We thank Colin Symons and James Wright for technical assistance. This work was supported by seed funding grant (WSU) to Y.B. and the innovation office at Western Sydney University. M.C. is supported by ARC fellowship (DECRA).

O protocolo que se segue descreve a preparação de ratinhos C57BL / 6 e C3H / He (retinally degenerar) tecido neuronal de rato, mas técnicas semelhantes podem ser aplicados a outras espécies. Todos os animais eram saudáveis ​​e manipulados com as condições padrão de temperatura, humidade, 12 h ciclo claro / escuro, livre acesso a comida e água, e sem quaisquer estímulos de estresse pretendidos. Todos os experimentos foram aprovados e realizados de acordo com o comitê Animal Care Universidade Western Sydney e Ética e de acordo com o uso de animais e orientações de cuidados (Animal Research Autoridade # A9452, # A10396 e # A8967). 1. Cérebro Slice Preparação <ol><li> Anestesiar os animais por inalação de isoflurano (5%) e decapitar utilizando uma guilhotina roedor. Remover o cérebro rapidamente, tal como descrito anteriormente 9 e colocá-lo em solução fisiológica gelada (aCSF) contendo (em mM): NaCl 125, KCl 2,5, MgCl2 1, 1,25 NaH 2 PO 4, 2 CaCl2, 25De NaHCO 3, 25 dextrose, e saturada com carbogéneo (95% O2 / 5% de mistura de CO 2; 310 mOsm; pH 7,4). </li><li> Corte fatias de cérebro, na região de interesse, 300 mm de espessura em micrótomo vibrando. </li><li> Transfira as fatias a um sistema de incubação personalizado construído que estreitamente monitora e controla os níveis de pH (pH 7,2-7,4), o fluxo de carbogênio e temperatura, como descrito anteriormente 10, 11. </li><li> Ajuste da temperatura inicial da câmara para 35 ° C durante 15 - 30 min, e em seguida reduzir-se lentamente a 15-16 ° C como mostrado na Figura 1C. Em seguida, incubar fatias no sistema de incubação até ser necessário, seja para eletrofisiologia ou imagem. NOTA: Se as fatias estão a ser utilizados para o cálcio-imagem, siga os passos abaixo antes de arrefecimento do tecido abaixo RT. </li></ol> 2. Preparação da retina Wholemount e Inner Limitando remoção da membrana <ol><li> Prepare wholemounts da retina quer em regime normal,condições de iluminação laboratoriais ou luz vermelha / infra-vermelho escuro. </li><li> Eutanásia de animais por deslocamento cervical e os olhos imediatamente enuclear. Fazer um pequeno corte ao longo da ora serrata e o lugar em ambos os meios de Ames, ou aCSF contendo (mM): 125 NaCl, 25 NaHCO3, 3 de KCl, 2 CaCl2, 1 MgCl2, 10 de glicose, 0,5 de L-glutamina, e saturar com carbogénio (95% O 2 mistura / 5% de CO 2; ~ 300 mOsm; pH 7,4), à TA. </li><li> Remover imediatamente a córnea, cristalino e vítreo cortando ao longo da ora serrata com uma tesoura pequena e remover a lente e vítreo com uma pinça. Colocar o tecido no sistema de incubação à TA. NOTA: tecido retiniano pode ser mantida na de taça do olho, após a redução da temperatura lento a 15-16 ° C, durante&gt; 24 h no sistema de incubação até serem necessários. </li><li> Para remover o ILM, transferir a taça de olho contendo a retina para um pequeno frasco de vidro contendo 30 U / mL de papaína, 1 mM L-cistina, EDTA 0,5 mM e 0,005% de DNase em Earl&#39;s-Solução Salina Equilibrada (BSS) a 37 ° C durante 20 min. Aplicar 95% de O2 / 5% de CO 2 para a solução através da tampa, mas não fazer espuma. Se usando tecido de animais jovens (&lt;6 semanas), dilui-se a solução a meia-força. <ol><li> Parar a digestão enzimática, através da colocação do tecido numa solução de ovomucóide (10 mg / mL) e BSA (10 mg / mL) durante 10 min em BSS de Earl. tecido Lavar bem com aCSF antes da transferência para o sistema de incubação e reduzir a temperatura a 15-16 ° C. </li></ol></li><li> Manter o tecido da retina no olho de taça até ser necessário. Para transferência para o microscópio, isolar a retina do olho-cup e cortada em 4 pedaços com uma lâmina de barbear. Se a retina inteira é necessário, fazer quatro pequenos cortes na periferia da retina para lhe permitir ficar na posição horizontal. NOTA: Para experimentos com imagens, carga com cálcio-corantes antes da transferência para o sistema de incubação, veja abaixo. </li></ol> 3. Manter Tissue na Incubadora <ol><li&gt; Tecido Lugar na câmara principal contendo sondas para medições de pH e de temperatura (Figura 1A, B). </li><li> Circular aCSF através de uma segunda câmara (câmara UVC, construído como anteriormente descrito 12) isolado a partir da câmara principal e exposto a 1,1 W de luz UVC (254 nm, lâmpada UV 5W / 2P esterilizador), a fim de eradiate bactérias que flutuam na solução (Figura 1A). Controle UVC tempo de luz através de um timer programável usando um recurso aleatório que liga às vezes variando entre 15 e 26 min a cada 15-30 minutos para evitar o aquecimento excessivo do aCSF. </li><li> Definir a taxa de fluxo na câmara UVC a 12 mL / min conforme relatado anteriormente 12. Cubra a câmara UVC com papel alumínio para evitar UVC iluminação no exterior da câmara, o que pode danificar o tecido neuronal. NOTA: Para o tecido da retina de adaptação ao escuro, aplique uma capa feita sob medida para a câmara principal para eliminar a luz. </li><li> Use uma bomba peristáltica para Circulate a solução (aCSF) através das duas câmaras e uma placa fria termoeléctrico refrigerador Peltier para refrigeração ou o aquecimento, quer a câmara principal para as temperaturas desejadas na gama de 0 - 50 ° C. Para a incubação de tecido óptima, usar 15-16 ° C durante a viabilidade a longo prazo. </li></ol> 4. O cálcio corante de carregamento <ol><li> Selecione corantes de cálcio com base na preferência do pesquisador individual. Aqui usamos Fura-02:00, Fluo-08:00 ou Fluo-04:00. No entanto, este método pode ser aplicado a outros corantes, bem como: dissolver corantes de cálcio em DMSO a uma solução de copolímeros de 1 mM e 1% de bloco (por exemplo, ácido-127 plurónico) para um volume final de 50 mL e sonicado durante 10 minutos. </li><li> Adicionar a solução de aCSF a uma concentração final de 10 uM, copolímeros em bloco 0,01% de fatias cerebrais, e 20 uM (retina), copolímeros em bloco 0,02% para a retina. Na retina (papaína tratados) e fatias de cérebro de animais jovens, de carga para o banho durante 45 minutos a 37 ° C (Fura-2 AM) ou à TA (Fluo-4 AM; FLuo-08:00). <ol><li> Para animais adultos, (&gt; 12 semanas), pipetar os corantes (50 ul) directamente sobre as fatias de cérebro, e manter por 75 min para permitir uma melhor penetração do corante nas camadas profundas. </li><li> Para garantir uma oxigenação adequada do fatia submersa durante a incubação corante, preparar uma câmara de carga de vidro com uma tampa fechada (frasco circular de 2,5 cm de diâmetro, 3,5 centímetros de altura) com corantes de cálcio diluída em 2,5 mL de aCSF. Oxigenar continuamente com 95% O2 / 5% de CO 2. não bolha. </li></ol></li><li> Após carga de corante, lavar o tecido com aCSF e transferência para o sistema de incubação, reduzir-se lentamente a temperatura a 15-16 ° C até à sua utilização experimental. </li></ol> 5. As gravações eletrofisiológicas e imagem <ol><li> Colocar o tecido numa câmara de registo submersa sob um microscópio, e perfundir com aCSF oxigenado a um caudal de 4-5 ml / min, quer à TA (~ 22 ° C) ou à temperatura fisiológica (~ 35 ° C). hold o tecido no seu lugar por um feito usando &#39;&#39; harpa &#39;&#39;, feito de fios de nylon ou de ouro esticada e colada através de uma peça em forma de U, de ouro ou de fio de platina. </li><li> Para eletrofisiologia: <ol><li> Prepare pipetas de gravação de 1,5 mm (1,19 milímetros ID) vidro de borosilicato usando um extrator micropipeta para conseguir uma resistência final dos 5-6 mohms. </li><li> Encha a pipeta com 3-4 mL de solução interna como descrito anteriormente 13 e visualizar células sob infravermelho contraste de interferência diferencial (IR-DIC) usando uma câmera CCD. A solução intracelular devem ser cuidadosamente adaptado para cada experimento para alcançar resultados experimentais. </li><li> Posição pipeta, enquanto se mantém a pressão positiva aplicada através de uma porta de sucção no suporte da pipeta, sobre a membrana de uma célula utilizando um micromanipulador. Uma vez que a ILM foi removido a partir da retina, sem raspagem membrana prévia é necessária. Uma vez que a pipeta está na célula, aplicar negativo suavepressão para a pipeta para obter uma vedação gigaohm. Em seguida, ruptura da membrana celular com uma breve quantidade de pressão negativa. </li><li> Fazer gravações de observação de correntes ou de tensão-clamp de células inteiras usando técnicas padrão, conforme apropriado. </li></ol></li><li> Cálcio-imaging: <ol><li> Para geração de imagens raciométrica de Fura-2, use um comutador de comprimento de onda ultra-alta velocidade para proporcionar a comprimentos de onda de excitação de 340 nm e 380 nm. Passar a luz emitida a partir de células individuais através de um filtro de emissão de 510 ± 20 nm, e capturar com uma sensibilidade elevada, a câmara digital de alta velocidade. </li><li> Para um único comprimento de onda de excitação de Fluo-4, luz de excitação do filtro através de um 460 - banda nm filtro passa-490 e luz emitida através de um 515 - filtro passa banda nm 550. Para a gravação mais rápida e mais sensível usar uma câmera digital de alta velocidade tal. Adquirir imagens conforme necessário. </li><li> Medir alterações na fluorescência como uma função do tempo, quer a um único comprimento de onda (Fluo-4) ou utilizando o rácio de comprimento de ondamétodo (Fura-2), tal como descrito anteriormente 8, 14. </li></ol></li></ol>

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	<li>Colbert, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+cortical+brain+slices+for+electrophysiological+recording.">Preparation of cortical brain slices for electrophysiological recording.</a> Meth mol biol. 337, 117-125 (2006).</li><li>Gibb, A., Edwards, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patch+clamp+recording+from+cells+in+sliced+tissues.">Patch clamp recording from cells in sliced tissues.</a> Microelect Techniq. , 255-274 (1994).</li><li>Kantevari, S., Buskila, Y., Ellis-Davies, G. C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+and+characterization+of+cell-permeant+6-nitrodibenzofuranyl-caged+IP3.">Synthesis and characterization of cell-permeant 6-nitrodibenzofuranyl-caged IP3.</a> Photochem photobiol sci. 11 (3), 508-513 (2012).</li><li>Blankenship, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+and+Extrasynaptic+Factors+Governing+Glutamatergic+Retinal+Waves.">Synaptic and Extrasynaptic Factors Governing Glutamatergic Retinal Waves.</a> Neuron. 62 (2), 230-241 (2009).</li><li>Sargoy, A., Barnes, S., Brecha, N. C., Perez De Sevilla Muller, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunohistochemical+and+Calcium+Imaging+Methods+in+Wholemount+Rat+Retina.">Immunohistochemical and Calcium Imaging Methods in Wholemount Rat Retina.</a> J Vis Exp. (92), e51396 (2014).</li><li>Kulkarni, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+Ca2++dynamics+in+cone+photoreceptor+axon+terminals+of+the+mouse+retina.">Imaging Ca2+ dynamics in cone photoreceptor axon terminals of the mouse retina.</a> J Vis Exp. (99), e52588 (2015).</li><li>Velte, T. J., Masland, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Action+potentials+in+the+dendrites+of+retinal+ganglion+cells.">Action potentials in the dendrites of retinal ganglion cells.</a> J neurophysiol. 81 (3), 1412-1417 (1999).</li><li>Cameron, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+imaging+of+AM+dyes+following+prolonged+incubation+in+acute+neuronal+tissue.">Calcium imaging of AM dyes following prolonged incubation in acute neuronal tissue.</a> PLoS ONE. 11 (5), (2016).</li><li>Buskila, Y., Morley, J. W., Tapson, J., van Schaik, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+adaptation+of+spike+backpropagation+delays+in+cortical+neurons.">The adaptation of spike backpropagation delays in cortical neurons.</a> Front Cell Neurosci. 7, (2013).</li><li>Breen, P. P., Buskila, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Braincubator:+An+incubation+system+to+extend+brain+slice+lifespan+for+use+in+neurophysiology.">Braincubator: An incubation system to extend brain slice lifespan for use in neurophysiology.</a> Eng Med Biol Soc. , 4864-4867 (2014).</li><li>Buskila, Y., Breen, P., Wright, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Device+for+storing+a+tissue+sample.">Device for storing a tissue sample.</a> WIPO Patent. , (2015).</li><li>Buskila, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extending+the+viability+of+acute+brain+slices.">Extending the viability of acute brain slices.</a> Sci Rep. 4, 4-10 (2014).</li><li>Buskila, Y., Farkash, S., Hershfinkel, M., Amitai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+reactive+nitric+oxide+production+by+astrocytes+in+mouse+neocortical+slices.">Rapid and reactive nitric oxide production by astrocytes in mouse neocortical slices.</a> Glia. 52 (3), 169-176 (2005).</li><li>Barreto-Chang, O. L., Dolmetsch, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+imaging+of+cortical+neurons+using+Fura-2+AM.">Calcium imaging of cortical neurons using Fura-2 AM.</a> J Vis Exp. (23), e3-e5 (2009).</li><li>Buskila, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+Astrocytic+Nitric+Oxide+Production+and+Neuronal+Modifications+in+the+Neocortex+of+a+NOS2+Mutant+Mouse.">Enhanced Astrocytic Nitric Oxide Production and Neuronal Modifications in the Neocortex of a NOS2 Mutant Mouse.</a> PLoS ONE. 2 (9), 9 (2007).</li><li>Russell, W. M. S., Burch, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Principles of Humane Experimental Technique. , (1959).</li></ol>

Yossi Buskila and Paul Breen declare that they are co-owners of PAYO Scientific Pty Ltd, a company specialized in building incubation systems for acute neural tissue. All other authors report no financial interests or potential conflicts of interest related to the current study.

Este artigo descreve um método de incubação para estender a viabilidade do tecido neuronal aguda para geração de imagens e eletrofisiológicos experimentos, reduzindo assim o número de animais necessários para completar objetivos experimentais. Dois processos principais governam a deterioração do tecido neuronal ao longo do tempo: i) aumento dos níveis de bactérias, eo aumento de acompanhamento endotoxina bacteriana lançado, e ii) excitotoxicidade que segue o procedimento de corte traumática <sup class="xre...

Eletrofisiologia e imagens funcionais (cálcio, tensão corantes sensíveis) são duas das técnicas experimentais mais comumente usados ​​em neurociência. preparações fatia do cérebro e da retina wholemount, que será analisada aqui, fornecer um meio de examinar propriedades eletrofisiológicas e conectividade sináptica sem contaminação de anestésicos e relaxantes musculares. Fatias de cérebro e da retina Wholemount manter a sua integridade estrutural, ao contrário de culturas ou homogeneizados celulares, permitindo o estudo de circuitos específicos e redes cerebrais 1. Gravações de tecido isolado têm vantagens sobre em gravações vivo como os movimentos associados ao batimento cardíaco e respiração são eliminados. Além disso, a visualização direta permite que classes específicas de células a serem alvejados e aplicação local de ferramentas farmacológicas 2, 3. gravações de patch-clamp e calcio-corante de carga em wholemount retina é complicado devido à existência da membrana interna limitante (ILM), que cobre a camada de células ganglionares da retina (RGC) e impede o acesso directo às células. Tipicamente, esta membrana é raspada com uma pipeta de vidro para permitir a aplicação directa de uma pipeta de adesivo e a formação de uma vedação gigaohm numa única célula. Além disso, os corantes de cálcio aplicado-banho não atravessar a ILM e quer deve ser injetado sob essa membrana 4, transportado retrogradamente a seguir à injecção no nervo óptico 5 ou electroporadas através do tecido 6. Além disso, quando se utiliza um modelo de roedor de retinite pigmentosa, o rato rd / rd, a ILM é mais espessa e mais impenetrável. Aqui, usamos uma técnica para remover a ILM com a digestão enzimática 7, para permitir que tanto o cálcio onipresente corante de carregamento, e acesso directo à células ganglionares da retina para patch-clamp recordiNGS 8. gravações bem sucedidas a partir de qualquer fatias cerebrais ou da retina wholemount depender de dissecção e de incubação de tecido neuronal viável. Tipicamente, o tecido é extraído na manhã da experiência e incubada em fluido cerebrospinal artificial (aCSF) até que seja usada para gravações. Geralmente, o tecido permanece viável durante 6 - 8 h, com uma degradação significativa após esta janela de tempo. No entanto, ambas as fatias de cérebro e preparações retinae wholemount costumam produzir mais tecido do que pode ser gravado a partir de dentro deste período de tempo curto. Consequentemente, o tecido é muitas vezes descartados no final do dia e a dissecção é completada novamente nos dias subsequentes. Isso significa que um outro animal é utilizado e ~ 2 h de configuração e dissecção / coloração repetida. O protocolo seguinte descreve um método para aumentar a vida útil do tecido neuronal durante mais de 24 h, o que significa que menos animais são utilizados, e mais tempo experimental está disponível. Tissue viabilidade wcomo avaliado por meio de gravação propriedades eletrofisiológicas e dinâmica do cálcio, e essas propriedades eram indistinguíveis entre &lt;4 h e&gt; 24 h postdissection. Estes resultados indicam que não só são propriedades de uma única célula intacta e funcional após incubação prolongada, mas a atividade da rede, tal como avaliado por cálcio e de imagiologia e registos electrofisiolicos, mantém-se inalterado&gt; 24 h postdissection. Além disso, mostramos que os corantes de cálcio pode permanecer nas células durante períodos prolongados, sem causar quaisquer efeitos prejudiciais. A aplicação deste protocolo demonstra que a actividade funcional de neurónios no tecido neuronal aguda pode ser mantida por períodos longos, uma vez que o ambiente externo é altamente regulado. Além disso, como a viabilidade do tecido varia muito entre laboratórios devido a diferentes protocolos de incubação, este método estabelece um padrão de ouro para os parâmetros ideais que devem ser aplicadas para reduzir a variabilidade na saúde de neu agudatecido ronal.

<table><tbody><tr><td>Sodium Chloride</td><td>Sigma Aldrich VETEC</td><td>V800372</td><td></td></tr><tr><td>Potassium chloride</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P9333</td><td></td></tr><tr><td>N-Methyl-D-glucamine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M2004&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>D-glucose</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G5767</td><td></td></tr><tr><td>Sodium bicarbonate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S6014</td><td></td></tr><tr><td>Sodium phosphate monobasic</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S2554</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium chloride</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M9272&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Calcium chloride&amp;nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>223506</td><td></td></tr><tr><td>Papain Dissociation System</td><td>Worthington&amp;nbsp;</td><td>LK003150</td><td></td></tr><tr><td>Dimethyl sulfoxide anhydrous</td><td>Sigma Aldrich</td><td>276855</td><td></td></tr><tr><td>Pluronic F-127 Low UV absorbance*</td><td>Life technologies</td><td>P-6867</td><td>20% solution in DMSO&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Fura-2 AM&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Anaspec</td><td>84017</td><td></td></tr><tr><td>Fluo-4 AM&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>F23917</td><td></td></tr><tr><td>Fluo-8 AM</td><td>Abcam</td><td>Ab142773</td><td></td></tr><tr><td>Vibrating blade microtome&amp;nbsp;</td><td>Leica Biosystem</td><td>VT1200 S</td><td>Equiped with Leica&amp;rsquo;s Vibrocheck&amp;trade; measurement device&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Antivibration table</td><td>Kinetic Systems Vibraplane&amp;nbsp;</td><td>Vibraplane 9100/9200&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Fixed Stage Upright Microscope</td><td>Olympus</td><td>BX51WI&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Microscope Objective</td><td>Olympus</td><td>XLUMPlanFLN 20x/1.00w</td><td>20X&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Microscope Objective</td><td>Olympus</td><td>LUMPlanFLN 60x/1.00w</td><td>60X</td></tr><tr><td>CCD Camera</td><td>Andor</td><td>Ixon +</td><td></td></tr><tr><td>High speed wavelength switcher</td><td>Sutter instrument</td><td>Lambda DG-4&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Patch clamp amplifier</td><td>Molecular Devices</td><td>MultiClamp 700B</td><td></td></tr><tr><td>Data acquisition system</td><td>Molecular Devices</td><td>Digidata 1440A</td><td>Axon Digidata&amp;reg; System</td></tr><tr><td>Borosilicate glass capillaries</td><td>Sutter Instrument Co</td><td>BF150-86-10</td><td></td></tr><tr><td>Microelectrode puller</td><td>Sutter Instrument Co</td><td>P-97</td><td>Flaming/Brown type micropipette puller</td></tr><tr><td>Recording/perfusion chamber</td><td>Warner Instruments</td><td>RC-40LP</td><td>Low Profile Open Bath Chambers</td></tr><tr><td>Software</td><td>Molecular Devices</td><td>pClamp 10.2</td><td></td></tr><tr><td>Andor iQ Live Cell Imaging Software</td><td>Andor</td><td>Andor iQ3</td><td></td></tr><tr><td>Braincubator</td><td>Payo Scientific</td><td>BR26021976</td><td>www.braincubator.com.au</td></tr><tr><td>Peltier-Thermoelectric Cold Plate Cooler</td><td>TE Technology</td><td>CP-121</td><td></td></tr><tr><td>Temperature Controller</td><td>TE Technology</td><td>TC-36-25 RS232</td><td></td></tr></tbody></table>

prolonged incubation of acute neuronal tissue for electrophysiology and calcium-imaging

Aguda preparações de tecidos neuronais, fatias de cérebro e da retina wholemount, normalmente só pode ser mantida durante 6-8 h após a dissecação. Isto limita o tempo experimental, e aumenta o número de animais que são utilizados por cada estudo. Esta limitação especificamente impactos protocolos como imagem de cálcio que exigem prolongada pré-incubação com corantes aplicados-banho. exponencial do crescimento bacteriano dentro de 3 - 4 h após o corte é fortemente correlacionada com uma diminuição na saúde dos tecidos. Este estudo descreve um método para limitar a proliferação de bactérias em preparações agudas, para manter o tecido neuronal viável durante períodos de tempo prolongados (&gt; 24 h) sem a necessidade de antibióticos, procedimentos de esterilização, ou meios de cultura de tecidos contendo factores de crescimento. E ligando o fluido extracelular por meio de irradiação UV e manter o tecido numa câmara de retenção costume em 15-16 ° C, o tecido não mostra nenhuma diferença de propriedades electrofisiológicas, ou Si cálciognaling através corantes de cálcio intracelular em&gt; 24 h postdissection. Estes métodos não só irá aumentar o tempo experimental para aqueles que utilizam tecido neuronal aguda, mas irá reduzir o número de animais necessários para completar objectivos experimentais, e irá definir um padrão de ouro para a incubação do tecido neuronal aguda.

regulação apertada da carga bacteriana e a temperatura do aCSF durante a incubação é essencial para manter a viabilidade do tecido neuronal. Isto pode ser optimizado por meio de irradiação com luz UVC e mantendo a temperatura do aCSF a 15-16 ° C (Figura 1). Além disso, o aCSF os parâmetros de selo (APS; Figura 1C) fornece o experimentador com um registro das condições ambientais (pH e temperatura.), Oferecendo assim um padrão de ouro para os...

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Prolonged Incubation of Acute Neuronal Tissue for Electrophysiology and Calcium-imaging

Uma vez removido do corpo, tecido neuronal é muito afectado pelas condições ambientais, conduz a uma eventual degradação do tecido após 6-8 h. Usando um método de incubação único, que acompanha de perto e regula o ambiente extracelular do tecido, a viabilidade do tecido pode ser significativamente prolongada por&gt; 24 h.

A incubação prolongada de aguda Neuronal Tissue de Eletrofisiologia e cálcio-imaging

Acute neuronal tissue preparations, brain slices and retinal wholemount, can usually only be maintained for 6 - 8 h following dissection. This limits the ...

prolonged-incubation-acute-neuronal-tissue-for-electrophysiology

Research

JoVE Journal

Neuroscience

11.9K visualizações.  Western Sydney University.  Uma vez removido do corpo, tecido neuronal é muito afectado pelas condições ambientais, conduz a uma eventual degradação do tecido após 6-8 h. Usando um método de incubação único, que acompanha de perto e regula o ambiente extracelular do tecido, a viabilidade do tecido pode ser significativamente prolongada por> 24 h. 

Vídeo: Prolonged Incubation of Acute Neuronal Tissue for Electrophysiology and Calcium-imaging

Monitoring Changes in the Intracellular Calcium Concentration and Synaptic Efficacy in the Mollusc Aplysia

It has been suggested that changes in intracellular calcium mediate the induction of a number of important forms of synaptic plasticity (e.g., homosynaptic facilitation) 1. These hypotheses can be tested by simultaneously monitoring changes in intracellular calcium and alterations in synaptic efficacy. We demonstrate how this can be accomplished by combining calcium imaging with intracellular recording techniques. Our experiments are conducted in a buccal ganglion of the mollusc Aplysia californica. This preparation has a number of experimentally advantageous features: Ganglia can be easily removed from Aplysia and experiments use adult neurons that make normal synaptic connections and have a normal ion channel distribution. Due to the low metabolic rate of the animal and the relatively low temperatures (14-16 &deg;C) that are natural for Aplysia, preparations are stable for long periods of time. 
To detect changes in intracellular free calcium we will use the cell impermeant version of Calcium Orange 2 which is easily 'loaded' into a neuron via iontophoresis. When this long wavelength fluorescent dye binds to calcium, fluorescence intensity increases. Calcium Orange has fast kinetic properties 3 and, unlike ratiometric dyes (e.g., Fura 2), requires no filter wheel for imaging. It is fairly photo stable and less phototoxic than other dyes (e.g., fluo-3) 2,4. Like all non-ratiometric dyes, Calcium Orange indicates relative changes in calcium concentration. But, because it is not possible to account for changes in dye concentration due to loading and diffusion, it can not be calibrated to provide absolute calcium concentrations. 
An upright, fixed stage, compound microscope was used to image neurons with a CCD camera capable of recording around 30 frames per second. In Aplysia this temporal resolution is more than adequate to detect even a single spike induced alteration in the intracellular calcium concentration. Sharp electrodes are simultaneously used to induce and record synaptic transmission in identified pre- and postsynaptic neurons. At the conclusion of each trial, a custom script combines electrophysiology and imaging data. To ensure proper synchronization we use a light pulse from a LED mounted in the camera port of the microscope. Manipulation of presynaptic calcium levels (e.g. via intracellular EGTA injection) allows us to test specific hypotheses, concerning the role of intracellular calcium in mediating various forms of plasticity.

Monitoring Changes in the Intracellular Calcium Concentration and Synaptic Efficacy in the Mollusc Aplysia

We demonstrate how changes in the intracellular free calcium concentration and synaptic efficacy can be simultaneously monitored in a ganglion preparation of Aplysia. We image intracellular calcium using a fluorescent dye, Calcium Orange, and induce and monitor synaptic transmission with sharp (intracellular) electrodes.

Alterações de monitoramento da concentração de cálcio intracelular e eficácia sináptica no Molusco<em&gt; Aplysia</em

It has been suggested that changes in intracellular calcium mediate the induction of a number of important forms of synaptic plasticity (e.g., ...

Neurociência

Simultaneous Electrophysiological Recording and Calcium Imaging of Suprachiasmatic Nucleus Neurons

Simultaneous electrophysiological and fluorescent imaging recording methods were used to study the role of changes of membrane potential or current in regulating the intracellular calcium concentration. Changing environmental conditions, such as the light-dark cycle, can modify neuronal and neural network activity and the expression of a family of circadian clock genes within the suprachiasmatic nucleus (SCN), the location of the master circadian clock in the mammalian brain. Excitatory synaptic transmission leads to an increase in the postsynaptic Ca2+ concentration that is believed to activate the signaling pathways that shifts the rhythmic expression of circadian clock genes. Hypothalamic slices containing the SCN were patch clamped using microelectrodes filled with an internal solution containing the calcium indicator bis-fura-2. After a seal was formed between the microelectrode and the SCN neuronal membrane, the membrane was ruptured using gentle suction and the calcium probe diffused into the neuron filling both the soma and dendrites. Quantitative ratiometric measurements of the intracellular calcium concentration were recorded simultaneously with membrane potential or current. Using these methods it is possible to study the role of changes of the intracellular calcium concentration produced by synaptic activity and action potential firing of individual neurons. In this presentation we demonstrate the methods to simultaneously record electrophysiological activity along with intracellular calcium from individual SCN neurons maintained in brain slices.

Procedures are described to perform simultaneous recordings of membrane potential or current and changes of intracellular calcium concentration. Suprachiasmatic nucleus neurons are filled with the calcium indicator bis-fura-2 using a patch clamp electrode in the whole cell patch clamp configuration.

Simultaneous electrophysiological and fluorescent imaging recording methods were used to study the role of changes of membrane potential or current in ...

Multi-photon Intracellular Sodium Imaging Combined with UV-mediated Focal Uncaging of Glutamate in CA1 Pyramidal Neurons

Multi-photon fluorescence microscopy has enabled the analysis of morphological and physiological parameters of brain cells in the intact tissue with high spatial and temporal resolution. Combined with electrophysiology, it is widely used to study activity-related calcium signals in small subcellular compartments such as dendrites and dendritic spines. In addition to calcium transients, synaptic activity also induces postsynaptic sodium signals, the properties of which are only marginally understood. Here, we describe a method for combined whole-cell patch-clamp and multi-photon sodium imaging in cellular micro domains of central neurons. Furthermore, we introduce a modified procedure for ultra-violet (UV)-light-induced uncaging of glutamate, which allows reliable and focal activation of glutamate receptors in the tissue. To this end, whole-cell recordings were performed on Cornu Ammonis subdivision 1 (CA1) pyramidal neurons in acute tissue slices of the mouse hippocampus. Neurons were filled with the sodium-sensitive fluorescent dye SBFI through the patch-pipette, and multi-photon excitation of SBFI enabled the visualization of dendrites and adjacent spines. To establish UV-induced focal uncaging, several parameters including light intensity, volume affected by the UV uncaging beam, positioning of the beam as well as concentration of the caged compound were tested and optimized. Our results show that local perfusion with caged glutamate (MNI-Glutamate) and its focal UV-uncaging result in inward currents and sodium transients in dendrites and spines. Time course and amplitude of both inward currents and sodium signals correlate with the duration of the uncaging pulse. Furthermore, our results show that intracellular sodium signals are blocked in the presence of blockers for ionotropic glutamate receptors, demonstrating that they are mediated by sodium influx though this pathway. In summary, our method provides a reliable tool for the investigation of intracellular sodium signals induced by focal receptor activation in intact brain tissue.

We describe the combination of focal UV-induced photo-activation of neuro-active compounds with whole-cell patch-clamp and multi-photon imaging of intracellular sodium transients in dendrites and spines of hippocampal neurons in acute tissue slices of the mouse brain.

Multi-photon intracelular de sódio Imagem Combinado com mediada por UV uncaging focal de glutamato em neurônios piramidais CA1

Multi-photon fluorescence microscopy has enabled the analysis of morphological and physiological parameters of brain cells in the intact tissue with high ...

Two-photon Calcium Imaging in Neuronal Dendrites in Brain Slices

Calcium (Ca2+) imaging is a powerful tool to investigate the spatiotemporal dynamics of intracellular Ca2+ signals in neuronal dendrites. Ca2+ fluctuations can occur through a variety of membrane and intracellular mechanisms and play a crucial role in the induction of synaptic plasticity and regulation of dendritic excitability. Hence, the ability to record different types of Ca2+ signals in dendritic branches is valuable for groups studying how dendrites integrate information. The advent of two-photon microscopy has made such studies significantly easier by solving the problems inherent to imaging in live tissue, such as light scattering and photodamage. Moreover, through combination of conventional electrophysiological techniques with two-photon Ca2+ imaging, it is possible to investigate local Ca2+ fluctuations in neuronal dendrites in parallel with recordings of synaptic activity in soma. Here, we describe how to use this method to study the dynamics of local Ca2+ transients (CaTs) in dendrites of GABAergic inhibitory interneurons. The method can be also applied to studying dendritic Ca2+ signaling in different neuronal types in acute brain slices.

We present a method combining whole-cell patch-clamp recordings and two-photon imaging to record Ca2+ transients in neuronal dendrites in acute brain slices.

Imagem de dois fotões cálcio em dendritos neuronais no cérebro fatias

Calcium (Ca2+) imaging is a powerful tool to investigate the spatiotemporal dynamics of intracellular Ca2+ signals in neuronal dendrites. Ca2+ ...

Preparation of Acute Spinal Cord Slices for Whole-cell Patch-clamp Recording in Substantia Gelatinosa Neurons

Recent whole-cell patch-clamp studies from substantia gelatinosa (SG) neurons have provided a large body of information about the spinal mechanisms underlying sensory transmission, nociceptive regulation, and chronic pain or itch development. Implementations of electrophysiological recordings together with morphological studies based on the utility of acute spinal cord slices have further improved our understanding of neuronal properties and the composition of local circuitry in SG. Here, we present a detailed and practical guide for the preparation of spinal cord slices and show representative whole-cell recording and morphological results. This protocol permits ideal neuronal preservation and can mimic in vivo conditions to a certain extent. In summary, the ability to obtain an in vitro preparation of spinal cord slices enables stable current- and voltage-clamp recordings and could thus facilitate detailed investigations into the intrinsic membrane properties, local circuitry and neuronal structure using diverse experimental approaches.

Here, we describe the essential steps for whole-cell patch-clamp recordings made from substantia gelatinosa (SG) neurons in the in vitro spinal cord slice. This method allows the intrinsic membrane properties, synaptic transmission and morphological characterization of SG neurons to be studied.

Preparação de fatias aguda da medula espinhal para a gravação de células inteiras remendo-braçadeira nos neurônios da substância Gelatinosa

Recent whole-cell patch-clamp studies from substantia gelatinosa (SG) neurons have provided a large body of information about the spinal mechanisms ...

Two-photon Imaging of Microglial Processes' Attraction Toward ATP or Serotonin in Acute Brain Slices

Microglial cells are resident innate immune cells of the brain that constantly scan their environment with their long processes and, upon disruption of homeostasis, undergo rapid morphological changes. For example, a laser lesion induces in a few minutes an oriented growth of microglial processes, also called &#34;directional motility&#34;, toward the site of injury. A similar effect can be obtained by delivering locally ATP or serotonin (5-hydroxytryptamine [5-HT]). In this article, we describe a protocol to induce a directional growth of microglial processes toward a local application of ATP or 5-HT in acute brain slices of young and adult mice and to image this attraction over time by multiphoton microscopy. A simple method of quantification with free and open-source image analysis software is proposed. A challenge that still characterizes acute brain slices is the limited time, decreasing with age, during which the cells remain in a physiological state. This protocol, thus, highlights some technical improvements (medium, air-liquid interface chamber, imaging chamber with a double perfusion) aimed at optimizing the viability of microglial cells over several hours, especially in slices from adult mice.

Microglia, the resident immune cells of the brain, respond quickly with morphological changes to modifications of their environment. This protocol describes how to use two-photon microscopy to study the attraction of microglial processes toward serotonin or ATP in acute brain slices of mice.

Imagem de dois fotões de atração Microglial processos para ATP ou de serotonina no cérebro aguda fatias

Microglial cells are resident innate immune cells of the brain that constantly scan their environment with their long processes and, upon disruption of ...

Establishing a Whole-Cell Configuration for Two-Photon Calcium Imaging of Brain Slices

Source: Camir&#233;, O., et al. <a href="https://app.jove.com/v/56776">Two-photon Calcium Imaging in Neuronal Dendrites in Brain Slices.</a> J. Vis. Exp. (2018).
This video demonstrates a protocol for whole-cell patch-clamp recording and two-photon calcium imaging in brain hippocampal slices. This method allows to study the dynamics of local Ca2+ transients (CaTs) in dendrites of different neuronal types in acute brain slices.

Estabelecendo uma configuração de célula inteira para imagens de cálcio de dois fótons de fatias cerebrais

All procedures involving animal samples have been reviewed and approved by the appropriate animal ethical review.
1. Preliminary Preparation (Optional: ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

Neurophysiology

Imaging and Optical Techniques

Measuring Neural Activity in a Mouse Brain Slice after Prolonged Incubation

Source: Cameron, M. A., et al., <a href="https://app.jove.com/v/55396">Prolonged Incubation of Acute Neuronal Tissue for Electrophysiology and Calcium-imaging.</a> J. Vis. Exp. (120), (2017)
This video demonstrates a technique for measuring neuronal activity in mouse brain slices using calcium imaging and electrophysiological recordings. By perfusing the tissue with potassium ions and recording intracellular calcium changes through high-speed digital imaging, this method reveals real-time neuronal responses.

Medindo a atividade neural em uma fatia de cérebro de camundongo após incubação prolongada

All procedures involving animal samples have been reviewed and approved by the appropriate animal ethical review committee.
1. Calcium Dye Loading

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A Technique for the Prolonged Incubation of Neuronal Tissue of the Retina

Source: Cameron, M. A., et al. <a href="https://app.jove.com/v/55396">Prolonged Incubation of Acute Neuronal Tissue for Electrophysiology and Calcium-imaging.</a> J. Vis. Exp. (2017).
This video demonstrates a method for prolonged incubation of neuronal tissue of the retina. Eyecups containing retina are obtained from a mouse eye; the inner limiting membrane (ILM) is enzymatically digested to expose the neuronal cells of the retina, and either the treated eyecup or the isolated retina is transferred to a specialized incubator for prolonged incubation at a low temperature.

Uma técnica para a incubação prolongada do tecido neuronal da retina

All procedures involving sample collection have been performed in accordance with the institute&#39;s IRB guidelines.
1. Retinal Wholemount Preparation ...

A incubação prolongada de aguda Neuronal Tissue de Eletrofisiologia e cálcio-imaging

Resumo

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Capítulos neste vídeo

Alterações de monitoramento da concentração de cálcio intracelular e eficácia sináptica no Molusco