A cultura de calos vegetais fornece uma solução para a avaliação precisa, eficiente e rápida da degradação metabólica de xenobióticos em plantas. A cultura do calo vegetal pode excluir a interferência do microbioma ou fúngica e a degradação fotoquímica, simplificar o efeito da matriz de plantas intactas, padronizar as condições de cultivo, encurtar a duração do tratamento e exigir menor esforço experimental. O método aqui proposto pode fornecer informações sobre o comportamento de absorção e mecanismos metabólicos de diferentes poluentes orgânicos em culturas e são úteis para esforços de avaliação de risco ambiental.
Para começar, autoclave todos os equipamentos e realize todas as operações em uma bancada de trabalho ultra limpa esterilizada por UV. Esterilizar a superfície vernalizada das sementes com etanol 75% por 20 minutos. Enxágue-os com água deionizada estéril três vezes e novamente esterilize-os com peróxido de hidrogênio a 20% por 20 minutos.
Após seis vezes lavar as sementes com água deionizada esterilizada, germinar assepticamente em meio de Murashige e Skoog autoclavado, livre de hormônios, pH 5,8, contendo gel de ágar 1% e incubar a 26 graus Celsius com fotoperíodo de 16 horas por 15 dias. Após 15 dias de incubação das sementes, corte o hipocótilo e o cotilédone da plântula em pequenos pedaços de 0,5 centímetros para obtenção dos explantes. Transformar os explantes em uma placa de Petri contendo 15 a 20 mililitros de meio Murashige e Skoog autoclavado suplementado com Oximon e Ficocianina e incubar no escuro a 26 graus Celsius por três a quatro semanas para induzir o calo.
Com bisturi e pinça estéreis, separar o calo de aproximadamente um centímetro de diâmetro formado dos explantes iniciais. Para o tratamento, dissolver 2,4-dibromofenol em 10 mililitros de líquido asséptico Murashige e meio Skoog. Em seguida, adicione três gramas de calo de cenoura separado à solução preparada de 2,4-dibromofenol.
Após o preparo do meio em controle em branco, conforme descrito no manuscrito, incubar todos os frascos no escuro. Para preparar a amostra, separe cuidadosamente o calo dos frascos de tratamento e controle de 2,3-dibromofenol por filtração com filtros de fibra de vidro de 0,45 mícron. Lave o calo três vezes com água ultrapura antes de coletá-lo.
Liofilizar todo o calo coletado e homogeneizar 0,2 gramas de calo seco com um moedor de tecido de alto rendimento a 70 hertz por três minutos. Use uma microseringa de vidro para adicionar 50 microlitros de 4-n-nanofenol deuterado substituto no calo homogeneizado e vórtice por um minuto. Adicionar cinco mililitros da solução contendo uma proporção igual de metanol e água ao calo cravado e sonicá-lo por 30 minutos para extrair o 2, 4-dibromofenol e metabólitos.
Após a extração, centrifugar a suspensão a 8.000 G a quatro graus Celsius por 10 minutos e coletar o sobrenadante por pipetagem. Passe o extrato através de extração hidrofílica, lipofílica, fase sólida balanceada ou cartucho HLB-SPE com vazão de um mililitro por minuto. Diluir os analitos passando seis mililitros de metanol através do cartucho HLB-SPE.
Em seguida, concentre o eluente obtido a um mililitro sob uma corrente suave de gás nitrogênio para análise instrumental. Para análise, abra a porta do aquecedor de coluna. Em seguida, instale a coluna de cromatografia líquida de ultra desempenho conectando a entrada da coluna à válvula de injeção e a saída à entrada do espectrômetro de massa.
Insira a extremidade dos tubos de solvente A e B nos frascos de solvente correspondentes. Coloque os frascos para injetáveis de amostra por número de série nos locais correspondentes dos tabuleiros de recolha de amostras e volte a introduzir os frascos de amostra na câmara de amostras. Na janela do software, clique em Instrumento, depois em Método de Entrada para editar as condições do cromatograma líquido.
Selecione o Método MS e configure os parâmetros da análise do espectro de massa. Clique em Arquivo e, em seguida, em Novo para criar e nomear o banco de dados. Carregue o programa de exemplo criado acima selecionando Arquivo MS, seguido por Arquivo de entrada e Volume de injeção.
Salve o banco de dados na pasta de exemplo do projeto clicando em Arquivo e Salvar. Em seguida, selecione Executar e Iniciar na janela principal do software e clique em Adquirir Dados de Exemplo, seguido pelo botão OK na lista de exemplos iniciar executar para coletar dados. Para processar os dados, selecione a linha de dados de destino e clique na janela do cromatograma para visualizar o cromatograma de varredura MS.
Na janela do cromatograma, clique em Display, seguido de TIC. Depois de clicar no DS da onda de varredura, adicione o rastreamento e OK para obter a varredura de espectros de massa filha. O cromatograma do extrato de calo de cenoura tratado com 2,4-dibromofenol mostrou a presença de oito metabólitos diferentes em relação às amostras controle.
Adicionalmente, a ausência do pico de 4-dibromofenol do gento 2,4-dibromofenol indica o rápido metabolismo do 2,4-dibromofenol no calo da cenoura em condições experimentais. Além disso, 2,4-dibromofenol incubados em calo de cenoura levaram à formação de metabólitos por conjugação direta com glicose e aminoácidos. Todos os equipamentos, bem como os meios Murashige e Skoog, devem ser autoclavados para garantir que a diferenciação e manutenção do calo da planta sejam realizadas em condições assépticas.
Abordagens ômicas seguindo este procedimento permitem a criação de um quadro mecanicista fitotóxico claro dos poluentes ambientais.
