sensitive </td><td> - </td><td> Resistente </td><td> Mutação alvo local em ALS 14 </td></tr><tr><td> Wayne County-Sensitive </td><td> WCS </td><td> Sensível </td><td> - </td><td> Sensível </td><td> - </td></tr></tbody></table> * Mecanismos de resistência não-alvo do local, com excepção metabolismo reforçada, também podem conferir resistência mesotriona na população MCR 12. Tabela 1: Descrição das populações waterhemp de Illinois utilizados neste estudo. Além de determinar as taxas de metabolismo herbicida em plântulas waterhemp intactas, uma abordagem experimental diferente foi desenvolvido e utilizado na nossa investigação anterior para investigar o metabolismo usando um ensaio excisado waterhemp folha 12, bem como vários inibidores de P450 (por exemplo, tetcyclacis e malatião). Este método foi adaptado especificamente para waterhemp de um PREVIinvestigação ous do metabolismo primisulfurão-metil em milho extirpado deixa 15, uma vez que o ensaio de folha excisada ainda não haviam sido notificados para a realização de pesquisas metabolismo herbicida numa planta dicotiledônea. O inseticida malathion organophophosate tem sido frequentemente utilizado para in vivo e em pesquisa herbicida metabolismo vitro para indicar envolvimento P450 16. Por exemplo, a tolerância eo metabolismo rápido de mesotriona no milho são devido a hidroxilação do anel P450 catalisada, o que foi verificado quando malathion aumento da sensibilidade do milho para mesotriona 17. Da mesma forma, malatião inibiu o metabolismo do inibidor de primi sul furão-metilo ALS de milho em folhas excisadas 15. Uma grande vantagem da técnica de folha excisada é que os dados gerados são independentes de padrões de translocação da planta inteira de, um factor importante a considerar quando se avalia o metabolismo de sistémicas, herbicidas pós-emergentes em plantas. Por conseguinte, este método permite que quantitativa emetabólica análises qualitativas para se concentrar em uma única folha tratada 12. Uma estratégia de clonagem vegetativo, em combinação com o protocolo de folha excisada, foi previamente utilizado em waterhemp para conduzir estudos de metabolismo 12. Devido à natureza de cruzamento de waterhemp (plantas masculinas e femininas separadas), e elevado grau de diversidade genética dentro das espécies Amaranthus dióicas 9, este protocolo assegurado que waterhemp mudas geneticamente idênticas foram analisadas dentro dos experimentos longo do tempo. Este artigo demonstra a utilidade do método para a medição de folha excisada taxas de metabolismo herbicida em plantas daninhas dicotiledóneas um (waterhemp). A quantidade de herbicida-mãe remanescente foi determinada em cada ponto de tempo (Figura 1) por análise não linear de regressão dos mínimos quadrados, e foi adequado com uma curva de primeira ordem simples, a fim de estimar o tempo para 50% de herbicida absorvida para degradar ( DT 50). Representantecromatogramas da cromatograf ia líquida de alta eficiência de fase inversa (RP-HPLC) são exibidos para ALS-resistentes e sensíveis ao waterhemp populações, que indicam o desaparecimento de herbicida-mãe e formação concomitante de metabolito polar (s) durante um estudo de tempo-curso (figura 2). O foco do nosso artigo é descrever e demonstrar a utilidade do ensaio da folha excisada em combinação com um método de clonagem vegetativa para determinar as taxas precisas e reprodutíveis do metabolismo de herbicidas em plantas dicotiledôneas, utilizando anel marcado (URL-14 C) herbicidas de maneira uniforme em três populações waterhemp que diferem nas suas respostas a planta inteira de HPPD- e inibidores da ALS herbicidas (Tabela 1).

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A1296</td>
			<td>for pre-germinating seeds</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potting medium</td>
			<td>Sun Gro Horticulture</td>
			<td>49040233</td>
			<td>for plant growth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nutricote</td>
			<td>Agrivert&#160;</td>
			<td>TOTAL BLEND 13-13-13 T100</td>
			<td>slow-release fertilizer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Growth chamber E15</td>
			<td>Controlled Environments Limited</td>
			<td>20207</td>
			<td>plant culturing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris base</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP152-500</td>
			<td>buffer for excised leaves</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl (concentrated)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A144500</td>
			<td>adjust pH of buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Murashige and Skoog (MS) salts&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M0404</td>
			<td>incubation of excised leaves</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A452-4</td>
			<td>leaf washes after incubation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>179124</td>
			<td>plant extractions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile (HPLC grade)</td>
			<td>Macron Fine Chemicals</td>
			<td>MKH07610</td>
			<td>HPLC mobile phase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic acid&#160;</td>
			<td>Mallinckrodt Analytical</td>
			<td>MK259205</td>
			<td>acidify mobile phase pH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5417R</td>
			<td>1.5 or 2.0 mL tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge (temperature controlled)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5810R</td>
			<td>15 or 50 mL tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polypropylene centrifuge tube</td>
			<td>Corning Inc.</td>
			<td>430790</td>
			<td>15 mL, sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotary evaporator</td>
			<td>B&#220;CHI</td>
			<td>R200</td>
			<td>concentrate plant samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid scintillation spectrometry (LSS)</td>
			<td>Packard Instruments</td>
			<td>104470</td>
			<td>quantify 14C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-performance liquid chromatography</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>N2910401</td>
			<td>resolve herbicide metabolites</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow scintillation analyzer&#160;</td>
			<td>LabLogic System</td>
			<td>1103303</td>
			<td>for HPLC analysis of 14C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hypersil Gold C18 column&#160;</td>
			<td>Thermo-Scientific</td>
			<td>03-050-522&#160;</td>
			<td>reversed phase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultima-Flo M cocktail</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>6013579</td>
			<td>for Flow-scintillation analyzer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scintillation Cocktail (ScintiVerse BD)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SX18</td>
			<td>for LSS; biodegradable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laboratory homogenizer</td>
			<td>Kinematica</td>
			<td>CH-6010&#160;</td>
			<td>homogenize leaf samples</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measuring rates of herbicide metabolism in dicot weeds with an excised leaf assay

In order to isolate and accurately determine rates of herbicide metabolism in an obligate-outcrossing dicot weed, waterhemp (Amaranthus tuberculatus), we developed an excised leaf assay combined with a vegetative cloning strategy to normalize herbicide uptake and remove translocation as contributing factors in herbicide-resistant (R) and &#8211;sensitive (S) waterhemp populations. Biokinetic analyses of organic pesticides in plants typically include the determination of uptake, translocation (delivery to the target site), metabolic fate, and interactions with the target site. Herbicide metabolism is an important parameter to measure in herbicide-resistant weeds and herbicide-tolerant crops, and is typically accomplished with whole-plant tests using radiolabeled herbicides. However, one difficulty with interpreting biokinetic parameters derived from whole-plant methods is that translocation is often affected by rates of herbicide metabolism, since polar metabolites are usually not mobile within the plant following herbicide detoxification reactions. Advantages of the protocol described in this manuscript include reproducible, accurate, and rapid determination of herbicide degradation rates in R and S populations, a substantial decrease in the amount of radiolabeled herbicide consumed, a large reduction in radiolabeled plant materials requiring further handling and disposal, and the ability to perform radiolabeled herbicide experiments in the lab or growth chamber instead of a greenhouse. As herbicide resistance continues to develop and spread in dicot weed populations worldwide, the excised leaf assay method developed and described herein will provide an invaluable technique for investigating non-target site-based resistance due to enhanced rates of herbicide metabolism and detoxification.

Foram detectadas grandes diferenças nas taxas de metabolismo mesotriona entre qualquer WCS ou ACR e MCR (Figura 1). Em cada ponto de tempo, MCR tinha metabolizado mesotriona mais rapidamente do que as duas populações sensíveis à mesotriona, WCS e ACR, que se correlaciona com a planta inteira de respostas fenotípicas anteriores 11. Ao clonar plantas suficientes a partir de uma única planta parental de cada população, análises de curso-tempo do metabolismo dos herbicidas estão unifor...

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Measuring Rates of Herbicide Metabolism in Dicot Weeds with an Excised Leaf Assay

This manuscript describes how herbicide metabolism rates can be effectively quantified with excised leaves from a dicot weed, thereby reducing variability and removing any possible confounding effects of herbicide uptake or translocation typically observed in whole-plant assays.

Medindo Taxas de Herbicida Metabolismo em Dicot Weeds com um ensaio extirpado Folha

In order to isolate and accurately determine rates of herbicide metabolism in an obligate-outcrossing dicot weed, waterhemp (Amaranthus tuberculatus), we ...

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Research

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Environment

11.9K visualizações.  University of Illinois. This manuscript describes how herbicide metabolism rates can be effectively quantified with excised leaves from a dicot weed, thereby reducing variability and removing any possible confounding effects of herbicide uptake or translocation typically observed in whole-plant assays.

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Measuring Fluxes of Mineral Nutrients and Toxicants in Plants with Radioactive Tracers

Unidirectional influx and efflux of nutrients and toxicants, and their resultant net fluxes, are central to the nutrition and toxicology of plants. Radioisotope tracing is a major technique used to measure such fluxes, both within plants, and between plants and their environments. Flux data obtained with radiotracer protocols can help elucidate the capacity, mechanism, regulation, and energetics of transport systems for specific mineral nutrients or toxicants, and can provide insight into compartmentation and turnover rates of subcellular mineral and metabolite pools. Here, we describe two major radioisotope protocols used in plant biology: direct influx (DI) and compartmental analysis by tracer efflux (CATE). We focus on flux measurement of potassium (K+) as a nutrient, and ammonia/ammonium (NH3/NH4+) as a toxicant, in intact seedlings of the model species barley (Hordeum vulgare L.). These protocols can be readily adapted to other experimental systems (e.g., different species, excised plant material, and other nutrients/toxicants). Advantages and limitations of these protocols are discussed.

In planta measurement of nutrient and toxicant fluxes is essential to the study of plant nutrition and toxicity. Here, we cover radiotracer protocols for influx and efflux determination in intact plant roots, using potassium (K+) and ammonia/ammonium (NH3/NH4+) fluxes as examples. Advantages and limitations of such techniques are discussed.

Medindo Fluxos de nutrientes minerais e substâncias tóxicas em plantas com Traçadores Radioativos

Unidirectional influx and efflux of nutrients and toxicants, and their resultant net fluxes, are central to the nutrition and toxicology of plants. ...

Ambiente

Protocols for Robust Herbicide Resistance Testing in Different Weed Species

Robust protocols to test putative herbicide resistant weed populations at whole plant level are essential to confirm the resistance status. The presented protocols, based on whole-plant bioassays performed in a greenhouse, can be readily adapted to a wide range of weed species and herbicides through appropriate variants. Seed samples from plants that survived a field herbicide treatment are collected and stored dry at low temperature until used. Germination methods differ according to weed species and seed dormancy type. Seedlings at similar growth stage are transplanted and maintained in the greenhouse under appropriate conditions until plants have reached the right growth stage for herbicide treatment. Accuracy is required to prepare the herbicide solution to avoid unverifiable mistakes. Other critical steps such as the application volume and spray speed are also evaluated. The advantages of this protocol, compared to others based on whole plant bioassays using one herbicide dose, are related to the higher reliability and the possibility of inferring the resistance level. Quicker and less expensive in vivo or in vitro diagnostic screening tests have been proposed (Petri dish bioassays, spectrophotometric tests), but they provide only qualitative information and their widespread use is hindered by the laborious set-up that some species may require. For routine resistance testing, the proposed whole plant bioassay can be applied at only one herbicide dose, so reducing the costs.

A robust and flexible approach to confirm herbicide resistance in weed populations is presented. This protocol allows the herbicide resistance levels to be inferred and applied to a wide range of weed species and herbicides with minor adaptations.

Protocolos para Robust Teste de resistência a herbicidas em diferentes espécies de plantas daninhas

Robust protocols to test putative herbicide resistant weed populations at whole plant level are essential to confirm the resistance status. The presented ...

LC-MS Analysis of Human Platelets as a Platform for Studying Mitochondrial Metabolism

Perturbed mitochondrial metabolism has received renewed interest as playing a causative role in a range of diseases. Probing alterations to metabolic pathways requires a model in which external factors can be well controlled, allowing for reproducible and meaningful results. Many studies employ transformed cellular models for these purposes; however, metabolic reprogramming that occurs in many cancer cell lines may introduce confounding variables. For this reason primary cells are desirable, though attaining adequate biomass for metabolic studies can be challenging. Here we show that human platelets can be utilized as a platform to carry out metabolic studies in combination with liquid chromatography-tandem mass spectrometry analysis. This approach is amenable to relative quantification and isotopic labeling to probe the activity of specific metabolic pathways. Availability of platelets from individual donors or from blood banks makes this model system applicable to clinical studies and feasible to scale up. Here we utilize isolated platelets to confirm previously identified compensatory metabolic shifts in response to the complex I inhibitor rotenone. More specifically, a decrease in glycolysis is accompanied by an increase in fatty acid oxidation to maintain acetyl-CoA levels. Our results show that platelets can be used as an easily accessible and medically relevant model to probe the effects of xenobiotics on cellular metabolism.

Here we show isolated human platelets can be used as an accessible ex vivo model to study metabolic adaptations in response to the complex I inhibitor rotenone. This approach employs isotopic tracing and relative quantification by liquid chromatography-mass spectrometry and can be applied to a variety of study designs.

LC-MS Análise de plaquetas humanas como uma plataforma para estudar mitocondrial Metabolism

Perturbed mitochondrial metabolism has received renewed interest as playing a causative role in a range of diseases. Probing alterations to metabolic ...

Laboratory and Field Protocol for Estimating Sheet Erosion Rates from Dendrogeomorphology

Sheet erosion is among the crucial drivers of soil degradation. Erosion is controlled by environmental factors and human activities, which often lead to severe environmental impacts. The understanding of sheet erosion is, consequently, a worldwide issue with implications for both environment and economies. However, the knowledge on how erosion evolves in space and time is still limited, as well as its effects on the environment. Below, we explain a new dendrogeomorphological protocol for deriving eroded soil thickness (Ex) by acquiring accurate microtopographic data using both terrestrial laser scanning (TLS) and microtopographic profile gauges. Additionally, standard dendrogeomorphic procedures, dependent on anatomical variations in root rings, are utilized to establish the timing of exposure. Both TLS and microtopographic profile gauges are used to obtain ground surface pro&#64257;les, from which Ex is estimated after the threshold distance (TD) is determined, i.e., the distance between the root and the sediment knickpoint, which allows de&#64257;ning the lowering of the ground surface caused by sheet erosion. For each profile, we measured the height between the topside of the root and a virtual plane tangential to the ground surface. In this way, we intended to avoid small-scale impacts of soil deformation, which may be due to pressures exerted by the root system, or by the arrangement of exposed roots. This may provoke small amounts of soil sedimentation or erosion depending on how they physically affect the surface runoff. We demonstrate that an adequate microtopographic characterization of exposed roots and their associated ground surface is very valuable to obtain accurate erosion rates. This finding could be utilized to develop the best management practices designed to eventually halt or perhaps, at least, lessen soil erosion, so that more sustainable management policies can be put into practice.

Characterizing erosion from dendrogeomorphology has usually focused on accurately finding the starting time of root exposure, by examining macroscopic or cell level changes caused by exposure. Here, we offer a detailed description of different novel techniques to obtain more precise erosion rates from highly accurate microtopographic data.

Laboratório e campo protocolo para estimar as taxas de erosão folha de Dendrogeomorphology

Sheet erosion is among the crucial drivers of soil degradation. Erosion is controlled by environmental factors and human activities, which often lead to ...

An Anaerobic Biosensor Assay for the Detection of Mercury and Cadmium

Mercury (Hg) bioavailability to microbes is a key step to toxic Hg biomagnification in food webs. Cadmium (Cd) transformations and bioavailability to bacteria control the amount that will accumulate in staple food crops. The bioavailability of these metals is dependent on their speciation in solution, but more particularly under anoxic conditions where Hg is methylated to toxic monomethylmercury (MeHg) and Cd persists in the rhizosphere. Whole-cell microbial biosensors give a quantifiable signal when a metal enters the cytosol and therefore are useful tools to assess metal bioavailability. Unfortunately, most biosensing efforts have so far been constrained to oxic environments due to the limited ability of existing reporter proteins to function in the absence of oxygen. In this study, we present our effort to develop and optimize a whole-cell biosensor assay capable of functioning anaerobically that can detect metals under anoxic condition in quasi-real time and within hours. We describe how the biosensor can help assess how chemical variables relevant to the environmental cycling of metals affect their bioavailability. The following protocol includes methods to (1) prepare Hg and Cd standards under anoxic conditions, (2) prepare the biosensor in the absence of oxygen, (3) design and execute an experiment to determine how a series of variable affects Hg or Cd bioavailability, and (4) to quantify and interpret biosensor data. We show the linear ranges of the biosensors and provide examples showing the method's ability to distinguish between metal bioavailability and toxicity by utilizing both metal-inducible and constitutive strains.

Here, we present a protocol to use an anaerobic whole-cell microbial biosensor to evaluate how different environmental variables affect the bioavailability of Hg and Cd to bacteria in anoxic environments.

Um ensaio de anaeróbios Biosensor para a detecção de mercúrio e cádmio

Mercury (Hg) bioavailability to microbes is a key step to toxic Hg biomagnification in food webs. Cadmium (Cd) transformations and bioavailability to ...

Estimating Sediment Denitrification Rates Using Cores and N2O Microsensors

Denitrification is the primary biogeochemical process removing reactive nitrogen from the biosphere. The quantitative evaluation of this process has become particularly relevant for assessing the anthropogenic-altered global nitrogen cycle and the emission of greenhouse gases (i.e., N2O). Several methods are available for measuring denitrification, but none of them are completely satisfactory. Problems with existing methods include their insufficient sensitivity, and the need to modify the substrate levels or alter the physical configuration of the process using disturbed samples.This work describes a method for estimating sediment denitrification rates that combines coring, acetylene inhibition, and microsensor measurements of the accumulated N2O. The main advantages of this method are a low disturbance of the sediment structure and the collection of a continuous record of N2O accumulation; these enable estimates of reliable denitrification rates with minimum values up to 0.4-1 &#181;mol N2O m-2 h-1. The ability to manipulate key factors is an additional advantage for obtaining experimental insights. The protocol describes procedures for collecting the cores, calibrating the sensors, performing the acetylene inhibition, measuring the N2O accumulation, and calculating the denitrification rate. The method is appropriate for estimating denitrification rates in any aquatic system with retrievable sediment cores. If the N2O concentration is above the detection limit of the sensor, the acetylene inhibition step can be omitted to estimate the N2O emission instead of denitrification. We show how to estimate both actual and potential denitrification rates by increasing nitrate availability as well as the temperature dependence of the process. We illustrate the procedure using mountain lake sediments and discuss the advantages and weaknesses of the technique compared to other methods. This method can be modified for particular purposes; for instance, it can be combined with 15N tracers to assess nitrification and denitrification or field in situ measurements of denitrification rates.

Estimating Sediment Denitrification Rates Using Cores and N2O Microsensors

This method estimates sediment denitrification rates in sediment cores using the acetylene inhibition technique and microsensor measurements of the accumulated N2O. The protocol describes procedures for collecting the cores, calibrating the sensors, performing the acetylene inhibition, measuring the N2O accumulation, and calculating the denitrification rate.

Estimando taxas de desnitrificação do sedimento usando núcleos e N2O Microssensores

Denitrification is the primary biogeochemical process removing reactive nitrogen from the biosphere. The quantitative evaluation of this process has ...

Measuring the Shape and Size of Activated Sludge Particles Immobilized in Agar with an Open Source Software Pipeline

Experimental bioreactors, such as those treating wastewater, contain particles whose size and shape are important parameters. For example, the size and shape of activated sludge flocs can indicate the conditions at the microscale, and also directly affect how well the sludge settles in a clarifier.
Particle size and shape are both misleadingly &#39;simple&#39; measurements. Many subtle issues, often unaddressed in informal protocols, can arise when sampling, imaging, and analyzing particles. Sampling methods may be biased or not provide enough statistical power. The samples themselves may be poorly preserved or undergo alteration during immobilization. Images may not be of sufficient quality; overlapping particles, depth of field, magnification level, and various noise can all produce poor results. Poorly specified analysis can introduce bias, such as that produced by manual image thresholding and segmentation.
Affordability and throughput are desirable alongside reproducibility. An affordable, high throughput method can enable more frequent particle measurement, producing many images containing thousands of particles. A method that uses inexpensive reagents, a common dissecting microscope, and freely-available open source analysis software allows repeatable, accessible, reproducible, and partially-automated experimental results. Further, the product of such a method can be well-formatted, well-defined, and easily understood by data analysis software, easing both within-lab analyses and data sharing between labs.
We present a protocol that details the steps needed to produce such a product, including: sampling, sample preparation and immobilization in agar, digital image acquisition, digital image analysis, and examples of experiment-specific figure generation from the analysis results. We have also included an open-source data analysis pipeline to support this protocol.

The size and shape of particles in activated sludge are important parameters that are measured using varying methods. Inaccuracies arise from non-representative sampling, suboptimal images, and subjective analysis parameters. To minimize these errors and ease measurement, we present a protocol specifying every step, including an open source software pipeline.

Medindo a forma e o tamanho das partículas de lodo ativado imobilizada em ágar com um Pipeline de Software de código aberto

Experimental bioreactors, such as those treating wastewater, contain particles whose size and shape are important parameters. For example, the size and ...

Cultivation of Green Microalgae in Bubble Column Photobioreactors and an Assay for Neutral Lipids

There is significant interest in the study of microalgae for engineering applications such as the production of biofuels, high value products, and for the treatment of wastes. As most new research efforts begin at laboratory scale, there is a need for cost-effective methods for culturing microalgae in a reproducible manner. Here, we communicate an effective approach to culture microalgae in laboratory-scale photobioreactors, and to measure the growth and neutral lipid content of that algae. Instructions are also included on how to set up the photobioreactor system. Although the example organisms are species of Chlorella and Auxenochlorella, this system can be adapted to cultivate a wide range of microalgae, including co-cultures of algae with non-algae species. Stock cultures are first grown in bottles to produce inoculum for the photobioreactor system. Algae inoculum is concentrated and transferred to photobioreactors for cultivation in batch mode. Samples are collected daily for the optical density readings. At the end of the batch culture, cells are harvested by centrifuge, washed, and freeze dried to obtain a final dry weight concentration. The final dry weight concentration is used to create a correlation between the optical density and the dry weight concentration. A modified Folch method is subsequently used to extract total lipids from the freeze-dried biomass and the extract is assayed for its neutral lipid content using a microplate assay. This assay has been published previously but protocol steps were included here to highlight critical steps in the procedure where errors frequently occur. The bioreactor system described here fills a niche between simple flask cultivation and fully-controlled commercial bioreactors. Even with only 3-4 biological replicates per treatment, our approach to culturing algae leads to tight standard deviations in the growth and lipid assays.

Here, we present a protocol to construct lab-scale bubble column photobioreactors and use them to culture microalgae. It also provides a method for the determination of the culture growth rate and neutral lipid content.

Cultivo de microalgas verdes em fotobiorreatores coluna de bolha e um ensaio para lípidos neutros

There is significant interest in the study of microalgae for engineering applications such as the production of biofuels, high value products, and for the ...

Leaf Area Index Estimation Using Three Distinct Methods in Pure Deciduous Stands

Accurate estimations of leaf area index (LAI), defined as half of the total leaf surface area per unit of horizontal ground surface area, are crucial for describing the vegetation structure in the fields of ecology, forestry, and agriculture. Therefore, procedures of three commercially used methods (litter traps, needle technique, and a plant canopy analyzer) for performing LAI estimation were presented step-by-step. Specific methodological approaches were compared, and their current advantages, controversies, challenges, and future perspectives were discussed in this protocol. Litter traps are usually deemed as the reference level. Both the needle technique and the plant canopy analyzer (e.g., LAI-2000) frequently underestimate LAI values in comparison with the reference. The needle technique is easy to use in deciduous stands where the litter completely decomposes each year (e.g., oak and beech stands). However, calibration based on litter traps or direct destructive methods is necessary. The plant canopy analyzer is a commonly used device for performing LAI estimation in ecology, forestry, and agriculture, but is subject to potential error due to foliage clumping and the contribution of woody elements in the field of view (FOV) of the sensor. Eliminating these potential error sources was discussed. The plant canopy analyzer is a very suitable device for performing LAI estimations at the high spatial level, observing a seasonal LAI dynamic, and for long-term monitoring of LAI.

An accurate estimation of leaf area index (LAI) is crucial for many models of material and energy fluxes within plant ecosystems and between an ecosystem and the atmospheric boundary layer. Therefore, three methods (litter traps, needle technique, and PCA) for taking precise LAI measurements were in the presented protocol.

Estimativa do índice de área foliar usando três métodos distintos em stands deciduous puros

Accurate estimations of leaf area index (LAI), defined as half of the total leaf surface area per unit of horizontal ground surface area, are crucial for ...

Investigation of Xenobiotics Metabolism In Salix alba Leaves via Mass Spectrometry Imaging

The method presented uses mass spectrometry imaging (MSI) to establish the metabolic profile of S. alba leaves when exposed to xenobiotics. Using a non-targeted approach, plant metabolites and xenobiotics of interest are identified and localized in plant tissues to uncover&#160;specific distribution patterns. Then, in silico prediction of potential metabolites (i.e., catabolites and conjugates) from the identified xenobiotics is performed. When a xenobiotic metabolite is located in the tissue, the type of enzyme involved in its alteration by the plant is recorded. These results were used to describe different types of biological reactions occurring in S. alba leaves in response to xenobiotic accumulation in the leaves. The metabolites were predicted in two generations, allowing the documentation of successive biological reactions to transform xenobiotics in the leaf tissues.

Investigation of Xenobiotics Metabolism In Salix alba Leaves via Mass Spectrometry Imaging

This method uses mass spectrometry imaging (MSI) to understand metabolic processes in S. alba leaves when exposed to xenobiotics. The method allows the spatial localization of compounds of interest and their predicted metabolites within specific, intact tissues.

Investigação do metabolismo xenobióticos em folhas de Salix alba via Imagem de Espectrometria de Massa

The method presented uses mass spectrometry imaging (MSI) to establish the metabolic profile of S. alba leaves when exposed to xenobiotics. Using a ...