This work was supported by a Natural Sciences and Engineering Research (NSERC)-USRA grant to S.J., and by an NSERC-Discovery Grant to I.M. We thank Richard Bourgault, Meghan Rains, and Amanda Fluke for technical assistance. Seeds of att1-1 and att1-2 mutants were kindly provided by Dr. Jian-Min Zhou, Institute of Genetics and Developmental Biology, Beijing, China.

Nota: Este protocolo foi adaptado de Bonaventure et al. (2004), Molina et al. (2006), Li et ai. (2013) 7,10,11. Passos 1-5 são sumariados na Figura 1. Deslipidação 1. Tissue Nota: Sempre lavar todos os vidros e tampas com clorofórmio, deixando secar sob exaustor, antes de usar. CUIDADO: Executar homogeneização do tecido e todas as etapas de transferência solvente sob exaustor; sempre usar jaleco, luvas e óculos de segurança inicial para evitar o contato direto com produtos químicos e para proteger as amostras de contaminação. <ol><li> Banho de água Pré-aqueça e bloco de calor a 85 ° C. </li><li> Pesar aproximadamente 0,5 g de cada amostra de folha em 20 mm x 125 mm tubos de ensaio de vidro previamente pesado com politetrafluoretileno (PTFE) tampas de rosca -faced. Incluem quatro repetições por amostra. </li><li> Coloque 2-propanol num balão de Erlenmeyer (cerca de 125 ml; 25 ml por g de SAMPle). Adicionar 2,6-di-terc-butil-4-metilfenol (também conhecido como hidroxitolueno butilado, BHT) para uma concentração final de 0,01% (w / v). Nota: Adicionar BHT a partir de um 5% (w / v) de solução de reserva em metanol (BHT ajuda a minimizar a oxidação de ácidos gordos insaturados). </li><li> Pré-aqueça solução de 2-propanol a 85 ° C em banho de água. </li><li> Adicionar 12 ml de solvente quente de 2-propanol para cada tubo de amostra e calor durante 15 min a 85 ° C em bloco de calor. Este passo inativa lipases que podem ser libertadas a partir de células rompidas. </li><li> Deixe os tubos arrefecer até à temperatura ambiente e triturar o tecido cuidadosamente com homogeneizador até obter uma suspensão homogénea. </li><li> Coloque as amostras num agitador orbital e agitar durante 1-2 horas a 100 rpm e temperatura ambiente. </li><li> Centrifugar durante 10 minutos a 800 xg e descartar o sobrenadante. </li><li> Adicionar um volume igual de 2-propanol e agita-se durante 12 horas à temperatura ambiente. </li><li> Centrifugar durante 10 minutos a 800 xg e descartar o sobrenadante. </li><li> Adicionar 12 ml de CHCl 3: CH3OH (2: 1, v / v) até ao resíduo (25 ml por g de amostra) e agitar durante a noite a 100 rpm e temperatura ambiente. </li><li> Centrifugar durante 10 minutos a 800 xg e descartar o sobrenadante. </li><li> Adicionar 12 ml de CHCl 3: CH 3 OH (1: 2, v / v) até ao resíduo e agitar durante a noite a 100 rpm e temperatura ambiente. </li><li> Centrifugar durante 10 minutos a 800 xg e remover o solvente. </li><li> Deixe secar amostras sob exaustor durante a noite a temperatura ambiente. </li><li> Secar o resíduo e, em seguida, colocar-se num exsicador de vácuo sobre CaCl2 anidro ou CaSO4 até peso constante (3-5 dias). </li></ol> 2. A despolimerização: metanólise com metóxido de sódio (Figura 2) ATENÇÃO: Siga as etapas 2,3-2,4, 2,7-2,8, 2,10-2,11, 2,13-2,15 e 2,17-2,18 sob exaustor; sempre usar jaleco, luvas e óculos de segurança inicial. <ol><li> Pré-aqueça o bloco de calor a 60 ° C. </li><li> Pesar tubos de ensaio contendo o resíduo seco (importante para cálculos posteriores). </li><li> Adicionar padrões internos a cada tubo: 25 ωL heptadecanoato de metilo (1 mg / ml) e 25 ul ω-pentadecalactone (1 mg / ml de stock). </li><li> Adicionar 0,9 ml de acetato de metilo, 1,5 mL de metóxido de sódio, e 3,6 ml de metanol a cada tubo e cap-los. Em alternativa, preparar uma mistura de reacção com estes três reagentes e adicionar alíquotas de 6 ml para cada amostra. </li><li> Amostras de calor durante 2 horas a 60 ° C e periodicamente vórtice em intervalos de 15 min. </li><li> Deixe as amostras arrefecer para a temperatura ambiente. </li><li> Adicionar 10 ml de dicloreto de metileno (CH 2 Cl 2) e 1,5 ml de ácido acético glacial para extrair os ésteres metílicos dos ácidos gordos. </li><li> Adicionar uma solução salina (NaCl 0,5 M) para encher cada tubo e a tampa. </li><li> Amostras Vortex durante 1 min e centrifuga-se durante 10 min a 800 x g. </li><li> Transferir a fase orgânica (inferior) para limpar tubos de tamanho médio (16 x 125 tubos de ensaio de vidro com poli mmtetrafluoroetileno (PTFE) tampa de rosca -faced). </li><li> Adicionar uma solução salina (NaCl 0,5 M) para encher cada tubo e a tampa. </li><li> Amostras Vortex durante 1 min e centrifuga-se durante 10 min a 800 x g. </li><li> Remover fase aquosa (superior) e repita os passos de 2,11-2,12. </li><li> Remova toda a fase aquosa (superior). </li><li> Adicionar sulfato de sio anidro (Na 2 SO 4) para o solvente, tampão, e os tubos de vórtice durante 1 min; amostras pode agora ser deixada até ao dia seguinte. A esta amostras ponto pode ser deixada durante a noite sob a coifa. </li><li> Centrifugar durante 2 minutos a 800 xg para compactar o Na 2 SO 4 sal na parte inferior. </li><li> Transferir a fase orgânica para um tubo de vidro descartável pequena (13 x 100 mm tubos de ensaio de vidro com politetrafluoroetileno (PTFE) com tampa de rosca -faced). </li><li> Evaporar o solvente à secura sob azoto e avançar para a etapa de derivação. Se não processado imediatamente, armazenar evaporada amostras a -20 ° C (amostras pode ser umlso armazenado antes do passo de evaporação). </li></ol> 3. Preparação de Derivados de Cromatografia Gasosa ATENÇÃO: Siga as etapas 3.1.2 e 3.1.5 - 3.1.8 sob um exaustor; sempre usar jaleco, luvas e óculos de segurança inicial. <ol><li> Derivados trimetilsilílicos <ol><li> Pré-aqueça o bloco de aquecimento a 100 ° C. </li><li> Adicionar 100 ul de piridina e 100 ml de BSTFA (N, O-bis-trimetilsilil-trif luoroacetamida) a cada tubo e cap-los. </li><li> Amostras de aquecer a 100 ° C durante 10 min. </li><li> Deixe as amostras arrefecer para a temperatura ambiente. </li><li> Evapora-se as amostras sob azoto à temperatura ambiente. Evitar a aplicação de calor para amostras, os monómeros são altamente voláteis, nesta fase. </li><li> Adicionar 500 ul de 1: 1 (v / v) de heptano: tolueno. </li><li> Amostras Vortex durante 1 min e centrifuga-se durante 2 min a 800 x g. </li><li> Adicionar amostras para frascos de GC e proceder à análise GC / MS. </li></ol></li><li> Acetilderivados Nota: Para acetilação, modificar passos 3.1.1-3.1.3 acima da seguinte forma (não mostrado na vídeo); os passos 3.1.4-3.1.8 são os mesmos: <ol><li> Pré-aqueça o bloco de calor a 60 ° C. </li><li> Adicionar 100 ul de piridina e 100 ul de anidrido acético (Ac2O) para os tubos. </li><li> Amostras de calor 1 hora a 60 ° C. </li></ol></li></ol> 4. GC / MS Análise <ol><li> Usar uma coluna HP-5 capilar (30 mx 0,25 mm de espessura x 0,25 uM filme) ou equivalente (isto é., 5% de difenilo, 95% de dimetil polisiloxano). Programa de GC com o fluxo de gás transportador hélio fixado em 1,5 ml / min e a temperatura do forno programado para 150 a 300 ° C a 3 ° C / min. </li><li> Use injeção de divisão (split proporção de 1:10) e definir espectrômetro de massa modo para digitalizar mais de 40-600 amu (elétron impacto de ionização). </li><li> Criar uma tabela de seqüência incluindo solvente (em branco), WT e mutantes repetições, cada um usando o método de análise cutin indicado. </li><li> Carga de solventee frascos de amostra sobre o carrossel, adicione-hexano para frascos de lavagem de seringas no amostrador automático, se necessário, e iniciar a sequência. Após a sequência estiver completa, dadas vestígios cromatograma iónico estão disponíveis para todas as amostras. </li></ol> Análise 5. Dados <ol><li> Identificar monómeros de poliéster lipídico comparando espectro de massa de cada pico de espectros de massa publicado ou pesquisando uma biblioteca comercial, se disponível. </li><li> Para cada um dos picos identificados no cromatograma total de corrente de iões, utilizar os seus respectivos tempos de retenção para encontrar as áreas na tabela de resultados de integração a partir do software GC / MS (Figura Suplementar 1). </li><li> Para cada monômero (colunas AB), adicione os valores de área encontrados na tabela de integração (Figura Suplementar 1, coluna D) para a coluna correspondente para cada replicar amostra na tabela Excel de monómeros (Supplemental Arquivo 2, colunas CF), que é uma folha de cálculo para quantificar Arabidopsisderivados cutin EAS. Use Suplementar Arquivo 3 se derivados acetilados são preparados em vez disso. </li><li> Adicione as áreas das normas internas (SI) para as colunas é (HK). Para os monómeros que não são derivatizados, ésteres metílicos ou seja, ácidos gordos (FAMEs), e os ésteres de dimetilo do ácido dicarboxilicos (DCA EMDs), utilizar 17: 0 FAME (IS1) como IS para a quantificação (células roxo-protegida na tabela de monómero; Suplementar Arquivos 2/3). Para monómeros hidroxilados, incluindo álcoois primários, ácido ferúlico e ácidos ω-hidroxi, utilizar 15: 0 15-hidroxi FAME (IS2), como é de escolha para a quantificação composto (células verdes-shadded na tabela de monómero; Suplementar Arquivos 2/3) . </li><li> Adicione peso folha seca para cada replicar para colunas AX-BA (Supplemental arquivo 2) ou AQ-AT (Supplemental Arquivo 3); alternativamente, digitalizar folhas de calcular áreas de superfície e adicionar valores de área para a mesa de monômero para expressar cargas de monómeros por unidade deárea de superfície. </li></ol>

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No conflicts of interest declared.

Ao contrário de outros biopolímeros, tais como proteínas e ADN, poliésteres planta de lípidos não são feitas a partir de um molde. Em vez disso, as composições dependem da especificidade das enzimas presentes nos tecidos que formam estes polímeros extracelulares. Como tais análises, química do componente de componentes são essenciais para compreender a composição de poliéster de lípidos. Os métodos químicos para clivar ligações éster incluem saponificação, hidrogenólise, transmetilação catalisada por ácido, e catalisada por base transmetilação 2. Cada um deles tem vantagens e desvantagens. Saponificação produz ácidos gordos hidroxi livres que podem sofrer reações secundárias. A hidrogenólise com hidreto de alumínio e lítio (LiAlH4) 16 foi utilizado para a análise cutina 7. A hidrogenólise reduz carbonos funcionalizados para álcoois e as estruturas originais precisam de ser inferida por deuteriolysis com deutereto de alumínio e lítio (LiAlD 4). odesvantagem desta abordagem é a exigência de alta resolução GC / MS para comparar o grau de deuteriation dos polióis gordos obtidos para fazer atribuições das suas estruturas. Transesterificação catalisada por ácido com metanol trifluoreto de boro (BF3) tem sido freqüentemente utilizada em cutina e suberina depolymerizations 8,17,18, mas o reagente tem uma vida útil limitada e pode introduzir artefactos devido a reacções secundárias 15. Ácido sulfúrico metanólico também produz ésteres metílicos dos monómeros mas com maiores proporções de ácidos gordos de 2-hidroxi, que presumivelmente não são verdadeiros componentes de poliéster lípido, em comparação com outros métodos 10. O método de transesterificação catalisada NaOMe descrito neste protocolo produz ésteres metílicos de ácidos gordos que são derivatizados por sililação de grupos hidroxilo, fornecendo espectros de massa característico para a identificação, ou por acetilação para proporcionar derivados mais estáveis ​​de grupos hidroxilo foR quantificação. Uma desvantagem desta técnica é que a hidrólise compete com a transesterif icação, quando a água está presente na reacção. A água reage com NaOMe (o catalisador) e produz NaOH, que por sua vez hidrolisa ésteres metílicos de ácidos gordos para se obter os ácidos livres (Figura 2D). Esta é uma reacção colateral indesejável porque dois picos irá estar presente para cada ácido gordo: um éster de metilo e um derivado de éster TMSi, complicando assim a análise. Usando reagentes anidros e a adição de acetato de metilo como um co-solvente para competir com saponificação são assim passos cruciais para prevenir a hidrólise (Figura 2D). Cutin e suberina conter entre 1 e 26% de glicerol 4. No entanto, este monómero não será detectado por as condições experimentais descritas neste protocolo. O glicerol é altamente hidrofílico e, ao contrário dos monómeros de éster de metilo de ácidos gordos, será eliminada durante os passos de solvente de lavagem aquosas. Esta limitação também umpplies a outros métodos de despolimerização cutina, glicerol, mas pode ser determinada na camada aquosa obtida após transesterificação utilizando um método enzimático. Alternativamente, ele pode ser quantificada usando condições mais suaves (por exemplo., 0,05 M NaOMe) sem nova extracção da água para detectar todos os monómeros, incluindo glicerol 19,20 .Embora útil para a finalidade de quantificação glicerol, condições suaves geralmente dar incompleto de despolimerização e cutina suberina. Se um GC acoplado a um detector de ionização de chama (FID) está disponível, todas as repetições podem ser analisados ​​no presente instrumento, para fins quantitativos, depois de picos de uma amostra representativa foram identificados por GC / MS. Como alternativa, os monômeros em GC / FID traços podem ser identificados, se os seus índices de retenção são conhecidos. O detector de ionização de chama tem especialmente elevada sensibilidade e uma ampla gama de proporcionalidade, que é crítica para a quantificação de componentes principais e secundárias amostrasem corridas individuais. Além disso, é robusto e fácil de manter e operar 15. O protocolo descrito permite a fiável e reprodutível isolamento, identificação e quantificação dos monómeros de poliéster de lípidos de plantas, permitindo a caracterização de mutantes química que diferem na composição de um ou mais monómeros de poliéster de lípidos. O procedimento é expansível, ele pode ser facilmente adaptada para processar tanto pequenas quantidades a granel e de diversos materiais de planta, incluindo sementes, raízes, folhas, caules e flores. Dados de espectrometria de massa de monómeros de poliéster de lipídios de muitas espécies têm sido publicados por ex., 21-26 e constituem recursos valiosos para identificar monómeros desconhecidos quando adaptar este protocolo para outros tecidos e / ou espécies. Este método é aplicável para a biossíntese de investigações, regulação e de distribuição de poliésteres de lípidos em plantas superiores.

As plantas vasculares confiar em camadas extracelulares, que funcionam como barreiras impermeáveis ​​entre os tecidos de plantas e o ambiente externo. Estas estruturas associadas da parede celular lipofílico restringir a infecção patogénica e regular o transporte passivo de gases, água e substâncias dissolvidas dentro e para fora dos tecidos da planta 1. Tais barreiras são a cutícula da planta, uma estrutura única para plantas sinapomórficas 2, e barreiras de difusão diferentes contendo suberina. A cutícula é uma camada oleofï¿½lico sintetizado por células epidérmicas e ligado a eles por meio de uma camada péctico no lado extracelular da parede celular 3-5. É encerra os órgãos aéreos primárias de plantas superiores, funcionando como uma interface vital entre tecidos da planta e do meio ambiente. Cutina, a matriz estrutural da cutícula, e suberina são dois poliésteres glicerolípido insolúveis associadas com ceras solvente 2,4-extraíveis. Estes l poliméricoIPIDs são compostas de derivados de ácidos gordos saturados e insaturados e de ambos são estruturalmente e funcionalmente semelhante. No entanto, eles são distinguíveis por diferentes características de sites de composição e deposição química. Suberina é um poliéster alifático localizado no interior das paredes das células de certos tecidos internos e externos que formam uma parede secundária. Tecidos suberizadas incluem periderms de raízes, tubérculos e casca de árvore, endoderme raiz, camadas de revestimento de sementes, e feridas curadas 2. Ao contrário cutina, o poliéster suberina tipicamente contém álcoois, ácidos dicarboxílicos saturados e mono-insaturados, e uma grande proporção de monómeros de cadeia muito longa (C≥20). Cutina é o mais abundante poliéster lípido em plantas vasculares 6, e é composto de glicerol e C16-C18 derivados de ácidos gordos interesterificada, tais como ácidos gordos hidroxi e hidroxi-4 epóxi substituído. Embora a composição de polímeros cutinavaria entre espécies tracheophyte, os monómeros primários mais predominantes são de 10, 16-di-hidroxi 16: 0, 18-hidroxi-9,10-epoxi-18: 0, e 9,10,18-tri-hidroxi-18: 0 ácidos gordos. Curiosamente, folha de Arabidopsis e cutina haste é composta principalmente de 18: 2 de ácido dicarboxílico 7,8. Cutículas vegetais também apresentam uma considerável variabilidade em espessura, variando de poucos nanómetros a vários micrómetros 9. Uma vez que o isolamento cutícula é uma etapa trabalhosa e demorada, especialmente para cutículas folha muito fina, tais como aqueles da Arabidopsis thaliana 8, os métodos que não utilizam o isolamento cutícula foram desenvolvidos e validados 7,8. Aqui, nós descrevemos um protocolo detalhado para o estudo da composição de monómero de cutina em folhas de Arabidopsis thaliana por metóxido de sódio (NaOMe) catalisada por despolimerização e subsequente cromatografia em fase gasosa / espectrometria de massa (GC / MS) análise. Este protocolo oferece um método robusto para ensaiar a composition de poliésteres planta de lipídios nos tecidos delipidadas inteiros, e foi adaptado a partir de protocolos previamente relatados 7,10,11. Amostras de tecido integrais são primeiro homogeneizado e exaustivamente delipidadas, removendo lipídios solventes extraível incluindo cuticular e ceras epicuticulares, lípidos da membrana, e triacilgliceróis. Enriquecida resíduos de parede celular são então despolimerizados em seus constituintes monómeros de éster de metilo por metanólise catalisada por metóxido de sódio. Ésteres metílicos dos ácidos gordos são extraídos por acidificação, e os seus derivados para obter trimetilsililo ou acetilo derivados correspondentes. Resíduos derivatizados são altamente voláteis, e podem ser eluídas a partir de uma coluna de cromatografia em fase gasosa a uma temperatura razoável, sem alterar a sua conformação estrutural durante a análise de GC / MS.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1105">
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:423px;">Chemicals</td>
			<td style="width:228px;"></td>
			<td style="width:153px;"></td>
			<td style="width:301px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:423px;">2-propanol</td>
			<td style="width:228px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:153px;">BPA451-4</td>
			<td style="width:301px;">Solvent for delipidation</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:423px;">Anhydrous sodium sulfate</td>
			<td style="width:228px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:153px;">S421500</td>
			<td style="width:301px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:423px;">Acetic anhydride</td>
			<td style="width:228px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:153px;">320102</td>
			<td style="width:301px;">Derivatization agent</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:423px;">BSTFA (N,O-bis(trimethylsilyl)-trifluoroacetamide)</td>
			<td style="width:228px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:153px;">15222</td>
			<td style="width:301px;">Derivatization agent</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:423px;">Butylated hydroxytoluene (BHT)</td>
			<td style="width:228px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:153px;">101162</td>
			<td style="width:301px;">Antioxidant</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:423px;">Calcium chloride, anhydrous</td>
			<td style="width:228px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:153px;">C614-3</td>
			<td style="width:301px;">Desiccation agent</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:423px;">Calcium suflate, anhydrous (DRIERITE- 8 MESH with indicator)</td>
			<td style="width:228px;">Acros Organics</td>
			<td>219090020</td>
			<td style="width:301px;">Desiccation agent</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:423px;">Chloroform (Trichloromethane)</td>
			<td style="width:228px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:153px;">C6074</td>
			<td style="width:301px;">Organic solvent</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:423px;">Glacial acetic acid</td>
			<td style="width:228px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:153px;">BP2401212</td>
			<td style="width:301px;">Acidification agent</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:423px;">Helium carrier gas, compressed</td>
			<td style="width:228px;">Air Liquide</td>
			<td style="width:153px;">ALPHAGAZ1-UN1046</td>
			<td style="width:301px;">Carrier gas, GC/MS</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:423px;">Heptane</td>
			<td style="width:228px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:153px;">H3501</td>
			<td style="width:301px;">Organic solvent</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:423px;">Hexanes</td>
			<td style="width:228px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:153px;">H3024</td>
			<td style="width:301px;">Organic solvent</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:423px;">Methanol</td>
			<td style="width:228px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:153px;">A4124</td>
			<td style="width:301px;">Organic solvent, transmethylation reactive</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:423px;">Methyl acetate</td>
			<td style="width:228px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:153px;">296996</td>
			<td style="width:301px;">Organic solvent</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:423px;">Methyl heptadecanoate</td>
			<td style="width:228px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:153px;">H4515</td>
			<td style="width:301px;">Internal standard (1mg/mL stock)</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:423px;">Methylene dichloride (Dichloromethane)</td>
			<td style="width:228px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:153px;">D374</td>
			<td style="width:301px;">Organic solvent</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:423px;">Nitrogen, compressed</td>
			<td style="width:228px;">Air Liquide</td>
			<td style="width:153px;">ALPHAGAZ1-UN1044</td>
			<td style="width:301px;">Carrier gas, GC-FID</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:423px;">Pentadecanolactone</td>
			<td style="width:228px;">Fluka</td>
			<td style="width:153px;">76530</td>
			<td style="width:301px;">Internal standard (1 mg/mL stock)</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:423px;">Pyridine</td>
			<td style="width:228px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:153px;">270970</td>
			<td style="width:301px;">Co-solvent for derivatization</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:423px;">Sodium chloride</td>
			<td style="width:228px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:153px;">BP358212</td>
			<td style="width:301px;">Saline solution</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:423px;">Sodium methoxide (25wt.%)</td>
			<td style="width:228px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:153px;">156256</td>
			<td style="width:301px;">Nucleophile</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:423px;">Toluene</td>
			<td style="width:228px;">FIsher Scientific</td>
			<td style="width:153px;">T2904</td>
			<td style="width:301px;">Organic solvent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">Plant Growth Supplies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:423px;">Pro-Mix PGX</td>
			<td>Premier Tech Horticulture Ltd</td>
			<td style="width:153px;"></td>
			<td style="width:301px;">Pro-Mix PGX is recommended to grow Arabidopsis plants (Eddy, R. and Hahn, D.T., 2012,http://docs.lib.purdue.edu/pmag/2) 
			Purdue Methods for Arabidopsis Growth.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;">PermaNest Humidity Dome&#160;</td>
			<td style="width:228px;">Grower&#39;s Solution, LLC, Cookeville, TN&#160;</td>
			<td style="width:153px;">GD2211-24</td>
			<td style="width:301px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;">Perma-Nest Plant Trays (22x11in)</td>
			<td style="width:228px;">Grower&#39;s Solution, LLC, Cookeville, TN&#160;</td>
			<td style="width:153px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;">Square greenhouse pots, 3.5 inch&#160;</td>
			<td style="width:228px;">Grower&#39;s Solution, LLC, Cookeville, TN&#160;</td>
			<td style="width:153px;">P86</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:423px;">General Purpose Plant Fertilizer, Plant-Prod 20-20-20</td>
			<td style="width:228px;">Premier Tech Home and Garden In., Brantford, ON</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glassware</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:423px;">13 x 100 mm glass test tube with Teflon-faced screw cap</td>
			<td style="width:228px;">Kimble Chase Life Science and Research Products LLC</td>
			<td style="width:153px;">45066A-13100</td>
			<td style="width:301px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:423px;">16 x 125 mm glass test tube with Teflon-faced screw cap</td>
			<td style="width:228px;">Kimble Chase Life Science and Research Products LLC</td>
			<td style="width:153px;">45066A-16125</td>
			<td style="width:301px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:423px;">20 x 125 mm glass test tubes with Teflon-faced screw cap</td>
			<td style="width:228px;">Kimble Chase Life Science and Research Products LLC</td>
			<td style="width:153px;">45066A-20125</td>
			<td style="width:301px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:423px;">GC vial caps</td>
			<td style="width:228px;">National Scientific</td>
			<td style="width:153px;">C400051A</td>
			<td style="width:301px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:423px;">GC vial microinserts</td>
			<td style="width:228px;">National Scientific</td>
			<td style="width:153px;">C4011631</td>
			<td style="width:301px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:423px;">GC vials</td>
			<td style="width:228px;">National Scientific</td>
			<td style="width:153px;">C40001</td>
			<td style="width:301px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:423px;">Disposable pasteur pipets</td>
			<td style="width:228px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:153px;">1367820B</td>
			<td style="width:301px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:423px;">Flasks</td>
			<td style="width:228px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:153px;"></td>
			<td style="width:301px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:423px;">Allegra X15R centrifuge</td>
			<td style="width:228px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:153px;"></td>
			<td style="width:301px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:423px;">Analytic balance</td>
			<td style="width:228px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:153px;"></td>
			<td style="width:301px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:423px;">Belly dancer</td>
			<td style="width:228px;"></td>
			<td style="width:153px;"></td>
			<td style="width:301px;">A shaker can be used for this purpose if Belly Dancer not available</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:423px;">DB-5 Capillary GC column</td>
			<td style="width:228px;">J&#38;W Scientific, CA, USA;&#160;</td>
			<td style="width:153px;"></td>
			<td style="width:301px;">30 m x 0.25 mm x 0.25 &#956;m film thickness</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:423px;">Desiccator</td>
			<td style="width:228px;"></td>
			<td style="width:153px;"></td>
			<td style="width:301px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:423px;">Isotemp 202 water bath</td>
			<td style="width:228px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:153px;"></td>
			<td style="width:301px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:423px;">ISQ LT single quadupole mass spectrometer</td>
			<td style="width:228px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:153px;"></td>
			<td style="width:301px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:423px;">Heat block</td>
			<td style="width:228px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:153px;"></td>
			<td style="width:301px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:423px;">Nitrogen evaporator</td>
			<td style="width:228px;"></td>
			<td style="width:153px;"></td>
			<td style="width:301px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:423px;">Polytron homogenizer</td>
			<td style="width:228px;">Birkmann</td>
			<td style="width:153px;"></td>
			<td style="width:301px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:423px;">Trace 1300 gas chromatograph</td>
			<td style="width:228px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:153px;"></td>
			<td style="width:301px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:423px;">Two-stage regulator</td>
			<td style="width:228px;">Air Liquide</td>
			<td style="width:153px;">Q1-318B-580</td>
			<td style="width:301px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:423px;">Vacuum desiccator</td>
			<td style="width:228px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:153px;"></td>
			<td style="width:301px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:423px;">Vortex mixer</td>
			<td style="width:228px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:153px;"></td>
			<td style="width:301px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and compositional analysis of plant cuticle lipid polyester monomers

Terrestrial plants produce extracellular aliphatic biopolyesters that modify cell walls of specific tissues. Epidermal cells synthesize cutin, a polyester of glycerol and modified fatty acids that constitutes the framework of the cuticle that covers aerial plant surfaces. Suberin is a related lipid polyester that is deposited on the cell walls of certain tissues, including the root endodermis and the periderm of tubers, tree bark and roots. These lipid polymers are highly variable in composition among plant species, and often differ among tissues within a single species. Here, we describe a detailed protocol to study the monomer composition of cutin in Arabidopsis thaliana leaves by sodium methoxide (NaOMe)-catalyzed depolymerisation, derivatization, and subsequent gas chromatography-mass spectrometry (GC/MS) analysis. This method can be used to investigate the monomers of insoluble polyesters isolated from whole delipidated plant tissues bearing either cutin or suberin. The method can by applied not only to characterize the composition of lipid polymers in species not previously analyzed, but also as an analytical tool in forward and reverse genetic approaches to assess candidate gene function.

O protocolo descrito no presente manuscrito está configurado para determinar monómeros de poliéster de lipídios, minimizando as contribuições de lípidos não Cutin 10 Figura 1 apresenta uma visão geral do ensaio, que toma por completo entre 8 (ie, cutin ou suberina.) -. 10 dias (a partir de colheita de tecido inicial a obtenção de dados de GC), dependendo de quanto tempo as amostras são deixadas a secar. A metanólise catalisada por base seleccionada (Figura 2) Método para despolimerizar poliésteres foi previamente validado para as sementes de Arabidopsis, que contêm tanto cutina e suberina. Os tecidos são homogeneizados e exaustivamente primeiro delipidada para remover lípidos de solventes extraíveis. O rendimento resíduo após a extração, como porcentagem do peso fresco inicial, é normalmente de 6% para A. thaliana Col-0 folhas. Enriquecida resíduos de parede celular são secos num exsicador de vácuo e, em seguida, nos seus constituintes despolimerizado monómeros de éster de metilo decatalisada por base transmetilação. Duas horas de incubação foi escolhido como o tempo necessário para a despolimerização crítica e recuperação de componentes de poliéster de lípidos adequada. Tempos de incubação mais longos resultou em aumento de ácidos 2-hidroxi; estes potencialmente derivar de esfingolípidos membrana 10. Um cromatograma típico de Arabidopsis do tipo selvagem se cutina folha é mostrada na Figura 3, para derivados S -TMSi éter (Figura 3A) e derivados de O-acetil (Figura 3B). Cada pico foi identificado por comparação com os espectros de massa a partir da literatura 7,8 e uma base de dados pública 12 .O nosso protocolo de vídeo mostra como preparar derivados de TMSI, mas as amostras podem, alternativamente, ser acetilado para derivatizar grupos hidroxilo. Derivados silanisados ​​são bons para fins de identificação, porque eles dão espectros de massa de diagnóstico. No entanto, os derivados acetilados são mais estáveis ​​e uma boa alternativa para a sililaçãomonômeros uma vez foram identificados 10. Para ajudar a implementar esse protocolo em laboratórios que têm apenas GC acoplado ao detector de ionização de chama (FID), GC / FID traços correspondentes a derivativos acetilados de WT monómeros folha cutina e para uma série homólogo de normas metílicos dos ácidos gordos éster são também mostrados (Figura Suplementar 4). Este método é qualitativa e detecta diferenças quantitativas entre amostras, daí o seu valor para a análise mutante. As quantidades de monómeros individuais são determinadas usando o método do padrão interno de quantificação, permitindo comparações de abundância monómero entre as amostras. Deve esclarecer-se, no entanto, que o tamanho de pico (contagens totais de iões) podem não coincidir com as razões molares dos monómeros do poliéster. Estamos incluindo tabelas editáveis ​​de monômeros para calcular os montantes de monômero em folha Arabidopsis cutin como ésteres de ácidos gordos e derivados metílicos EAS (Supplemental arquivo 1), ou ace<html> Tyl (Supplemental derivados de arquivo 2) de álcoois. Estas tabelas podem ter de ser adaptados se amostras são extraídas a partir de órgãos ou de diferentes espécies de plantas. Como exemplo, temos analisado Arabidopsis Thalia na Columbia (Col-0) folhas de tipo selvagem e dois alelos nulos-mutante anteriormente caracterizados do gene CYP86A2 / ATT1, att1-1 (m-1) e att1-2 (m-2 ) 13,14. Monooxigenases do citocromo P450 da subfamília CYP86A codificar supostos co-oxidases e participe de suberina e cutina biossíntese monômero. Os nossos resultados (Figura 4) demonstram as reduções significativas na quantidade de três principais monómeros lipídicas nas folhas mutantes em comparação com as folhas WT. Consistente com a função da enzima previsto, 16: 0, 18: 2, e 18: 1 dicarboxilatos foram especificamente afectados em mutantes ATT1. &quot;Src =&quot; / files / ftp_upload / 53386 / 53386fig1.jpg &quot;/&gt; Figura 1. Visão geral da análise de poliéster lipídico. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53386/53386fig1large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/53386/53386fig2.jpg" /> Figura 2. Mecanismo de transmetilação NaOMe a reacção catalisada. Os aniões metóxido nucleofílicos atacar o carbono cabonyl de poliésteres lipídicos para formar um intermediário tetraédrico instável (A), que dissocia-se facilmente em ésteres metílicos de ácidos gordos e de alcóxido aniões (B). Estes alcóxidos são bases conjugadas, e reagir com metanol, regenerando os aniões metóxido cataliticamente activas, sustentando assim as reacções de despolimerização adicionais (C). Se a água está presente nasistema, que irá reagir com metóxido de sódio para formar hidróxido de sódio, uma base forte que irreversivelmente hidrolisa para produzir ésteres de ácidos gordos livres indesejáveis. Acetato de metila é adicionado como um co-solvente 15 para remover pequenas quantidades de hidróxido de sódio dentro do sistema (D). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53386/53386fig2large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/53386/53386fig3.jpg" /> Figura 3. Representante cromatograma iónico total de tipo selvagem folha Arabidopsis thaliana monómeros cutina. (A) O trimetilsilílico (TMSi) éter e (B) derivados de hidroxila de etilo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53386/53386fig3large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> </a&gt; <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/53386/53386fig4.jpg" /> Figura 4. cutina composição de monómero de Arabidopsis thaliana WT e dois alelos mutantes nulos do gene CYP86A2. (Mutante-1 = att1-1; mutante-2 = att1-2) As barras de erro representam o desvio padrão da média (n = 4) . Adaptado a partir de 13, com a permissão de © Blackwell Publishing (2007). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53386/53386fig4large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="figura 1" src="/files/ftp_upload/53386/53386supfig1.jpg" /> Figura Suplementar 1. Pico resultados de integração tabela do software de GC / MS. Os picos correspondentes a monómeros identificados e os padrões internos são identificados pela sua retenti<html> a tempo (coluna C) e valores de área estão tabulados na coluna D. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53386/Supplemental_Figure_1.tif" target="_blank">Por favor, clique aqui para fazer o download deste arquivo.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/53386/53386supfig2.jpg" /> Suplementar Arquivo 2. Tabela de Arabidopsis monómeros Cutin (derivados trimetilsililico de ésteres metílicos dos ácidos gordos hidroxi). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53386/Supplemental_File_2_Cutin_template_TMSi.xls" target="_blank">Por favor clique aqui para fazer o download deste arquivo.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/53386/53386supfig3.jpg" /> Suplementar Tabela 3. Ficheiro de Arabidopsis monómeros cutina (derivados de O-acetil de ésteres metílicos de ácidos hidroxi-gordos).com / arquivos / ftp_upload / 53386 / &quot;target =&quot; _ blank Supplemental_File_3_Cutin_template_Acetylated_derivatives.xlsx &quot;&gt; Por favor clique aqui para fazer o download deste arquivo. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/53386/53386supfig4.jpg" /> Suplementar Figura 4. GC / FID vestígios de (AB) de éster metílico de ácido gordo (FAME) padrões de índice de retenção (picos são rotulados com cada comprimento de cadeia saturada FAME); e (C) A. acetilado folha WT thaliana monómeros cutina. Os números no pico correspondem a: 16: 0 FAME (1), ácido ferúlico (2), 18: 3 FAME (3), 18: 1/18: 2 FAMEs (4), 18: 0 FAME (5), sinapate (6 ), 16: 0 DCA (7), 16-OH 16: 0 FAME (8), 18: 2 DCA (9), 18: 1 DCA (10) 18: 0 DCA (11), 18-OH 18: 2 FAME (12), 18-OH 18: 1 FAME (13), 20: 0 FAME (14), 10,16-DIOH 16: 0 FAME (15), 24: 0 FAME (16). DCA: éster dimetílico do ácido dicarboxílico; FAME: éster metílico de ácidos gordos; IS1: padrão interno 1, 17: 0 FAME; IS2: st internoAndard 2, 15-OH 15: 0 FAME. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53386/Supplemental_Figure_4.tif" target="_blank">Por favor clique aqui para fazer o download deste arquivo.</a>

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Isolation and Compositional Analysis of Plant Cuticle Lipid Polyester Monomers

Lipid polyesters constitute the structural components of two cell wall modifications, the plant cuticle and suberin-containing diffusion barriers. In this video, we describe a method to depolymerize cutin from whole delipidated leaves. The method can be applied to investigating mutants compromised in either cutin or suberin biosynthesis.

Isolamento e composicional Análise da cutícula vegetal lipídicas poliéster Monómeros

Terrestrial plants produce extracellular aliphatic biopolyesters that modify cell walls of specific tissues. Epidermal cells synthesize cutin, a polyester ...

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Research

JoVE Journal

Biology

16.6K visualizações.  Algoma University. Lipid polyesters constitute the structural components of two cell wall modifications, the plant cuticle and suberin-containing diffusion barriers. In this video, we describe a method to depolymerize cutin from whole delipidated leaves. The method can be applied to investigating mutants compromised in either cutin or suberin biosynthesis.

Vídeo: Isolation and Compositional Analysis of Plant Cuticle Lipid Polyester Monomers

Use of Arabidopsis eceriferum Mutants to Explore Plant Cuticle Biosynthesis

The plant cuticle is a waxy outer covering on plants that has a primary role in water conservation, but is also an important barrier against the entry of pathogenic microorganisms.  The cuticle is made up of a tough crosslinked polymer called "cutin" and a protective wax layer that seals the plant surface.  The waxy layer of the cuticle is obvious on many plants, appearing as a shiny film on the ivy leaf or as a dusty outer covering on the surface of a grape or a cabbage leaf thanks to light scattering crystals present in the wax.  Because the cuticle is an essential adaptation of plants to a terrestrial environment, understanding the genes involved in plant cuticle formation has applications in both agriculture and forestry. Today, we'll show the analysis of plant cuticle mutants identified by forward and reverse genetics approaches.


The plant cuticle is a waxy outer covering on plants that has a primary role in water conservation but is also an important barrier against the entry of pathogenic microorganisms. In this video, we demonstrate the analysis of plant cuticle mutants identified by forward and reverse genetics approaches.

Uso de Arabidopsis mutantes eceriferum para Explorar Biossíntese Cutícula Vegetal

The plant cuticle is a waxy outer covering on plants that has a primary role in water conservation, but is also an important barrier against the entry of ...

Biologia

Mating and Tetrad Separation of Chlamydomonas reinhardtii for Genetic Analysis

The unicellular green alga Chlamydomonas reinhardtii (Chlamydomonas) has become a popular organism for research in diverse areas of cell biology and genetics because of its simple life cycle, ease of growth and manipulation for genetic analysis, genomic resources, and transformability of the nucleus and both organelles. Mating strains is a common practice when genetic approaches are used in Chlamydomonass, to create vegetative diploids for analysis of dominance, or following tetrad dissection to ascertain nuclear vs. organellar inheritance, to test allelism, to analyze epistasy, or to generate populations for the purpose of map-based cloning. Additionally, genetic crosses are routinely used to combine organellar genotypes with particular nuclear genotypes. Here we demonstrate standard methods for gametogenesis, mating, zygote germination and tetrad separation. This protocol consists of an easy-to-follow series of steps that will make genetic approaches amenable to scientists who are less familiar with Chlamydomonas. Key parameters and trouble spots are explained. Finally, resources for further information and alternative methods are provided.

Mating and Tetrad Separation of Chlamydomonas reinhardtii for Genetic Analysis

Mating and tetrad separation are required for genetic analysis in Chlamydomonas reinhardtii. Here we demonstrate standard methods for gametogenesis, mating, zygote germination and tetrad dissection. This protocol consists of an easy-to-follow series of steps that will make genetic approaches amenable to scientists who are less familiar with Chlamydomonas.

Acasalamento e separação da Tétrade Chlamydomonas reinhardtii Para análise genética

The unicellular green alga Chlamydomonas reinhardtii (Chlamydomonas) has become a popular organism for research in diverse areas of cell biology and ...

Comprehensive Compositional Analysis of Plant Cell Walls (Lignocellulosic biomass) Part I: Lignin

The need for renewable, carbon neutral, and sustainable raw materials for industry and society has become one of the most pressing issues for the 21st century. This has rekindled interest in the use of plant products as industrial raw materials for the production of liquid fuels for transportation1 and other products such as biocomposite materials7. Plant biomass remains one of the greatest untapped reserves on the planet4. It is mostly comprised of cell walls that are composed of energy rich polymers including cellulose, various hemicelluloses (matrix polysaccharides, and the polyphenol lignin6 and thus sometimes termed lignocellulosics. However, plant cell walls have evolved to be recalcitrant to degradation as walls provide tensile strength to cells and the entire plants, ward off pathogens, and allow water to be transported throughout the plant; in the case of trees up to more the 100 m above ground level. Due to the various functions of walls, there is an immense structural diversity within the walls of different plant species and cell types within a single plant4. Hence, depending of what crop species, crop variety, or plant tissue is used for a biorefinery, the processing steps for depolymerization by chemical/enzymatic processes and subsequent fermentation of the various sugars to liquid biofuels need to be adjusted and optimized. This fact underpins the need for a thorough characterization of plant biomass feedstocks. Here we describe a comprehensive analytical methodology that enables the determination of the composition of lignocellulosics and is amenable to a medium to high-throughput analysis. In this first part we focus on the analysis of the polyphenol lignin (Figure 1). The method starts of with preparing destarched cell wall material. The resulting lignocellulosics are then split up to determine its lignin content by acetylbromide solubilization3, and its lignin composition in terms of its syringyl, guaiacyl- and p-hydroxyphenyl units5. The protocol for analyzing the carbohydrates in lignocellulosic biomass including cellulose content and matrix polysaccharide composition is discussed in Part II2.

Comprehensive Compositional Analysis of Plant Cell Walls Lignocellulosic biomass Part I: Lignin

Plant biomass is a major carbon-neutral renewable resource that could be used for the production of biofuels. Plant biomass consists mainly of cell walls, a structurally complex composite material termed lignocellulosics. Here we describe a protocol for a comprehensive analysis of the content and composition of the polyphenolic lignin.

Análise da composição completa de paredes celulares das plantas (biomassa lignocelulósica) Parte I: A lignina

The need for renewable, carbon neutral, and sustainable raw materials for industry and society has become one of the most pressing issues for the 21st ...

Comprehensive Compositional Analysis of Plant Cell Walls (Lignocellulosic biomass) Part II: Carbohydrates

The need for renewable, carbon neutral, and sustainable raw materials for industry and society has become one of the most pressing issues for the 21st century. This has rekindled interest in the use of plant products as industrial raw materials for the production of liquid fuels for transportation2 and other products such as biocomposite materials6. Plant biomass remains one of the greatest untapped reserves on the planet4. It is mostly comprised of cell walls that are composed of energy rich polymers including cellulose, various hemicelluloses, and the polyphenol lignin5 and thus sometimes termed lignocellulosics. However, plant cell walls have evolved to be recalcitrant to degradation as walls contribute extensively to the strength and structural integrity of the entire plant. Despite its necessary rigidity, the cell wall is a highly dynamic entity that is metabolically active and plays crucial roles in numerous cell activities such as plant growth and differentiation5. Due to the various functions of walls, there is an immense structural diversity within the walls of different plant species and cell types within a single plant4. Hence, depending of what crop species, crop variety, or plant tissue is used for a biorefinery, the processing steps for depolymerisation by chemical/enzymatic processes and subsequent fermentation of the various sugars to liquid biofuels need to be adjusted and optimized. This fact underpins the need for a thorough characterization of plant biomass feedstocks. Here we describe a comprehensive analytical methodology that enables the determination of the composition of lignocellulosics and is amenable to a medium to high-throughput analysis (Figure 1). The method starts of with preparing destarched cell wall material. The resulting lignocellulosics are then split up to determine its monosaccharide composition of the hemicelluloses and other matrix polysaccharides1, and its content of crystalline cellulose7. The protocol for analyzing the lignin components in lignocellulosic biomass is discussed in Part I3.

Comprehensive Compositional Analysis of Plant Cell Walls Lignocellulosic biomass Part II: Carbohydrates

Plant biomass is a major carbon-neutral renewable resource that could be used for the production of biofuels. Plant biomass consists mainly of cell walls, a structurally complex composite material termed lignocellulosics. Here we describe a protocol for a comprehensive analysis of the content and composition of wall derived carbohydrates.

Análise da composição completa de paredes celulares das plantas (biomassa lignocelulósica) Parte II: Os hidratos de carbono

Efficient and Rapid Isolation of Early-stage Embryos from Arabidopsis thaliana Seeds

In flowering plants, the embryo develops within a nourishing tissue - the endosperm - surrounded by the maternal seed integuments (or seed coat). As a consequence, the isolation of plant embryos at early stages (1 cell to globular stage) is technically challenging due to their relative inaccessibility. Efficient manual dissection at early stages is strongly impaired by the small size of young Arabidopsis seeds and the adhesiveness of the embryo to the surrounding tissues. Here, we describe a method that allows the efficient isolation of young Arabidopsis embryos, yielding up to 40 embryos in 1 hr to 4 hr, depending on the downstream application. Embryos are released into isolation buffer by slightly crushing 250-750 seeds with a plastic pestle in an Eppendorf tube. A glass microcapillary attached to either a standard laboratory pipette (via a rubber tube) or a hydraulically controlled microinjector is used to collect embryos from droplets placed on a multi-well slide on an inverted light microscope. The technical skills required are simple and easily transferable, and the basic setup does not require costly equipment. Collected embryos are suitable for a variety of downstream applications such as RT-PCR, RNA sequencing, DNA methylation analyses, fluorescence in situ hybridization (FISH), immunostaining, and reporter gene assays.

Efficient and Rapid Isolation of Early-stage Embryos from Arabidopsis thaliana Seeds

We report an efficient and simple method to isolate embryos at early stages of development from Arabidopsis thaliana seeds. Up to 40 embryos can be isolated in 1 hr to 4 hr, depending on the downstream application. The procedure is suitable for transcriptome, DNA methylation, reporter gene expression, immunostaining and fluorescence in situ hybridization analyses.

Isolamento eficiente e rápida de embriões em início de carreira a partir de<em&gt; Arabidopsis thaliana</em&gt; Sementes

In flowering plants, the embryo develops within a nourishing tissue - the endosperm - surrounded by the maternal seed integuments (or seed coat). As a ...

Metabolic Labeling and Membrane Fractionation for Comparative Proteomic Analysis of Arabidopsis thaliana Suspension Cell Cultures

Plasma membrane microdomains are features based on the physical properties of the lipid and sterol environment and have particular roles in signaling processes. Extracting sterol-enriched membrane microdomains from plant cells for proteomic analysis is a difficult task mainly due to multiple preparation steps and sources for contaminations from other cellular compartments. The plasma membrane constitutes only about 5-20% of all the membranes in a plant cell, and therefore isolation of highly purified plasma membrane fraction is challenging. A frequently used method involves aqueous two-phase partitioning in polyethylene glycol and dextran, which yields plasma membrane vesicles with a purity of 95% 1. Sterol-rich membrane microdomains within the plasma membrane are insoluble upon treatment with cold nonionic detergents at alkaline pH. This detergent-resistant membrane fraction can be separated from the bulk plasma membrane by ultracentrifugation in a sucrose gradient 2. Subsequently, proteins can be extracted from the low density band of the sucrose gradient by methanol/chloroform precipitation. Extracted protein will then be trypsin digested, desalted and finally analyzed by LC-MS/MS. Our extraction protocol for sterol-rich microdomains is optimized for the preparation of clean detergent-resistant membrane fractions from Arabidopsis thaliana cell cultures.
We use full metabolic labeling of Arabidopsis thaliana suspension cell cultures with K15NO3 as the only nitrogen source for quantitative comparative proteomic studies following biological treatment of interest 3. By mixing equal ratios of labeled and unlabeled cell cultures for joint protein extraction the influence of preparation steps on final quantitative result is kept at a minimum. Also loss of material during extraction will affect both control and treatment samples in the same way, and therefore the ratio of light and heave peptide will remain constant. In the proposed method either labeled or unlabeled cell culture undergoes a biological treatment, while the other serves as control 4.

Metabolic Labeling and Membrane Fractionation for Comparative Proteomic Analysis of Arabidopsis thaliana Suspension Cell Cultures

Here we describe a robust method for the fractionation of plant plasma membranes into detergent resistant and detergent soluble membranes based on a mixture of unlabeled and in vivo fully 15N labeled Arabidopsis thaliana cell cultures. The procedure is applied for comparative proteomic studies to understand signaling processes.

Metabólica Labeling e Membrana Fracionamento para Comparative Analysis proteômica de<em&gt; Arabidopsis thaliana</em&gt; Culturas suspensão de células

Plasma membrane microdomains are features based on the physical properties of the lipid and sterol environment and have particular roles in signaling ...

A New Approach for the Comparative Analysis of Multiprotein Complexes Based on 15N Metabolic Labeling and Quantitative Mass Spectrometry

The introduced protocol provides a tool for the analysis of multiprotein complexes in the thylakoid membrane, by revealing insights into complex composition under different conditions. In this protocol the approach is demonstrated by comparing the composition of the protein complex responsible for cyclic electron flow (CEF) in Chlamydomonas reinhardtii, isolated from genetically different strains. The procedure comprises the isolation of thylakoid membranes, followed by their separation into multiprotein complexes by sucrose density gradient centrifugation, SDS-PAGE, immunodetection and comparative, quantitative mass spectrometry (MS) based on differential metabolic labeling (14N/15N) of the analyzed strains. Detergent solubilized thylakoid membranes are loaded on sucrose density gradients at equal chlorophyll concentration. After ultracentrifugation, the gradients are separated into fractions, which are analyzed by mass-spectrometry based on equal volume. This approach allows the investigation of the composition within the gradient fractions and moreover to analyze the migration behavior of different proteins, especially focusing on ANR1, CAS, and PGRL1. Furthermore, this method is demonstrated by confirming the results with immunoblotting and additionally by supporting the findings from previous studies (the identification and PSI-dependent migration of proteins that were previously described to be part of the CEF-supercomplex such as PGRL1, FNR, and cyt f). Notably, this approach is applicable to address a broad range of questions for which this protocol can be adopted and e.g. used for comparative analyses of multiprotein complex composition isolated from distinct environmental conditions.

A New Approach for the Comparative Analysis of Multiprotein Complexes Based on 15N Metabolic Labeling and Quantitative Mass Spectrometry

The described comparative, quantitative proteomic approach aims at obtaining insights into the composition of multiprotein complexes&#160;under different conditions and is demonstrated by comparing genetically different strains. For quantitative analysis equal volumes of different fractions from a sucrose density gradient are mixed and analyzed by mass spectrometry.

Uma Nova Abordagem para a Análise Comparativa de Complexos Multiproteicos Baseado em<sup&gt; 15</sup&gt; N Metabólica Labeling e quantitativa Espectrometria de Massa

The introduced protocol provides a tool for the analysis of multiprotein complexes in the thylakoid membrane, by revealing insights into complex ...

Isolation and Physiological Analysis of Mouse Cardiomyocytes

Cardiomyocytes, the workhorse cell of the heart, contain exquisitely organized cytoskeletal and contractile elements that generate the contractile force used to pump blood. Individual cardiomyocytes were first isolated over 40 years ago in order to better study the physiology and structure of heart muscle. Techniques have rapidly improved to include enzymatic digestion via coronary perfusion. More recently, analyzing the contractility and calcium flux of isolated myocytes has provided a vital tool in the cellular and sub-cellular analysis of heart failure. Echocardiography and EKGs provide information about the heart at an organ level only. Cardiomyocyte cell culture systems exist, but cells lack physiologically essential structures such as organized sarcomeres and t-tubules required for myocyte function within the heart. In the protocol presented here, cardiomyocytes are isolated via Langendorff perfusion. The heart is removed from the mouse, mounted via the aorta to a cannula, perfused with digestion enzymes, and cells are introduced to increasing calcium concentrations. Edge and sarcomere detection software is used to analyze contractility, and a calcium binding fluorescent dye is used to visualize calcium transients of electrically paced cardiomyocytes; increasing understanding of the role cellular changes play in heart dysfunction. Traditionally used to test drug effects on cardiomyocytes, we employ this system to compare myocytes from WT mice and mice with a mutation that causes dilated cardiomyopathy. This protocol is unique in its comparison of live cells from mice with known heart function and known genetics. Many experimental conditions are reliably compared, including genetic or environmental manipulation, infection, drug treatment, and more. Beyond physiologic data, isolated cardiomyocytes are easily fixed and stained for cytoskeletal elements. Isolating cardiomyocytes via perfusion is an extremely versatile method, useful in studying cellular changes that accompany or lead to heart failure in a variety of experimental conditions.

Individual cardiomyocytes from wild type and mutant mice can be isolated from the heart in order to study their contractility and calcium transients. This allows characterization of the contribution of cellular dysfunction to heart dysfunction from any cause.

Isolamento e Fisiológica Análise de rato Cardiomyocytes

Cardiomyocytes, the workhorse cell of the heart, contain exquisitely organized cytoskeletal and contractile elements that generate the contractile force ...

Measurement of Energy Metabolism in Explanted Retinal Tissue Using Extracellular Flux Analysis

High acuity vision is a heavily energy-consuming process, and the retina has developed several unique adaptations to precisely meet such demands while maintaining transparency of the visual axis. Perturbations to this delicate balance cause blinding illnesses, such as diabetic retinopathy. Therefore, the understanding of energy metabolism changes in the retina during disease is imperative to the development of rational therapies for various causes of vison loss. The recent advent of commercially-available extracellular flux analyzers has made the study of retinal energy metabolism more accessible. This protocol describes the use of such an analyzer to measure contributions to retinal energy supply through its two principle arms - oxidative phosphorylation and glycolysis - by quantifying changes in oxygen consumption rates (OCR) and extracellular acidification rates (ECAR) as proxies for these pathways. This technique is readily performed in explanted retinal tissue, facilitating assessment of responses to multiple pharmacologic agents in a single experiment. Metabolic signatures in retinas from animals lacking rod photoreceptor signaling are compared to wild-type controls using this method. A major limitation in this technique is the lack of ability to discriminate between light-adapted and dark-adapted energy utilization, an important physiologic consideration in retinal tissue.

This technique describes real time recording of oxygen consumption and extracellular acidification rates in explanted mouse retinal tissues using an extracellular flux analyzer.

Medição do metabolismo energético, no tecido da retina explantado, usando análise de fluxo extracelular

High acuity vision is a heavily energy-consuming process, and the retina has developed several unique adaptations to precisely meet such demands while ...

Rapid Lipid Droplet Isolation Protocol Using a Well-established Organelle Isolation Kit

Lipid droplets (LDs) are bioactive organelles found within the cytosol of the most eukaryotic and some prokaryotic cells. LDs are composed of neutral lipids encased by a monolayer of phospholipids and proteins. Hepatic LD lipids, such as ceramides, and proteins are implicated in several diseases that cause hepatic steatosis. Although previous methods have been established for LD isolation, they require a time-consuming preparation of reagents and are not designed for the isolation of multiple subcellular compartments. We sought to establish a new protocol to enable the isolation of LDs, endoplasmic reticulum (ER), and lysosomes from a single mouse liver.
Further, all reagents used in the protocol presented here are commercially available and require minimal reagent preparation without sacrificing LD purity. Here we present data comparing this new protocol to a standard sucrose gradient protocol, demonstrating comparable purity, morphology, and yield. Additionally, we can isolate ER and lysosomes using the same sample, providing detailed insight into the formation and intracellular flux of lipids and their associated proteins.

This protocol establishes a novel method of lipid droplet isolation and purification from mouse livers, using a well-established endoplasmic reticulum isolation kit.

Protocolo de isolamento gota lipídica rápida usando um Kit de isolamento organela bem estabelecidas

Lipid droplets (LDs) are bioactive organelles found within the cytosol of the most eukaryotic and some prokaryotic cells. LDs are composed of neutral ...