Este método pode ajudar a responder perguntas-chave no campo da imunidade pulmonar sobre como avaliar a expressão de microRNAs que são previstas para regular genes inflamatórios dentro do pulmão. Esta técnica oferece a maneira simples de identificar as contribuições dos hormônios circulantes para a expressão de microRNA pulmonar. Para avaliar o estágio de ciclo estrous, contenha manualmente um rato fêmea de oito a nove semanas de idade e introduza a ponta de uma pipeta de plástico de 10 microliter preenchida com água ultra pura na vagina.
Lave suavemente de quatro a cinco vezes para coletar uma amostra, e deposite a descarga final de fluido vaginal em um slide de vidro. Em seguida, observe a descarga vaginal não manchada sob um microscópio leve na ampliação de 20X. Para exposições de ozônio e ar filtrado, coloque no máximo quatro ratos em um dos dois recipientes individuais de vidro de 1,2 litros com tampas de malha de arame.
Coloque um recipiente de vidro em uma câmara de ozônio e outro em uma câmara de exposição ao ar filtrada. Em seguida, ajuste a concentração de ozônio para duas partes por milhão, removendo o recipiente após três horas. Quatro horas após a exposição, desinfetar a superfície exposta da pele do primeiro rato experimental com 70% de etanol e cortar a caixa torácica para expor o coração e os pulmões.
Use fórceps para submergir um tubo de micro centrífuga sem RNase de 1,5 mililitro no nitrogênio líquido, e congelar o pulmão colhido no nitrogênio líquido. Em seguida, use um pulverizador de tecido de aço inoxidável para mastigar todo o pulmão, e divida o tecido pulverizado entre dois tubos de microcentrífa de 1,5 mililitro. Após a colheita e pulverização dos pulmões de todos os animais desta mesma maneira, adicione 500 microliters de tiocianato de guanidinium a cada amostra e homogeneize sequencialmente cada tecido com agulhas de 18, 21 e 23.
Após a última homogeneização, adicione 500 microliters de etanol a cada amostra antes do vórtice por 15 segundos. Carregue as misturas em colunas de giro individuais em tubos de coleta individuais para centrifugação e descarte os fluxos. Para o tratamento DNase 1, adicione 400 microliters de tampão de lavagem de RNA a cada coluna para outra centrifugação e misture cinco microlitadores de DNase 1 e 75 microliters de tampão de digestão de DNA por amostra em tubos livres de RNase.
Adicione a mistura diretamente às matrizes da coluna para uma incubação de 15 minutos à temperatura ambiente, seguida por duas soluções de pré-lavagem de RNA de 400 microliter lavadas por centrifugação. Para elutar o RNA, adicione 35 microliters de água livre de DNase RNase diretamente a cada matriz de coluna para uma centrifugação final, e meça a concentração total de RNA e pureza de cada amostra em um espectotógrafo. Em seguida, armazene o RNA a menos 80 graus Celsius.
Para retrotrancrição de RNase pequena, adicione 200 nanogramas de RNA total em 10 microliters de solução pré-lavagem a um tubo de mistura de reação de transcrição reversa por amostra. Após a mistura, centrifufique brevemente as amostras e coloque-as no gelo até sua incubação. Em seguida, incubar os tubos por 60 minutos a 37 graus Celsius, seguido por uma incubação de cinco minutos a 95 graus Celsius.
No final da segunda incubação, diluir a CDNA com 200 microliters de água livre de RNase por reação de transcrição reversa de 20 microliteres, e adicionar 10 microliters de cada amostra de mix de reação a cada poço de uma resposta inflamatória pré-carregada do rato e matriz microRNA PCR de autoimunidade. O estágio proestrus pode ser identificado pela presença de células epiteliais nucleadas em forma redonda e bem formadas. Quando o camundongo está no estágio estrus, aglomerados densamente embalados de células epiteliais anucleadas, cornificadas e escamosas são observadas na mancha.
Durante o metestrus, são vistas células epiteliais cornificadas e leucócitos polimorfonucleares. Em diestrus, leucócitos são geralmente mais prevalentes. O RNA extraído de quatro pulmões de camundongos, como demonstrado, exibe concentrações de ácido nucleico variando entre 1198 e 2178 nanogramas por microliter e proporção média de A260 a A280 entre 2,01 e 2,02, e uma razão média de A260 a A230 entre 2,139 e 2,223.
Nesta tabela, registram duas vezes as alterações na expressão de microRNA entre o ozônio e ratos expostos ao ar filtrado são mostrados. Após o filtro de destino microRNA e a análise do núcleo para 14 microRNAs, para obter a significativa relação de registro de expressão e valores P, esses dados podem ser mapeados pelo filtro de destino microRNA. A análise central também fornece informações sobre caminhos canônicos, doenças e função, reguladores e redes.
Além disso, o software de análise funcional pode ser usado para produzir uma análise de rede que mostre a relação entre as microRNAs de interesse e outras moléculas. Ao tentar este procedimento, é importante verificar o ciclo de estrus diariamente por pelo menos três ciclos consecutivos antes de realizar um experimento. Após este procedimento, outros métodos podem ser realizados para responder a perguntas adicionais sobre a expressão genética inflamatória pulmonar em todo o ciclo de estrus.
Após o desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para que outros pesquisadores do campo da imunidade pulmonar explorassem mecanismos de regulação do hormônio sexual usando outros modelos.
