Este trabalho foi financiado pelo National Cancer Institute (NCI) Subvenções U54CA143798 e U54CA143907 para estabelecer Centros de Ciência Física-Oncologia (PS-OCs) no Dana-Farber Cancer Institute e University of Southern California, respectivamente. SM Mumenthaler recebeu um prêmio PS-OC transnetwork que apoiou alguns desses trabalhos. Gostaríamos de expressar nossa mais profunda gratidão aos nossos apoiantes filantrópicos, particularmente a família Stephenson, Emmet, Toni e Tessa, por sua doação da plataforma Operetta HCS. Também gostaríamos de agradecer a J. Foo para orientação e os membros da equipe do Centro de Medicina Molecular: D. Agus para orientação clínica e orientação, K. Patsch para discussões significativas com projeto experimental, R. Rawat para ajuda em protocolos de análise de imagem , J. Katz para assistência técnica com a Operetta, e P. Macklin e D. Ruderman para discussões e comentários úteis.

1. Cultura celular NOTA: Aqui as respostas fenotípicas das células NSCLC (H3255) ao agente de segmentação EGFR, o erlotinib, quando co-cultivado com fibroblastos pulmonares (CCD-19Lu GFP), foram investigados. Para o mesmo conjunto de dados, foi realizada a classificação baseada em fluorescência e baseada em morfologia das duas populações de células (H3255 e CCD-19Lu GFP) para exemplificar sua concordância. No entanto, apenas um método de classificação precisa ser usado e deve ser escolhido com base no aplicativo. <ol><li> Preparar 500 mL de RPMI-1640 suplementado com 10% de FBS inactivado pelo calor e 1% de penicilina / estreptomicina. NOTA: O meio de crescimento e os suplementos podem ser substituídos conforme necessário para outros tipos de células. </li><li> Células de cultura em placas de 10 cm3 como populações puras em 5% de CO 2 a 37 ° C e passam a proporção apropriada a cada 3-4 dias. </li></ol> 2. Preparação de células <ol><li> Para preparar uma suspensão celular, remova cEll media e células de lavagem com 5 mL de salina tamponada com fosfato 1X (PBS). </li><li> Aspirar o PBS, adicionar 1 mL de tripsina a 0,05% aquecida a 37 ° C e incubar durante 5 minutos (ou até que as células não sejam mais aderidas à placa) a 37 ° C. </li><li> Para neutralizar a tripsina, adicione 4 mL de RPMI às placas H3255 e CCD-19Lu GFP e pipeteie as soluções celulares em tubos cônicos de 15 mL. </li><li> Centrifugação de células a 150 xg durante 5 minutos à TA. </li><li> Aspirar o sobrenadante e ressuspender os grânulos celulares em 10 mL de meio RPMI em tubos cônicos para se preparar para a semeadura. </li></ol> 3. Revestimento de células <ol><li> Contar as células para padronizar a semeadura. <ol><li> Inverta os tubos para misturar as células em solução. Pipetar 10 μL de cada suspensão de células em um tubo de microcentrífuga e adicionar 10 μL de azul de tripano. </li><li> Pipetar 10 μL desta solução em um slide de contagem de células e inserir no contador de células automatizado. NOTA: Outros métodos de contagem de células ( ie. Hemocitómetro) podem ser utilizados. </li><li> Repita a contagem de células pelo menos três vezes, ou até que as contagens obtidas sejam consistentes. </li></ol></li><li> Células de sementes em uma placa de vários poços NOTA: O número de placas para semente depende do número de pontos de tempo que serão fotografados. Alternativamente, uma placa pode ser re-imaginada ao longo do tempo se as células forem transduzidas com histona-2B-GFP (ou outras manchas nucleares lentivirais estáveis ​​que proporcionem uma segmentação nuclear adequada). <ol><li> Semente um total de 1.500 células / poço em 100 μL de RPMI. Prepare três suspensões de células para plaquear três populações de células: H3255, CCD-19Lu GFP e 50% de H3255 + 50% CCD-19Lu GFP. Execute cada um em triplicado com configurações de placas idênticas para cada ponto de tempo. NOTA: As densidades iniciais de semeadura devem ser otimizadas para cada linha celular e tamanho da placa. </li><li> Células de semente em placas de 3 x 96 poços usando uma pipeta multicanal. Incubar células O / N a 37 ° C, 5% de CO 2 . </li></ol> &lt;/ Li&gt; </ol> 4. Dosagem de drogas <ol><li> Adicionar DMSO ao pó de erlotinib para fazer uma solução-mãe de erlotinib final de concentração de 10 mM. NOTA: O medicamento pode ser substituído conforme desejado. </li><li> Diluir o fármaco com meio de cultura de células para 2x a concentração final com a concentração final mais alta a 10 μM e diluir em série quatro vezes a uma proporção de 1:10, para um total de cinco concentrações de fármaco e nenhum controle de drogas. NOTA: se a concentração de DMSO for igual ou superior a 0,1% v / v com a maior dose de fármaco, o controle de drogas não deve conter quantidade equivalente de DMSO para garantir que os efeitos observados observados não sejam devidos a toxicidade de DMSO. </li><li> Pipetar 100 μL de solução de fármaco no poço apropriado para uma concentração final de fármaco de 1x diluída em meio. </li></ol> 5. Aquisição de imagens NOTA: As imagens foram adquiridas nos dias 0, 2 e 3. Dependendo dos tipos de células e dos processos celulares em estudo, oOs pontos de tempo desejados podem ser estudados. <ol><li> Mancha células para se preparar para imagens. <ol><li> Elimine a solução de corante nas seguintes concentrações finais. <ol><li> Para a classificação baseada em fluorescência, prepare mancha nuclear de 5 μg / mL e mancha de células mortas 5 μM em PBS (ver Tabela de Materiais ). </li><li> Para a classificação baseada em morfologia, prepare mancha nuclear de 5 μg / mL, mancha de células mortas 5 μM e mancha celular de 5 μM em PBS (ver Tabela de Materiais ). </li></ol></li><li> Adicione 20 μL de solução de corante a cada poço. Incubar durante 30 min a 37 ° C protegido da luz. </li></ol></li><li> Otimize e adquira imagens. <ol><li> Retire a placa do poço da incubadora, limpe a parte inferior da placa com 70% de EtOH e coloque a placa na câmara de imagem. </li><li> Na guia &quot;Configuração&quot;, clique no botão &#39;+&#39; em &#39;Seleção de Canal&#39; para adicionar os canais apropriados paraImagem (por exemplo, luminosos, manchas nucleares, manchas de células mortas, GFP e RFP). </li><li> Clique em &quot;Seleção de layout&quot; e pegue imagens de teste empilhadas em z a cada 2 μm começando a 0 μm e terminando em 20 μm para identificar o plano de foco. Insira esta distância para cada canal em &#39;Altura&#39;. </li><li> Clique em &quot;Instantâneo&quot; em cada canal para avaliar as intensidades e otimizar os tempos de exposição. Insira os valores mais altos ou mais baixos em &quot;Tempo&quot; conforme necessário. </li><li> No lado direito da tela, destaque os poços apropriados (para serem imaginados) no esquema da placa. No esquema de poços abaixo, destaque os vinte e cinco campos a serem imaginados de forma semelhante. </li><li> Em &#39;Executar Experimento&#39;, identifique a placa em &#39;Nome da placa&#39; na aba esquerda e clique no botão &#39;Iniciar&#39; (embaixo) para executar o protocolo de aquisição de imagem com um objetivo 10X para gerar imagens TIFF em escala de cinza nos canais acima mencionados. NOTA: instância passo a passoAs regras para o protocolo de imagem podem diferir entre os instrumentos, mas os valores dos parâmetros ainda devem ser otimizados. </li><li> Repita a imagem nos dias dois e três. </li></ol></li></ol> 6. Análise de imagem NOTA: Toda análise de imagem foi realizada usando software proprietário. No entanto, uma vez que esta não é uma análise pública, análises comparáveis ​​também foram projetadas no CellProfiler 2.2 e no CellProfiler Analyst 2.0, com um breve protocolo listado abaixo e um protocolo detalhado fornecido como material suplementar (as imagens de teste já são carregadas em condutas para testar o fluxo de trabalho). As imagens desta experiência foram agrupadas em uma base por poço para que cada poço pudesse ser carregado individualmente. As tubulações CellProfiler abaixo contêm uma expressão regular que analisa as informações de metadados de cada nome de arquivo de imagem e permite que as imagens sejam agrupadas por canal. <ol><li> Baixe e instale o software de código aberto: &#39;CellProfiler9; E &#39;CellProfiler Analyst&#39;. Aceite todas as opções e complementos padrão durante a instalação. </li><li> Classifique as culturas heterocelulares em subpopulações. <ol><li> Abra o software &#39;CellProfiler&#39;, clique em &#39;Arquivo&#39; | &#39;Oleoduto de importação&#39; | &#39;De arquivo&#39; e selecione o arquivo apropriado (&quot;Fluorescence_Classification.cppipe&quot; para classificação baseada em fluorescência ou &quot;Morphology_Classification.cppipe&quot; para classificação baseada em morfologia). NOTA: Estes arquivos contêm protocolos para o processamento básico de imagem e segmentação de núcleos / células. Devido à mancha Hoechst desigual presente sobre essas células, os núcleos foram segmentados e ampliados e, em seguida, usados ​​para mascarar a imagem para permitir a segmentação de núcleos com intensidades mais baixas. <ol><li> Selecione a tubagem de classificação baseada em fluorescência para classificar células como H3255 ou CCD-19Lu com base na intensidade de eGFP e para calcular os recursos de morfologia. NOTA: CCDAs células de 19Lu foram transduzidas com GFP. </li><li> Selecione a tubulação de classificação baseada em morfologia para segmentar núcleos e células, e para calcular características de morfologia. NOTA: É necessária mais análise a jusante em &#39;CellProfiler Analyst&#39; para classificação. As células mortas são classificadas através da classificação baseada em fluorescência. </li></ol></li><li> Clique em &#39;Exibir configurações de saída&#39; no canto inferior esquerdo da tela. Selecione a localização dos arquivos de imagem para análise (&#39;Pasta de Entrada Padrão&#39;) e o destino para os dados extraídos (&#39;Pasta de Saída Padrão&#39;). </li><li> Clique em &#39;Analisar imagens&#39; para começar a análise. Quando a análise estiver completa, clique em &quot;OK&quot; e vá para a &quot;Pasta de saída padrão&quot; para ver os dados calculados. NOTA: Exemplo de valores de parâmetros e imagens estão disponíveis em Supplemental File 1-CellProfilerProtocol.pdf . </li><li> Para a classificação baseada em morfologia (somente), faça o seguinte. <ol><li> Abra o software &#39;CellProfiler Analyst&#39;, selecione o arquivo de propriedades do banco de dados gerado no CellProfiler e clique em &#39;Abrir&#39;. </li><li> Clique na guia &quot;Classificador&quot; na parte superior esquerda da tela. Para chamar imagens de células aleatórias da experiência, clique em &#39;Fetch&#39;; As imagens aparecerão na janela não classificada. </li></ol></li><li> Classifique manualmente as células como positivas (H3255) ou negativas (CCD-19Lu) selecionando e arrastando as células para o compartimento apropriado (consulte o Arquivo Suplementar 2-Pipeline.pdf : Figura B ). Depois de classificar pelo menos 50 células por subpopulação, clique em &#39;Train Classifier&#39; e, em seguida, clique em &#39;Verificar progresso&#39;. NOTA: As células são classificadas através de um algoritmo de aprendizagem de máquina de floresta aleatória supervisionado pelo usuário 12 . Se a precisão não for superior ao limite aprovado (&gt; 90%), talvez seja necessário voltar e otimizar a segmentação celular em &#39;CellProfiler&#39;, ou as células podem não ser ideais para classiFingindo pela morfologia. </li><li> Clique em &#39;Pontuação Todos&#39; para gerar uma tabela com contagem de células para cada subpopulação. </li></ol></li></ol>

<ol>
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Os autores não têm nada a divulgar.

The protocol described above improves upon current cell biology assays by providing more comprehensive insights into phenotypic dynamics of multiple cell types in response to environmental perturbations while using reduced reagents and time. A major advantage of this experimental design is the ability to analyze multiple phenotypes with a single setup and generate quantitative data characterizing these phenotypes on a single cell level. One technical advantage to this platform is the ease of initial troubleshooting compared to other assays. Because this method is image-based, one is able to visualize the wells for apparent over/under seeding. It is advisable to have cells in the exponential growth phase for the duration of the experiment and not be limited by nutrient or spatial constraints or confounded by senescence due to scarce seeding. Otherwise, birth and death rates may not be reproducible between experiments. For reference, CellPD is a publicly available program for computation of birth and death rates14. Additionally, one can visualize whether adequate concentrations of dyes were added to each well. Pipetting issues in an individual well could result in missegmentation and skewed data, but can easily be detected with the aforementioned protocol.
Unfortunately, not all cell types may be amenable to this application. It is important to be able to accurately segment the nuclei and cells, therefore analysis of cells that organize in more sphere-like or clumped structures may not be suitable. For some cells, it also may be advantageous to use a cell strainer prior to seeding to ensure initial seeding of single cells. In addition, the linear classifier technique is only applicable to cell types that can be readily distinguished based on morphology features. 
For the success of the protocol, it is important to first optimize the imaging conditions, as the validity of downstream analyses is dependent on the quality of the images. While here we performed experiments using a high-content screening platform, image acquisition can also be performed using any fluorescent microscope (although an automated imaging platform is ideal for high-throughput approaches). Test images should be taken prior to each imaging time point to ensure that there are no problems with the microscope or protocol. The signal to noise ratio should be high, especially for the channels that will be used for segmentation (i.e. nuclei, cell stains). Additionally, it is important to image in the optimal plane of focus. If the images are out of focus, segmentation becomes much more difficult and the calculated morphological features will likely be inaccurate. Illumination differences between fields can cause problems with image segmentation as well. Large differences in brightness make the automated selection of threshold values difficult. Additionally, if there are heterogeneous fluorescence intensities between cells, a single threshold value may not sufficiently segment all the cells in an image. In this analysis, these problems were overcome by creating masks around brighter and dimmer cell populations and segmenting each population separately. 
While the phenotypes under investigation in this protocol are limited to live, dead, and morphological characterization, they can easily be expanded to investigate other features. For example, functional genetic studies can be added with RNAi, overexpression, or other chemical perturbations. 
In this paper, the capabilities of the protocol to measure the response of non-small cell lung cancer cells to erlotinib in the presence and absence of CAFs was demonstrated. However, this is merely one example of the many cell types and microenvironmental parameters that can be tested. We have extended this protocol to be used with other cell types and drug studies, including primary cells isolated from patient tumors13,15.

Os ensaios baseados em células foram um campo de trabalho nas pesquisas básicas e nas configurações de desenvolvimento de medicamentos. No entanto, as limitações desses ensaios padrão tornaram-se cada vez mais evidentes com a discordância entre dados clínicos e in vitro e a falha na maioria dos medicamentos para receber aprovação da FDA. Aqui, apresentamos um novo método para a utilização de imagem quantitativa para análise simultânea de fenótipos heterocelulares em resposta a estímulos ambientais relevantes que ocorrem. Os ensaios tradicionais baseados em células que são utilizados para medir a viabilidade celular incluem: ensaios de exclusão de azul de tripano, MTT / MTS e coloração de citometria de fluxo de anexina V-FITC. Os ensaios de exclusão de Trypan Blue, embora simples e baratos, requerem um grande número de células, são demoradas, e muitas vezes são influenciadas pela polarização do usuário 1 . Os ensaios MTT e MTS medem indiretamente a viabilidade celular através de medidas da taxa metabólica mitocondrial. No entanto, a atividade metabólicaAs células de células podem ser afetadas por diferentes condições de cultura (como a mídia ou a concentração de oxigênio), o que leva a resultados imprecisos e evita a padronização em tipos de células e condições 2 , 3 . Outra grande desvantagem dessas técnicas é a incapacidade de distinguir entre múltiplos tipos de células - a maioria dos sistemas biológicos são heterocelulares. Embora os métodos de citometria de fluxo tenham a capacidade de distinguir entre múltiplas populações de células, os rótulos das células são necessários, a amostragem dinâmica é desafiadora e, ao usar células aderentes, esta aplicação torna-se demorada e propensa a erros. Outros fenótipos celulares importantes, incluindo mudanças morfológicas, ocorrem em resposta a estímulos ambientais, mas não são capturados por ensaios tradicionais baseados em células. O perfil dos estados celulares através da caracterização morfológica e das semelhanças de mapeamento em amostras é uma ferramenta poderosa e imparcial com aA fim de fornecer novos conhecimentos em muitos aspectos da pesquisa básica e translacional, incluindo biologia celular básica e descoberta de drogas 4 . Além disso, a morfologia das células tumorais mostrou-se correlacionada com subtipos de tumor 5 e agressividade 6 . Por isso, é de grande interesse estudar essas características celulares e como elas se relacionam com perturbações ambientais específicas. Além disso, pode-se usar diferenças nas características morfológicas para discriminar entre subpopulações em sistemas de co-cultura. A rotulação fluorescente de células tem queda ( isto é, alterando as propriedades das células inerentes, demorado) e, portanto, métodos adicionais para classificar os tipos de células são vantajosos. A imagem baseada em microscopia é um método alternativo para o perfil de fenótipos celulares de forma multiplexada, quantitativa e robusta. Neste manuscrito, aplicamos nosso pipeline de imagens quantitativas para destacar a evoluçãoDinâmica nítida de populações de células heterogêneas dentro de um tumor. Concentramo-nos na interação entre as células do câncer de pulmão não celular pequeno (NSCLC) e os Fibroblastos associados ao câncer (CAFs), o tipo de célula estromal mais prevalente encontrado nos tumores. CAFs foram implicados na iniciação, progressão e resposta terapêutica do tumor; Portanto, realizar ensaios fenotípicos em células tumorais na ausência de CAFs pode ser enganador 7 , 8 , 9 . Especificamente, avaliamos os efeitos de CAFs em células tumorais em resposta a erlotinib, uma molécula pequena visando o receptor do fator de crescimento epidérmico (EGFR), que é freqüentemente usado no tratamento clínico de NSCLC. Utilizamos uma plataforma de rastreio de alto conteúdo e o software de análise de imagem que o acompanha para avaliação; No entanto, na tentativa de tornar esta metodologia acessível a outros pesquisadores, também desenvolvemos um protocolo downstream comparável usando o software open-source:CellProfiler 10 e CellProfiler Analyst 11 . A maioria dos ensaios de rastreio de alto conteúdo baseados em imagens são analisados ​​com software comercializado específico para um determinado modelo de instrumento. Os resultados são difíceis de replicar em outros laboratórios com diferentes softwares porque os algoritmos subjacentes são muitas vezes proprietários. Utilizando esta tubulação baseada em imagem, foram medidas a proliferação celular, a morte e a morfologia de cada subpopulação de uma cultura heterocelular em resposta ao tratamento medicamentoso utilizando a classificação baseada em fluorescência e morfologia. O protocolo a seguir fornece uma metodologia robusta para testar processos celulares complexos.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="677">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:240px;">RPMI-1640</td>
			<td style="width:127px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">10-040-CV</td>
			<td style="width:191px;">cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:240px;">FBS</td>
			<td style="width:127px;">Gemini</td>
			<td style="width:119px;">100-106</td>
			<td>medium supplement</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:240px;">Penicillin/streptomycin</td>
			<td style="width:127px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">15-140-122</td>
			<td>medium supplement</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:240px;">TC20</td>
			<td style="width:127px;">Biorad</td>
			<td style="width:119px;">1450102</td>
			<td>cell counter</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:240px;">TC20 slides with trypan blue</td>
			<td style="width:127px;">Biorad</td>
			<td style="width:119px;">1450003</td>
			<td>cell counter slides</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:240px;">96-well plates</td>
			<td style="width:127px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">3904</td>
			<td>clear bottom black plates</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:240px;">Erlotinib</td>
			<td style="width:127px;">LC Laboratories</td>
			<td style="width:119px;">E-4007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:240px;">DMSO</td>
			<td style="width:127px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">317275-100ML</td>
			<td>solution to resuspend drug</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:240px;">Hoechst</td>
			<td style="width:127px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">H21491</td>
			<td>nuclear dye</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:240px;">Propidium Iodide</td>
			<td style="width:127px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">P1304MP</td>
			<td>dead cell stain</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:240px;">Cell Tracker Orange CMRA</td>
			<td style="width:127px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">C34551</td>
			<td>whole cell stain</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:240px;">Operetta high content imaging system</td>
			<td style="width:127px;">Perkin Elmer</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:240px;">CellProfiler</td>
			<td style="width:127px;">Broad Institue</td>
			<td style="width:119px;">version 2.2.0 (rev 9969f42)</td>
			<td>http://cellprofiler.org/releases/</td>
		</tr>
		<tr height="86">
			<td height="86" style="height:86px;width:240px;">Cell culture incubator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:191px;">Any cell culture incubator will be suitable - cells were cultured under 37 &#186;C at 5% CO2.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:240px;">15 mL Falcon conical tubes</td>
			<td style="width:127px;">Falcon</td>
			<td style="width:119px;">14-959-53A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:240px;">10 cm2 cell culture plates</td>
			<td style="width:127px;">TPP</td>
			<td>93040</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

discrimination and characterization of heterocellular populations using quantitative imaging techniques

Os processos celulares são complexos e resultam da interação entre vários tipos de células e seu ambiente. As técnicas existentes de biologia celular muitas vezes não permitem uma interpretação precisa dessa interação. Usando uma abordagem quantitativa baseada em imagens, apresentamos um protocolo de alto conteúdo para caracterizar as respostas fenotípicas dinâmicas ( ou seja , mudanças de morfologia, proliferação, apoptose) de populações de células heterogêneas para mudanças nos estímulos ambientais. Destacamos nossa capacidade de distinguir entre tipos de células baseados em intensidade de fluorescência ou características de morfologia inerentes dependendo da aplicação. Esta plataforma permite uma caracterização mais abrangente da resposta da subpopulação a perturbações ao tempo mais curto, quantidades menores de reagentes e menor probabilidade de erro do que os ensaios tradicionais de biologia celular. No entanto, em alguns casos, as populações de células podem ser difíceis de identificar e quantificar com base em células complexasCaracterísticas importantes e exigirá resolução de problemas adicionais; Destacamos algumas dessas circunstâncias no protocolo. Demonstramos esta aplicação usando a resposta ao fármaco em um modelo de câncer; No entanto, pode ser facilmente aplicado de forma mais ampla a outros processos fisiológicos. Este protocolo permite identificar subpopulações dentro de um sistema de co-cultura e caracterizar a resposta particular de cada estímulo externo.

Nós geramos um conjunto de imagens consistindo de 25 campos / poço, 54 poços / placa (3 populações de células x 6 concentrações de drogas x 3 repetições), em três placas para um total de 4.050 imagens individuais. Os conjuntos de imagens geradas ao longo do experimento foram analisados ​​usando softwares proprietários (ver tabela de materiais) para extrair várias propriedades quantitativas das células ( ou seja , morfologia, fluorescência) que poderiam então ser usadas para classificar as subpopulações celulares. No entanto, como o software comercial utilizado tem acesso limitado, foram criadas as encanamentos downstream comparáveis ​​no CellProfiler e CellProfiler Analyst. Classificação Heterocelular em Subpopulações Os núcleos foram identificados e segmentados com base na mancha do DNA (aqui Hoechst) e populações de células foram classificadas quer com base na fluorescência ou moRphology ( Figura 1 ). Para a classificação baseada em fluorescência, os fibroblastos (CCD-19Lu) foram previamente transduzidos com GFP-lentivírus. Os níveis de intensidade GFP foram medidos para cada núcleo e aqueles que foram calculados acima do limite aceito (com base no sinal de fundo) foram classificados como CCD-19Lu, enquanto aqueles abaixo foram identificados como células tumorais (H3255). Para a classificação baseada em morfologia, as células foram previamente coradas com uma mancha celular não tóxica (veja a tabela de materiais) e isso foi usado para identificar e segmentar o citoplasma. Um algoritmo de aprendizado de máquina foi treinado com ~ 50-100 células de cada população. As características morfológicas foram identificadas que eram significativamente diferentes entre as populações, que foram então usadas para projetar um classificador linear para distinguir as células CCD-19Lu e H3255. Os protocolos de classificação de fluorescência e morfologia foram 97,4% (n = 1403) concordantes na distinção entre a população de duas célulasEm condições não tratadas e 92,5% (n = 916) concordantes em condições tratadas com fármaco (eretinib 1 μM) ( Figura 2 ). Análises fenotípicas de subpopulações Além de discriminar entre os tipos de células, buscamos caracterizar as propriedades fenotípicas de cada subpopulação. Os ensaios de multiplexagem economizam tempo e reagentes, aumentam a consistência e fornecem informações adicionais sobre o sistema em estudo. Existem muitas saídas fenotípicas potenciais e deve-se escolhê-las com base nas questões de interesse. Aqui, foram investigadas mudanças na morfologia celular e no status de viabilidade em resposta ao tratamento com erlotinib. Após três dias de tratamento medicamentoso, observou-se uma diminuição da área nuclear e um aumento na área celular das células H3255 ( Figura 3A ). A diferença média na área nuclear entreAs populações tratadas &quot;sem drogas&quot; e &quot;fármaco&quot; foram estatisticamente significativas através de um teste t de dois lados tipo-2 (variação igual) ( p = 7,92 x 10 -16 ). Nós levantamos a hipótese de que esta observação é uma resposta celular ao estresse imposto pelo tratamento medicamentoso. Também é interessante estudar se um medicamento tem um efeito citotóxico ( ou seja, aumento do número de células mortas ao longo do tempo) ou citostático ( ou seja, diminuição do número de partos celulares ao longo do tempo) em células, pois isso tem um impacto clínico profundo. Por exemplo, um efeito citostático do medicamento induz a prisão de crescimento ainda não elimina as células do tumor, portanto existe o potencial de células cancerosas para reiniciar a proliferação celular uma vez que o medicamento é removido. Os efeitos de drogas muitas vezes podem ser o contexto, a concentração e o tipo de célula dependente. Anteriormente observamos erlotinib provocando uma resposta citotóxica em um tipo de célula, enquanto mostrava acResposta ytostatica em outros 13 . Os ensaios de viabilidade tradicionais produzem o número relativo de células e, portanto, não discriminam as prisões de crescimento e a morte celular. Aqui, células mortas foram identificadas com base na mancha de iodeto de propídio ( Figura 3B ). Foram observados efeitos citotóxicos e citostáticos de erlotinib em células H3255, com aumento do número de óbitos e diminuição do número de nascimentos após o tratamento com drogas ( Figura 3C ). Vale ressaltar que o número de células mortas cai após o dia 1 provavelmente devido à depuração celular. As células CCD-19Lu não foram afetadas pelo fármaco. Uma vantagem adicional desta plataforma é a geração de dados quantitativos. Por exemplo, em nossa experiência de co-cultura, uma subpopulação inicial de 1.118 (75,8%) células H3255 foi de 2.817 (87,9%) ou 396 (57,2%) após três dias sem ou com erlotinaTratamento ib, respectivamente ( Figura 4 ). Como podemos gerar contagens de células reais em vez de porcentagem relativa (como com os métodos de citometria de fluxo), concluímos que a alteração na composição durante o tratamento de drogas é devido a uma diminuição das células H3255 e não ao aumento do CCD-19Lu. Não vale a pena nada que as taxas de mortalidade possam ser subestimadas devido à depuração celular, que é difícil de avaliar experimentalmente e provavelmente difere através dos tipos de células. <img alt="figura 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55844/55844fig1.jpg" /> Figura 1: Visão geral do Protocolo de Análise de Imagem. Duas potenciales pipelines de análise de imagem a jusante para classificar populações heterocelulares usando classificação baseada em morfologia ou classificação baseada em fluorescência. Barras de escala = 100 μm. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55844/55844fig1large.jpg" target="_blank">Clique na ela</a>E para ver uma versão maior dessa figura. <img alt="Figura 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55844/55844fig2.jpg" /> Figura 2: Concordância entre Morfologia e Classificação Baseada em Fluorescência. ( A ) Gráfico de Concordância exibindo a sobreposição dos dois protocolos de classificação. As mesmas células foram classificadas como H3255 usando a classificação baseada em morfologia e fluorescência. Os dois protocolos estavam de acordo, com classificação de 97,4% (n = 1403) de células não tratadas e 92,5% (n = 916) de células tratadas com erlotinib (Nota: a área branca é muito pequena para visualizar). ( B ) imagens 10X que descrevem exemplos de boa e fraca concordância entre a classificação baseada em fluorescência e baseada em morfologia. As setas brancas apontam células que foram classificadas de forma inconsistente entre as plataformas. Imagem de entrada: azul - núcleo (Hoechst); Verde - CCD19Lu (GFP). ClassiImagens de ficação: Vermelho - H3255; Verde - CCD-19Lu. Barra de escala = 100 μm. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55844/55844fig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior dessa figura.</a> <img alt="Figura 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55844/55844fig3.jpg" /> Figura 3: Medições fenotípicas multiplexadas de uma configuração experimental única. ( A ) As características morfológicas, como os núcleos e a área celular, foram calculadas no nível celular único na presença e ausência de fármaco. Nota: As áreas celulares que medem menos de 100 μm 2 foram consideradas detritos e excluídas das análises. O gráfico de caixa representa a mediana com faixas de primeiro e terceiro quartil e barras de erro de intervalo de confiança de 95%. ( B ) As células H3255 (azul) e CCD-19Lu (verde) foram co-cultivadas e as células mortas foram identificadas com base na intensidade do propídioMancha iodida (vermelha) e imagem usando um objetivo 10X. Barra de escala = 1 mm (painel superior); 100 μm (imagens do fundo). ( C ) O número total de células vivas e mortas foi calculado durante três dias com ou sem tratamento medicamentoso, com uma diminuição óbvia no número de células vivas e aumento das células mortas com a adição de erlotinib. As barras de erro representam o erro padrão da média com base em três repetições. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55844/55844fig3large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior dessa figura.</a> <img alt="Figura 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55844/55844fig4.jpg" /> Figura 4: Dinâmica de subpopulação ao longo do tempo. Imagens representativas 10X de poços contendo H3255 (azul) e CCD-19Lu (verde) no dia 0 ou dia 3 com e sem medicamento. As células pertencentes a cada subpopulação foram contadas e os gráficos de torta proporcionais mostram aMudança cíclica na composição da população em amostras. Barras de escala = 1 mm (painéis do meio, shpwn in; eftmost panel), 1 mm (imagem superior), 100 μm (imagens de baixo). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55844/55844fig4large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior dessa figura.</a>

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Discrimination and Characterization of Heterocellular Populations Using Quantitative Imaging Techniques

Desenvolvemos um novo protocolo para estudar a dinâmica da população heterocelular em resposta a perturbações. Este manuscrito descreve uma plataforma baseada em imagens que produz conjuntos de dados quantitativos para a caracterização simultânea de múltiplos fenótipos celulares de populações heterocelulares de maneira robusta.

Discriminação e Caracterização de Populações Heterocelulares Usando Técnicas de Imagem Quantitativa

Cellular processes are complex and result from the interplay between multiple cell types and their environment. Existing cell biology techniques often do ...

discrimination-characterization-heterocellular-populations-using

Research

JoVE Journal

Biology

7.4K visualizações.  University of Southern California (USC).  Desenvolvemos um novo protocolo para estudar a dinâmica da população heterocelular em resposta a perturbações. Este manuscrito descreve uma plataforma baseada em imagens que produz conjuntos de dados quantitativos para a caracterização simultânea de múltiplos fenótipos celulares de populações heterocelulares de maneira robusta. 

Vídeo: Discrimination and Characterization of Heterocellular Populations Using Quantitative Imaging Techniques

Live-cell Imaging and Quantitative Analysis of Embryonic Epithelial Cells in Xenopus laevis

Embryonic epithelial cells serve as an ideal model to study morphogenesis where multi-cellular tissues undergo changes in their geometry, such as changes in cell surface area and cell height, and where cells undergo mitosis and migrate. Furthermore, epithelial cells can also regulate morphogenetic movements in adjacent tissues1. A traditional method to study epithelial cells and tissues involve chemical fixation and histological methods to determine cell morphology or localization of particular proteins of interest. These approaches continue to be useful and provide "snapshots" of cell shapes and tissue architecture, however, much remains to be understood about how cells acquire specific shapes, how various proteins move or localize to specific positions, and what paths cells follow toward their final differentiated fate. High resolution live imaging complements traditional methods and also allows more direct investigation into the dynamic cellular processes involved in the formation, maintenance, and morphogenesis of multicellular epithelial sheets. Here we demonstrate experimental methods from the isolation of animal cap tissues from Xenopus laevis embryos to confocal imaging of epithelial cells and simple measurement approaches that together can augment molecular and cellular studies of epithelial morphogenesis.

Live-cell Imaging and Quantitative Analysis of Embryonic Epithelial Cells in Xenopus laevis

Xenopus embryonic epithelia are an ideal model system to study cell behaviors such as polarity development and shape change during epithelial morphogenesis. Traditional histology of fixed samples is increasingly being complemented by live-cell confocal imaging. Here we demonstrate methods to isolate frog tissues and visualize live epithelial cells and their cytoskeleton using live-cell confocal microscopy.

Em células vivas, Imagem e Análise Quantitativa de células embrionárias epiteliais em Xenopus laevis</em

Embryonic epithelial cells serve as an ideal model to study morphogenesis where multi-cellular tissues undergo changes in their geometry, such as changes ...

Biologia

Techniques for Imaging Ca2+ Signaling in Human Sperm

Fluorescence microscopy of cells loaded with fluorescent, Ca2+-sensitive dyes is used for measurement of spatial and temporal aspects of Ca2+ signaling in live cells. Here we describe the method used in our laboratories for loading suspensions of human sperm with Ca2+-reporting dyes and measuring the fluorescence signal during physiological stimulation. Motile cells are isolated by direct swim-up and incubated under capacitating conditions for 0-24 h, depending upon the experiment. The cell-permeant AM (acetoxy methyl ester) ester form of the Ca2+-reporting dye is then added to a cell aliquot and a period of 1 h is allowed for loading of the dye into the cytoplasm. We use visible wavelength dyes to minimize photo-damage to the cells, but this means that ratiometric recording is not possible. Advantages and disadvantages of this approach are discussed. During the loading period cells are introduced into an imaging chamber and allowed to adhere to a poly-D-lysine coated coverslip. At the end of the loading period excess dye and loose cells are removed by connection of the chamber to the perfusion apparatus. The chamber is perfused continuously, stimuli and modified salines are then added to the perfusion header. Experiments are recorded by time-lapse acquisition of fluorescence images and analyzed in detail offline, by manually drawing regions of interest. Data are normalized to pre-stimulus levels such that, for each cell (or part of a cell), a graph showing the Ca2+ response as % change in fluorescence is obtained.

Techniques for Imaging Ca2+ Signaling in Human Sperm

Stimulus-evoked [Ca2+]i signals of individual human sperm are assessed. Motile cells are loaded with Ca2+-sensitive fluorescent dye (AM-ester method) and immobilised in a perfusable chamber. Cells are imaged by time-lapse fluorescence microscopy and stimulated via the perfusing medium. Responses of single cells (or regions) are analysed offline using Excel.

Técnicas de imagem Ca 2 + Sinalização no esperma humano

Fluorescence microscopy of cells loaded with fluorescent, Ca2+-sensitive dyes is used for measurement of spatial and temporal aspects of Ca2+ signaling in ...

Identification and Characterization of Protein Glycosylation using Specific Endo- and Exoglycosidases

Glycosylation, the addition of covalently linked sugars, is a major post-translational modification of proteins that can significantly affect processes such as cell adhesion, molecular trafficking, clearance, and signal transduction1-4. In eukaryotes, the most common glycosylation modifications in the secretory pathway are additions at consensus asparagine residues (N-linked); or at serine or threonine residues (O-linked) (Figure 1). Initiation of N-glycan synthesis is highly conserved in eukaryotes, while the end products can vary greatly among different species, tissues, or proteins. Some glycans remain unmodified ("high mannose N-glycans") or are further processed in the Golgi ("complex N-glycans"). Greater diversity is found for O-glycans, which start with a common N-Acetylgalactosamine (GalNAc) residue in animal cells but differ in lower organisms1.
The detailed analysis of the glycosylation of proteins is a field unto itself and requires extensive resources and expertise to execute properly. However a variety of available enzymes that remove sugars (glycosidases) makes possible to have a general idea of the glycosylation status of a protein in a standard laboratory setting. Here we illustrate the use of glycosidases for the analysis of a model glycoprotein: recombinant human chorionic gonadotropin beta (hCG&beta;), which carries two N-glycans and four O-glycans 5. The technique requires only simple instrumentation and typical consumables, and it can be readily adapted to the analysis of multiple glycoprotein samples.
Several enzymes can be used in parallel to study a glycoprotein. PNGase F is able to remove almost all types of N-linked glycans6,7. For O-glycans, there is no available enzyme that can cleave an intact oligosaccharide from the protein backbone. Instead, O-glycans are trimmed by exoglycosidases to a short core, which is then easily removed by O-Glycosidase. The Protein Deglycosylation Mix contains PNGase F, O-Glycosidase, Neuraminidase (sialidase), &beta;1-4 Galactosidase, and &beta;-N-Acetylglucosaminidase. It is used to simultaneously remove N-glycans and some O-glycans8 . Finally, the Deglycosylation Mix was supplemented with a mixture of other exoglycosidases (&alpha;-N-Acetylgalactosaminidase, &alpha;1-2 Fucosidase, &alpha;1-3,6 Galactosidase, and &beta;1-3 Galactosidase ), which help remove otherwise resistant monosaccharides that could be present in certain O-glycans.
SDS-PAGE/Coomasie blue is used to visualize differences in protein migration before and after glycosidase treatment. In addition, a sugar-specific staining method, ProQ Emerald-300, shows diminished signal as glycans are successively removed. This protocol is designed for the analysis of small amounts of glycoprotein (0.5 to 2 &mu;g), although enzymatic deglycosylation can be scaled up to accommodate larger quantities of protein as needed.

Using specific glycosidases to remove sugars from glycoproteins followed by SDS-PAGE is a valuable method to detect glycan modifications on protein samples and is a good choice for initial glycobiology studies. Changes following deglycosylation can be detected as shifts in gel mobility or by staining with glycan sensitive reagents.

Identificação e caracterização de glicosilação de proteínas específicas usando endo-e exoglycosidases

Glycosylation, the addition of covalently linked sugars, is a major post-translational modification of proteins that can significantly affect processes ...

Quantitative Analysis of Autophagy using Advanced 3D Fluorescence Microscopy

Prostate cancer is the leading form of malignancies among men in the U.S. While surgery carries a significant risk of impotence and incontinence, traditional chemotherapeutic approaches have been largely unsuccessful. Hormone therapy is effective at early stage, but often fails with the eventual development of hormone-refractory tumors. We have been interested in developing therapeutics targeting specific metabolic deficiency of tumor cells. We recently showed that prostate tumor cells specifically lack an enzyme (argininosuccinate synthase, or ASS) involved in the synthesis of the amino acid arginine1. This condition causes the tumor cells to become dependent on exogenous arginine, and they undergo metabolic stress when free arginine is depleted by arginine deiminase (ADI)1,10. Indeed, we have shown that human prostate cancer cells CWR22Rv1 are effectively killed by ADI with caspase-independent apoptosis and aggressive autophagy (or macroautophagy)1,2,3. Autophagy is an evolutionarily-conserved process that allows cells to metabolize unwanted proteins by lysosomal breakdown during nutritional starvation4,5. Although the essential components of this pathway are well-characterized6,7,8,9, many aspects of the molecular mechanism are still unclear - in particular, what is the role of autophagy in the death-response of prostate cancer cells after ADI treatment? In order to address this question, we required an experimental method to measure the level and extent of autophagic response in cells - and since there are no known molecular markers that can accurately track this process, we chose to develop an imaging-based approach, using quantitative 3D fluorescence microscopy11,12.
Using CWR22Rv1 cells specifically-labeled with fluorescent probes for autophagosomes and lysosomes, we show that 3D image stacks acquired with either widefield deconvolution microscopy (and later, with super-resolution, structured-illumination microscopy) can clearly capture the early stages of autophagy induction. With commercially available digital image analysis applications, we can readily obtain statistical information about autophagosome and lysosome number, size, distribution, and degree of colocalization from any imaged cell. This information allows us to precisely track the progress of autophagy in living cells and enables our continued investigation into the role of autophagy in cancer chemotherapy.

Autophagy is a ubiquitous process that enables cells to degrade and recycle proteins and organelles. We apply advanced fluorescence microscopy to visualize and quantify the small, but essential, physical changes associated with the induction of autophagy, including the formation and distribution of autophagosomes and lysosomes, and their fusion into autolysosomes.

Análise Quantitativa de Autophagy usando microscopia de fluorescência avançada 3D

Prostate cancer is the leading form of malignancies among men in the U.S. While surgery carries a significant risk of impotence and incontinence, ...

Measuring Intracellular Ca2+ Changes in Human Sperm using Four Techniques: Conventional Fluorometry, Stopped Flow Fluorometry, Flow Cytometry and Single Cell Imaging

Spermatozoa are male reproductive cells especially designed to reach, recognize and fuse with the egg. To perform these tasks, sperm cells must be prepared to face a constantly changing environment and to overcome several physical barriers. Being in essence transcriptionally and translationally silent, these motile cells rely profoundly on diverse signaling mechanisms to orient themselves and swim in a directed fashion, and to contend with challenging environmental conditions during their journey to find the egg. In particular, Ca2+-mediated signaling is pivotal for several sperm functions: activation of motility, capacitation (a complex process that prepares sperm for the acrosome reaction) and the acrosome reaction (an exocytotic event that allows sperm-egg fusion). The use of fluorescent dyes to track intracellular fluctuations of this ion is of remarkable importance due to their ease of application, sensitivity, and versatility of detection. Using one single dye-loading protocol we utilize four different fluorometric techniques to monitor sperm Ca2+ dynamics. Each technique provides distinct information that enables spatial and/or temporal resolution, generating data both at single cell and cell population levels.

Measuring Intracellular Ca2+ Changes in Human Sperm using Four Techniques: Conventional Fluorometry, Stopped Flow Fluorometry, Flow Cytometry and Single Cell Imaging

Intracellular Ca2+ dynamics are very important in sperm physiology and Ca2+-sensitive fluorescent dyes constitute a versatile tool to study them. Population experiments (fluorometry and stopped flow fluorometry) and single cell experiments (flow cytometry and single cell imaging) are used to track spatio-temporal [Ca2+] changes in human sperm cells.

Medindo intracelular de Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; Mudanças no esperma humano, utilizando quatro técnicas: fluorometria convencional, Parado Fluorometria fluxo, citometria de fluxo e única célula de imagem

Spermatozoa  are male reproductive cells especially designed to reach, recognize and fuse  with the egg. To perform these tasks, sperm cells must be ...

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for using FISH to quantify the number of mRNAs in single yeast cells. Cells can be grown in any condition of interest and then fixed and made permeable. Subsequently, multiple single-stranded deoxyoligonucleotides conjugated to fluorescent dyes are used to label and visualize mRNAs. Diffraction-limited fluorescence from single mRNA molecules is quantified using a spot-detection algorithm to identify and count the number of mRNAs per cell. While the more standard quantification methods of northern blots, RT-PCR and gene expression microarrays provide information on average mRNAs in the bulk population, FISH facilitates both the counting and localization of these mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

This protocol describes an experimental procedure for performing Fluorescence in situ Hybridization (FISH) for counting mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

Visualização e análise de moléculas de mRNA Usando Fluorescência<em&gt; In Situ</em&gt; A hibridação em<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for ...

Techniques for the Analysis of Extracellular Vesicles Using Flow Cytometry

Extracellular Vesicles (EVs) are small, membrane-derived vesicles found in bodily fluids that are highly involved in cell-cell communication and help regulate a diverse range of biological processes. Analysis of EVs using flow cytometry (FCM) has been notoriously difficult due to their small size and lack of discrete populations positive for markers of interest. Methods for EV analysis, while considerably improved over the last decade, are still a work in progress. Unfortunately, there is no one-size-fits-all protocol, and several aspects must be considered when determining the most appropriate method to use. Presented here are several different techniques for processing EVs and two protocols for analyzing EVs using either individual detection or a bead-based approach. The methods described here will assist with eliminating the antibody aggregates commonly found in commercial preparations, increasing signal&#8211;to-noise ratio, and setting gates in a rational fashion that minimizes detection of background fluorescence. The first protocol uses an individual detection method that is especially well suited for analyzing a high volume of clinical samples, while the second protocol uses a bead-based approach to capture and detect smaller EVs and exosomes.

Many different methods exist for the measurement of extracellular vesicles (EVs) using flow cytometry (FCM). Several aspects should be considered when determining the most appropriate method to use. Two protocols for measuring EVs are presented, using either individual detection or a bead-based approach.

Técnicas de Análise de vesículas extracelulares utilizando citometria de fluxo

Extracellular Vesicles (EVs) are small, membrane-derived vesicles found in bodily fluids that are highly involved in cell-cell communication and help ...

Development and Characterization of In Vitro Microvessel Network and Quantitative Measurements of Endothelial [Ca2+]i and Nitric Oxide Production

Endothelial cells (ECs) lining the blood vessel walls in vivo are constantly exposed to flow, but cultured ECs are often grown under static conditions and exhibit a pro-inflammatory phenotype. Although the development of microfluidic devices has been embraced by engineers over two decades, their biological applications remain limited. A more physiologically relevant in vitro microvessel model validated by biological applications is important to advance the field and bridge the gaps between in vivo and in vitro studies. Here, we present detailed procedures for the development of cultured microvessel network using a microfluidic device with a long-term perfusion capability. We also demonstrate its applications for quantitative measurements of agonist-induced changes in EC [Ca2+]i and nitric oxide (NO) production in real time using confocal and conventional fluorescence microscopy. The formed microvessel network with continuous perfusion showed well-developed junctions between ECs. VE-cadherin distribution was closer to that observed in intact microvessels than statically cultured EC monolayers. ATP-induced transient increases in EC [Ca2+]i and NO production were quantitatively measured at individual cell levels, which validated the functionality of the cultured microvessels. This microfluidic device allows ECs to grow under a well-controlled, physiologically relevant flow, which makes the cell culture environment closer to in vivo than that in the conventional, static 2D cultures. The microchannel network design is highly versatile, and the fabrication process is simple and repeatable. The device can be easily integrated to the confocal or conventional microscopic system enabling high resolution imaging. Most importantly, because the cultured microvessel network can be formed by primary human ECs, this approach will serve as a useful tool to investigate how pathologically altered blood components from patient samples affect human ECs and provide insight into clinical issues. It also can be developed as a platform for drug screening.

Development and Characterization of In Vitro Microvessel Network and Quantitative Measurements of Endothelial [Ca2+]i and Nitric Oxide Production

Primary human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) were grown to confluence within a microfluidic network device. The endothelial cell junction and F-actin distributions were illustrated and the changes in intracellular calcium concentration and nitric oxide production in response to adenosine triphosphate (ATP) were quantified in real-time at individual cell levels.

Desenvolvimento e Caracterização de<em&gt; In Vitro</em&gt; Rede de microvasos e medições quantitativas de endotelial [ca<sup&gt; 2+</sup&gt;]<sub&gt; i</sub&gt; E óxido nítrico Produção

Endothelial cells (ECs) lining the blood vessel walls in vivo are constantly exposed to flow, but cultured ECs are often grown under static conditions and ...

Techniques for Imaging Prometaphase and Metaphase of Meiosis I in Fixed Drosophila Oocytes

Chromosome segregation in human oocytes is error prone, resulting in aneuploidy, which is the leading genetic cause of miscarriage and birth defects. The study of chromosome behavior in oocytes from model organisms holds much promise to uncover the molecular basis of the susceptibility of human oocytes to aneuploidy. Drosophila melanogaster is amenable to genetic manipulation, with over 100 years of research, community, and technique development. Visualizing chromosome behavior and spindle assembly in Drosophila oocytes has particular challenges, however, due primarily to the presence of membranes surrounding the oocyte that are impenetrable to antibodies. We describe here protocols for the collection, preparation, and imaging of meiosis I spindle assembly and chromosome behavior in Drosophila oocytes, which allow the molecular dissection of chromosome segregation in this important model organism.

Techniques for Imaging Prometaphase and Metaphase of Meiosis I in Fixed Drosophila Oocytes

We present protocols for the collection, preparation, and imaging of mature Drosophila oocytes. These methods allow the visualization of chromosome behavior and spindle assembly and function during meiosis.

Técnicas de imagem Prometáfase e Metaphase da meiose I em Fixed<em&gt; Drosophila</em&gt; oócitos

Chromosome segregation in human oocytes is error prone, resulting in aneuploidy, which is the leading genetic cause of miscarriage and birth defects. The ...

Characterization of Calcification Events Using Live Optical and Electron Microscopy Techniques in a Marine Tubeworm

Characterizing the first event of biological production of calcium carbonate requires a combination of microscopy approaches. First, intracellular pH distribution and calcium ions can be observed using live microscopy over time. This allows identification of the life stage and the tissue with the feature of interest for further electron microscopy studies. Life stage and tissues of interest are typically higher in pH and Ca signals. 
Here, using H. elegans, we present a protocol to characterize the presence of calcium carbonate structures in a biological specimen on the scanning electron microscope (SEM), using energy-dispersive X-ray spectroscopy (EDS) to visualize elemental composition, using electron backscatter diffraction (EBSD) to determine the presence of crystalline structures, and using transmission electron microscopy (TEM) to analyze the composition and structure of the material. In this protocol, a focused ion beam (FIB) is used to isolate samples with dimension suitable for TEM analysis. As FIB is a site specific technique, we demonstrate how information from the previous techniques can be used to identify the region of interest, where Ca signals are highest.

We demonstrate the use of various microscopy methods that are useful in observing the calcification of a tubeworm, Hydroides elegans, as well as locating and characterizing the first calcified material. Live microscopy and electron microscopy are used together to provide functional and material information that are important in studying biomineralization.

Caracterização de calcificação eventos usando o Live Óptica e Microscopia Eletrônica de técnicas em um tubeworm Marinha

Characterizing the first event of biological production of calcium carbonate requires a combination of microscopy approaches. First, intracellular pH ...

Discriminação e Caracterização de Populações Heterocelulares Usando Técnicas de Imagem Quantitativa

Resumo

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Capítulos neste vídeo

Em células vivas, Imagem e Análise Quantitativa de células embrionárias epiteliais em Xenopus laevis

Técnicas de imagem Ca^{2 +} Sinalização no esperma humano

Identificação e caracterização de glicosilação de proteínas específicas usando endo-e exoglycosidases

Análise Quantitativa de Autophagy usando microscopia de fluorescência avançada 3D

Medindo intracelular de Ca

Visualização e análise de moléculas de mRNA Usando Fluorescência

Técnicas de Análise de vesículas extracelulares utilizando citometria de fluxo

Desenvolvimento e Caracterização de

Técnicas de imagem Prometáfase e Metaphase da meiose I em Fixed

Caracterização de calcificação eventos usando o Live Óptica e Microscopia Eletrônica de técnicas em um tubeworm Marinha