Agradecemos o programa de doutorado de Biociências moleculares (MOBI) e o departamento de biologia na Universidade meio de estado de Tennessee (MTSU) para fornecer o financiamento para este estudo. O projeto também foi financiado em parte por uma concessão de projetos especiais, atribuída a D.E.N. pela Fundação MTSU.

Nota: C. neoformans é um patógeno de biossegurança nível 2 (BSL-2) e pesquisadores que trabalham com ela devem tomar as devidas precauções. Detalhada de procedimentos sobre como para com segurança trabalho com patógenos BSL-2 pode ser encontrado no Center for Disease Control (CDC) site, mas é importante notar que todas as pessoas que entram em contacto com o c. neoformans devem ser devidamente treinadas em manipulação os agentes patogénicos e deve usar sempre equipamento de protecção adequado (EPI), geralmente de látex ou luvas de nitrilo. Além disso, rotores em centrífugas devem ser selados para evitar clorofórmio de amostras e todos os derramamentos limpados imediatamente, usando uma solução de água sanitária 10%28.
1. cápsula indução
Nota: Todas as etapas devem ser executadas na temperatura de quarto a menos que indicado o contrário.
<ol><li>Cultura de c. neoformans em caldo de dextrose (YPD) levedura peptona (pH 6.5 + /-0,2) e incubar a 37 ° C, com agitação até que estejam em fase de registro (aproximadamente 18-36 h).</li>
	<li>Centrifugar as células a 870 x g por 5 min a 21 ° C e lavar três vezes com solução salina tamponada fosfato (PBS).</li>
	<li>Use um hemocytometer (ou um contador de célula automatizada) para contar as células e ressuspender a 2 x 105 células/2 mL em media de essenciais mínimos de Dulbecco (DMEM).</li>
	<li>Para induzir a cápsula, incube a 37 ° C e 5% CO2 para 18 h. Nota: A combinação de ausência de nutrientes na mídia e a presença de CO2 estimula o crescimento da cápsula de c. neoformans .</li>
	<li>Pós-incubação, recolher as células por centrifugação (como acima) e remover todos, mas 5-10 µ l sobrenadante. Ao mesmo tempo, colha uma amostra de un-induzido célula correspondente para cada tensão a ser medido. Usá-los como controles negativos. Nota: As pelotas de célula serão muito pequenas e podem ser difícil de ver. Tenha cuidado ao aspirar o sobrenadante.</li>
	<li>Manchar com tinta nanquim (seção 2.1) ou corantes fluorescentes (seção 2.2).</li>
</ol>2. coloração
<ol><li>
Coloração com apenas tinta nanquim
	<ol>
<li>Para manchar o fermento com tinta nanquim, resuspenda o pellet em restante sobrenadante e adicionar 4μL (aproximadamente metade) de suspensão de células e 4μL de tinta nanquim em uma lâmina de vidro de microscópio. Delicadamente, misture e evitar a formação de espuma.</li>
		<li>Uma lamela de vidro de 13 mm (espessura de 1.5 #) e selar as bordas com um selante atóxico (esmalte claro) para evitar que a amostra de secar.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Coloração com apenas corantes fluorescentes
	<ol>
<li>Para manchar o fermento com um corante fluorescente, Ressuspender as células em 50 µ l PBS com 1% albumina de soro bovino (BSA).</li>
		<li>Incubar a cultura com um volume igual de Calcofluor white (CFW) (1 µ g/mL) e cápsula mAb 18B7 (ver Tabela de materiais) conjugada com AlexaFluor488 (AF488) (10 µ g/mL) por 30 min a 37 ° C.</li>
		<li>Centrifugar as células a 870 x g durante 5 min à pós-incubação de 21 ° C e aspire o sobrenadante.</li>
		<li>Resuspenda o pellet celular em 10 µ l PBS com 1% albumina de soro bovino (BSA).</li>
		<li>Pipete 8 µ l de suspensão de células sobre uma lâmina de vidro de microscópio.</li>
		<li>Uma lamela de vidro de 13 mm (espessura de 1.5 #) e selar as bordas com um selante atóxico (esmalte claro) para evitar que a amostra de secar.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Coloração com tinta da Índia e corantes fluorescentes
	<ol>
<li>Para mais directamente comparar a eficácia de Nanquim mancha ao de corantes fluorescentes, co manche a mesma população de células com ambos os tipos de mancha. Para fazer isso, primeiro Incube as células com uma cápsula fluorescente e a mancha da parede celular, conforme os passos 2.2.1 - 2.2.3.</li>
		<li>Em seguida, pipetar volumes iguais (4 µ l) da suspensão de células coradas fluorescentemente e tinta nanquim numa lâmina de vidro. Misture suavemente.</li>
		<li>Uma lamela de vidro de 13 mm (espessura de 1.5 #) e selar as bordas com um selante atóxico (esmalte claro) para evitar que a amostra de secar.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. imagem aquisição/microscopia
<ol><li>
Células de imagem manchada com tinta nanquim.
	<ol>
<li>Adquira imagens usando um microscópio de luz padrão (ampliação de 100 X).</li>
		<li>Imagem de um mínimo de 50 células por condição. Nota: O número de células por campo irá variar, e isto é aceitável. É importante, no entanto, que se sobrepõem as células ser mantidos a um mínimo, como estes são difíceis de medir (manualmente e com o software automatizado). Para estas experiências, imagens foram adquiridas em uma profundidade de 16 bits com tempos de exposição otimizados para maximizar o contraste da imagem, minimizando o desfoque causado por pequenos movimentos das células.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Imagem de células coradas com corantes fluorescentes
	<ol>
<li>Para as células de imagem por microscopia de fluorescência, abra o software de imagem de microscópio e selecione os apropriado da excitação e emissão de comprimentos de onda para o fluorophores usado (CFW e AF488 são animado usando o 405nm e luzes de 488 nm, respectivamente). Adquira imagens usando um microscópio de fluorescência.</li>
		<li>Imagem de um mínimo de 50 células por condição. Nota: O número de células por campo irá variar, e isto é aceitável. É importante, no entanto, que se sobrepõem as células ser mantido no mínimo como estas são difíceis de medir (manualmente e com o software automatizado).</li>
		<li>Adquira uma série de imagem de z-pilha das células para garantir que o diâmetro máximo da cápsula para cada célula dentro de um determinado campo é obtido.<ol>
<li>No software de controle do microscópio, clique na barra "z-pilha" para abrir o painel de controle "z-pilha" e, em seguida, seleccione a opção "Primeiro/último" no canto superior esquerdo do painel.</li>
			<li>Use o controle de foco fino no microscópio para se concentrar em um nível que está abaixo do ponto mais largo de uma célula de levedura única e as cápsulas para todos dentro do campo de visão atual e clique em "Definir primeiro".</li>
			<li>Use o controle de foco fino para foco acima do ponto mais largo do corpo celular da mesma célula e da cápsula para todas as células dentro do campo de visão atual e clique em "Definir ontem".</li>
			<li>Clique em "Iniciar o experimento" na guia "Aquisição" para adquirir a z-pilha para a posição atual. Repita o processo em várias posições até imagens de z-pilha mínima de 50 células foram adquiridas. Nota: Para estas experiências, a pinhole confocal foi definido como 1.0 AU e uma sobreposição z-series de 10-20 fatias cobrindo 0,7 µM cada foram adquiridos nas posições selecionadas. AU = unidade arejada.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Em seguida, converta cada série z-pilha em projeções de intensidade máxima (MIP) usando software de análise de imagem apropriado. Nota: MIPs projetam a maior intensidade em cada plano da imagem empilhados29. Criação de MIPs permite produzir uma representação 2D de imagens que correspondem a célula máxima e o diâmetro da cápsula dentro da pilha 3D capturado.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Células de imagem manchada com tinta nanquim e corantes fluorescentes
	<ol>
<li>Adquirir imagens usando widefield (ampliação de 40 X) ou um microscópio confocal (63 X ou ampliação de 100 X). Para células manchadas com tinta nanquim e corantes fluorescentes, capture imagens usando um microscópio widefield equipado com um palco controlado por computador e objectivo de imersão de óleo. Nota: O microscópio em uso deve ser controlado usando um software de imagem CFW. fluorescência que é excitado através de um filtro de excitação 340-380 nm e emitida a luz deverá ser detectada através de um filtro de barreira 435-485 nm reflectido a partir um espelho dicroico 400 nm. AF488 fluorescência pode ser excitada por um filtro de excitação 465-495 nm, e a luz emitida pode ser detectada através de um filtro de barreira 515-555 nm reflectido a partir um espelho dicroico 505 nm.</li>
		<li>Um mínimo de 50 células por condição para cada método de coloração de imagem.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. manual medição da cápsula
<ol><li>Para células manchadas com tinta nanquim ou fluorescentes manchas, usar um software de medição de célula para manualmente medida cápsula e célula de diâmetro (ver Tabela de materiais). Para fazer isso, vá em "Arquivo" > "Abrir imagem" > "Medida" e use o cursor para desenhar uma linha reta através do ponto mais largo da célula inteira (diâmetro total).</li>
	<li>Em seguida, clique novamente em "Medida" e desenhar uma linha reta através do corpo celular (diâmetro do corpo da célula). Nota: As medições são salvos automaticamente para as células.</li>
	<li>Repita este processo para todas as células (mínimo de 50/grupo).</li>
	<li>Para salvar imagens, uma vez que eles são medidos, clique em "Arquivo" > "Salvar como" e nomeie as imagens apropriadamente.</li>
	<li>Selecione os arquivos recentemente medidos e exportar dados para um software de planilha eletrônica.</li>
	<li>Calcule o diâmetro médio da cápsula usando a equação: ([diâmetro total] - [corpo celular de diâmetro]).</li>
</ol>5. automáticos de medição da cápsula
Nota: Para a medição automatizada bem sucedida, usar imagens de 16 bits com um alto nível de contraste e que estão focados corretamente junto com um software de análise de imagem apropriada (consulte a Tabela de materiais). Quando a imagem de c. neoformans para medição da cápsula, é importante concentrar-se no anel escuro na fronteira entre a parede celular e cápsula. Isso permite que o software corretamente delinear da célula e cápsula.
<ol><li>Inverter e criar uma cópia de toda Índia tinta manchada imagens de célula, usando um software de edição de imagem apropriado (consulte a Tabela de materiais). Para fazer isso, clique em "Arquivo" > "Open" para abrir a Índia tinta manchada imagens e depois "Control" + "I" para inverter a imagem. Clique em "Arquivo" > "Salvar como" para salvar a imagem invertida.</li>
	<li>Para importar o original e invertido imagens no software clique em "Arquivo" > "Importar sequência" > "Carregar imagem" > "Definir sequência (manualmente)" > "Dimensões (canal)" > "Importar" > "Aplicar". Nota: Os corpos de células de c. neoformans e cápsulas podem ser identificadas e mascarados usando algoritmos específicos - conhecidos como 'Receitas' - incluídas no software.</li>
	<li>Use a receita de 'Analisador de Colônia (fluorescência)' na imagem invertida para detectar e mascarar o corpo da célula e, em seguida, clique em "aplicar". A imagem invertida, o anel escuro, definir os limites da célula de c. neoformans torna-se mais brilhante do que a cápsula circundante.</li>
	<li>Use a receita de 'Analisador de Colônia (fluorescência)' na imagem invertida para segmentar os corpos de células de c. neoformans de suas cápsulas e, em seguida, clique em "aplicar". Isso cria uma máscara de contagem. Renomear esta máscara de contagem "Corpo celular" clicando na guia rotulada "máscara de contagem". Nota: A receita é composta de várias etapas de processamento de imagem: remoção, detecção de objeto, separação do objeto e filtragem de subconjunto de fundo.</li>
	<li>Em seguida, usar a receita de 'Proliferação celular' na imagem original para detectar e mascarar a cápsula e clique em "aplicar". Isso cria uma máscara de contagem. Renomear esta máscara de contagem "Cápsula" clicando na guia rotulada "máscara de contagem".</li>
	<li>Usando a receita, 'Cápsula partição', crie uma nova máscara na imagem original para particionar cápsulas adjacentes entre si. Para fazer isso, clique em "Partição de cápsula" no menu suspenso de receita. Na caixa de partição de cápsula, escolha a máscara de contagem agora renomeado "Cápsula" (5.5) para a região da cápsula. Escolha a máscara de contagem agora renomeado "Corpo celular" para células Crypto (5.4). Escolha "Original" para o canal de entrada e "criar máscara para Partitioned cápsula. Clique em "Apply Nota: A receita gera células e diâmetro da cápsula, definido como a média dos eixos mais longas e mais curtos atravessando o centro da célula e cápsula e medições de área de máscaras de deteção. Encontre a saída que está localizada na guia planilha neste software. Repita este processo para todas as imagens (mínimo de 50 células/grupo). Parâmetros da receita poderiam ser ajustados para otimizar a deteção de imagens individuais ou otimizados para a deteção de lote de várias imagens. Medidas adicionais podem ser calculadas pela receita para a caracterização completa da célula e morfologia da cápsula.</li>
	<li>Exporte dados para um software de planilha de escolha para posterior análise.</li>
</ol>

<ol>
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P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+HAART+is+associated+with+decreased+risk+of+death+during+initial+treatment+of+cryptococcal+meningitis+in+adults+in+Botswana.">The use of HAART is associated with decreased risk of death during initial treatment of cryptococcal meningitis in adults in Botswana.</a> J Acquir Immune Defic Syndr. 49 (2), 227-229 (2008).</li><li>van Teeffelen, S., Shaevitz, J. W., Gitai, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Image+analysis+in+fluorescence+microscopy:+bacterial+dynamics+as+a+case+study.">Image analysis in fluorescence microscopy: bacterial dynamics as a case study.</a> Bioessays. 34 (5), 427-436 (2012).</li><li>Granger, D. L., Perfect, J. R., Durack, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Virulence+of+Cryptococcus+neoformans.+Regulation+of+capsule+synthesis+by+carbon+dioxide.">Virulence of Cryptococcus neoformans. Regulation of capsule synthesis by carbon dioxide.</a> J Clin Invest. 76 (2), 508-516 (1985).</li></ol>

O autor, Hoyin Lai, é o gerente de produto na DRVision que publica o software de análise de imagem automático, Aivia.

Durante décadas, a cápsula tem sido um grande foco de pesquisa para os micologistas e clínicos interessados em c. neoformans e criptococose devido ao seu papel como um fator de virulência principais para o patógeno. Usando microscopia para medir diferenças no tamanho da cápsula entre estirpes e sob crescimento diferente condições podem fornecer informações importantes sobre o patógeno e suas respostas aos diversos estímulos (ou seja, diferentes condições ambientais, tratamentos com drogas...

Afetando um quarto de milhão de pessoas todos os anos e resultando em mais de 180.000 mortes por ano, o Cryptococcus neoformans é uma levedura patogénica, intracelular e o agente causador da criptococose,1,2, 3. mais atingidas são os pacientes HIV-positivos em países pobres que não têm acesso à terapia anti-retroviral, tornando-os suscetíveis aguda para a doença4,5,6. Dados do CDC indicam que na África subsahariana, c. neoformans mata mais pessoas do que a tuberculose anualmente e mais a cada mês do que qualquer surto de Ebola no registro1. A via mais comum de exposição ocorre de inalar esporos dessecados que são comuns no ambiente7. Ao entrar nos pulmões, existem vários fatores de virulência que contribuem para o sucesso de c. neoformans dentro de indivíduos infectados. A cápsula de polissacarídeo é considerada fator de virulência primário do micróbio, acapsular cepas não são virulentas8.
A cápsula criptocócica é composta de três componentes do princípio: glucuronoxylomannan (GXM), galactoxylomannan (GalXM) e mannoproteins (MPs)9. Enquanto o MPs são um componente relativamente menor associada a parede celular da cápsula, são imunogênicas e podem promover uma resposta principalmente pro-inflamatórios9,10. Em contraste, GXM e GalXM compõem a maior parte da cápsula (> 90% em peso) e tem efeitos imunossupressores11. Além de seus efeitos imunomoduladores, o rápido alargamento da cápsula na vivo cria uma barreira mecânica à ingestão por células fagocíticas (isto é, neutrófilos e macrófagos) do hospedeiro12. A cápsula de c. neoformans e sua síntese são complexas, mas em geral, maior diâmetro da cápsula está correlacionado com maior virulência6,13,14. Diante disso, é importante para os investigadores de c. neoformans ser capaz de rapidamente e com precisão quantificar as medições da cápsula.
Tanto a célula de c. neoformans e sua cápsula de polissacarídeo são estruturas dinâmicas e mostram as mudanças ao longo do tempo,15. A cápsula pode mudar em conjunto em resposta a alterações na host ambiente16,17,18, tamanho e densidade. Baixo ferro ou os níveis de nutrientes, a exposição ao soro, o pH fisiológico humano e aumento de CO2 são conhecidos para iniciar o crescimento da cápsula16,18,19,20. Além disso, pesquisadores demonstraram alterações estruturais, resultando em diferenças significativas na imunorreatividade durante uma infecção, emprestando uma vantagem para c. neoformans sobre seu hospedeiro21,22. Isto é sabido porque a arquitetura da cápsula de c. neoformans foi analisada em uma variedade de maneiras. Microscopia eletrônica, por exemplo, revelou que a cápsula tem uma matriz heterogêneo com uma camada interna de elétron-densas debaixo de uma camada externa, mais permeáveis23. Dispersão da luz e o uso de pinças ópticas permitiram pesquisadores elucidar ainda mais suas propriedades macromolecular24. Analisar os resultados de ambas as medições estáticas e dinâmicas de espalhamento de luz, sabemos que a cápsula de polissacarídeo tem um complexo de estrutura ramificação23. Pinça óptica têm sido utilizada para testar a rigidez da estrutura, bem como avaliar sua reatividade de anticorpos24. No entanto, de longe o mais frequentemente empregado análise da cápsula de c. neoformans é a medida do seu tamanho.
Para quantificar o tamanho da cápsula, os pesquisadores utilizam o que deveria ser uma simples medição: o diâmetro linear da cápsula. Microscópios digitais são usados para capturar imagens de várias células de c. neoformans (geralmente centenas) manchadas com tinta nanquim ou corantes fluorescentes. O tamanho de cada corpo celular e cápsula circundante é medido. Os dados são compilados, e o diâmetro médio da cápsula é calculado subtraindo-se o diâmetro do corpo celular do diâmetro celular (corpo celular + cápsula). Até este ponto, estas medições foram feitas manualmente. Enquanto geralmente exato, este método tem desvantagens para os investigadores. Grandes conjuntos de dados pode demorar dias ou até semanas para analisar com a mão. E porque essas medições são feitas manualmente, subjetividade e erro humano podem afetar o resultado.
Análise de imagem computacional automatizado tornou-se uma ferramenta indispensável para pesquisadores em muitas áreas da biologia celular molecular, permitindo a análise mais rápido e mais confiável de imagens biológicas 25,26,27. Técnicas de análise de imagem precisas são necessárias informações quantitativas de que muitas vezes são conjuntos de dados complexos e imensos o meu. No entanto, algumas medidas, especialmente a medição de c. neoformans cápsula, foram difíceis automatizar. Identificar com precisão a interface entre a parede celular e cápsula, que geralmente aparece como um anel escuro quando imaginada por microscopia de contraste de fase, pode ser problemático para resolver usando um simples limite. Além disso, as células de c. neoformans em cultura tendem a aglutinar-se e segmentação exata das células é necessária para medições precisas.
O objetivo deste projeto foi (i) ilustram um dos protocolos padrão para a indução da cápsula em c. neoformans, (ii) compara e contrasta Nanquim e fluorescência de coloração como dizem respeito para a cápsula de medições de diâmetro, (iii) desenvolver simples, métodos computacionais para medir o diâmetro da cápsula usando imagens da Índia tinta manchada células usando um software de análise de imagem e, (iv) avaliam as vantagens e limitações de medir o diâmetro da cápsula manualmente e usando o software de automação. Podemos achar que os dois métodos de coloração, fluorescentes de rotulagem da parede celular e cápsula, enquanto mais demorados, forneceu os resultados mais consistentes entre experiências. No entanto, ambos os métodos permitiram-nos com sucesso a distinguir entre o laboratório e clínica c. neoformans cápsula de cepas exibindo diferentes tamanhos. Além disso, fomos capazes de automatizar a medição do diâmetro da cápsula de tinta manchada imagens e achei que se tratava de uma alternativa viável para medição manual da cápsula.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Capsule Induction&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;C. neoformans cells&lt;/em&gt;</td><td></td><td></td><td>The clinical lab strain, H99S, was a kind gift from Dr. John Perfect (Duke University).&amp;nbsp; The clinical strains, B18 and B52, were kind gifts from Dr. Greg Bisson (University of Pennsylania).&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Yeast Peptone Dextrose Broth (YPD)</td><td>Fisher Scientific</td><td>DF0428-17-5</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate Buffered Saline (PBS)</td><td></td><td></td><td>This is made in the lab using standard recipe (137mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10mM Na2HPO4O, 2 mM Kh2PO4O)</td></tr><tr><td>DMEM/high-glucose with L-glutamine, without sodium pyruvate</td><td>GE Life Sciences</td><td>SH30022.01</td><td></td></tr><tr><td>6-well plates</td><td>Falcon</td><td>CL5335-5EA</td><td></td></tr><tr><td>Shaking incubator</td><td>Thermo Scientific&amp;nbsp;</td><td></td><td>MaxQ6000</td></tr><tr><td>CO2 incubator</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td>Isotemp</td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td>Legend XTR</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Staining&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microcentrifuge</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td>Legend Micro 21R</td></tr><tr><td>India ink</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-910-56</td><td></td></tr><tr><td>Calcofluor white</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>18909-100ML-F</td><td></td></tr><tr><td>18B7 mouse anti-GXM antibody conjugated to Alexafluor 488</td><td></td><td></td><td>A kind gift from Dr. Arturo Casadevall (Johns Hopkins University)&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>PBS with 1% Bovine Serum Albumin (BSA)</td><td></td><td></td><td>PBS is the same recipe listed above (line 4) with 1% BSA added and filter sterilized.</td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9418</td><td></td></tr><tr><td>Superfrost microscope slides</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-143</td><td></td></tr><tr><td>Glass coverslips</td><td>Corning</td><td>2855-18</td><td>#1.5 thickness</td></tr><tr><td>Clear nail polish or other non-toxic sealant</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Image Acquisition&amp;nbsp;&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Immersion oil</td><td>Cargille&amp;nbsp;</td><td>16484</td><td></td></tr><tr><td>Light microscope with immersion oil objective</td><td>Zeiss</td><td></td><td>Zeiss Axio A1 with a Plan - NEOFLUAR 100x oil immersion NA 1.30 objective</td></tr><tr><td>Light microscope camera</td><td>Zeiss</td><td></td><td>Zeiss Axiocam ErCD camera</td></tr><tr><td>Confocal microscope with oil immersion objective</td><td>Zeiss</td><td></td><td>LSM 700 laser scanning confocal equipped with a Plan-Apochromat 63X NA 1.4 oil immersion DIC M27 objective.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Confocal microscope software</td><td>Zen 2009</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Confocal microscope camera</td><td>Nikon</td><td></td><td>Nikon Ti-Eclipse with a Intensilight epifluorescence illuminator (Nikon), CoolSNAP MYO microscope camera (Photometrics), Plan Apo 60x NA 1.40 oil immersion objective (Nikon) and 1.5x magnification changer.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Widefield imaging software</td><td>Nikon Elements (Nikon)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Capsule Measurement&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Image editing software</td><td>Photoshop (Adobe)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscope software for manual measurement</td><td>Axiovision (Carl Zeiss)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Image analysis software for automated meesurement</td><td>Aivia (DRVision Technologies)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Spreadsheet software</td><td>Excel (Microsoft)</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

size matters: measurement of capsule diameter in cryptococcus neoformans

A cápsula de polissacarídeo de Cryptococcus neoformans é o factor de virulência primário e um dos mais comumente estudados aspectos desta levedura patogênica. Tamanho da cápsula pode variar amplamente entre estirpes, tem a capacidade de crescer rapidamente quando introduziu a estressantes ou baixas condições de nutrientes e tem sido positivamente correlacionado com a virulência da cepa. Por estas razões, o tamanho da cápsula é de grande interesse para pesquisadores de c. neoformans . O crescimento da cápsula de c. neoformans é induzido durante os testes fenotípicos para ajudar a compreender os efeitos de diferentes tratamentos nas diferenças entre cepas de levedura ou tamanho. Aqui descrevemos um dos métodos padrão da cápsula da indução e comparar dois métodos aceites de coloração e medir o diâmetro da cápsula: (i) a tinta indiana, uma mancha negativa, usado em conjunto com microscopia de luz convencional e (ii) co-coloração com corantes fluorescentes da parede celular e cápsula seguido por microscopia confocal. Finalmente, mostramos como a medição do diâmetro da cápsula de amostras manchadas de tinta da Índia pode ser automatizado usando análise computacional de imagens.

Para ilustrar a indução da cápsula, coloracao celular, imagens e técnicas de medição, usamos três estirpes de c. neoformans: Coe o laboratório comum, bem caracterizado, H99S30e duas cepas isoladas clinicamente de anteriormente diâmetro da cápsula desconhecido, B18 e B5231.
O fluxo de trabalho de indução da cápsula, coloração e aquisição de imagens usando t...

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Size Matters: Measurement of Capsule Diameter in Cryptococcus neoformans

Size Matters: Medição do diâmetro da cápsula em Cryptococcus neoformans

A cápsula de polissacarídeo é o factor de virulência primária em Cryptococcus neoformans, e seu tamanho se correlaciona com a virulência da cepa. Medições de diâmetro da cápsula são usadas em testes fenotípicos e para avaliar a eficácia terapêutica. Aqui um método padrão de indução da cápsula é apresentado, e dois métodos de coloração e diâmetro de medição são comparados.

The polysaccharide capsule of Cryptococcus neoformans is the primary virulence factor and one of the most commonly studied aspects of this pathogenic ...

size-matters-measurement-capsule-diameter-cryptococcus

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Size Matters: Measurement of Capsule Diameter in Cryptococcus neoformans

13.4K visualizações.  Middle Tennessee State University. A cápsula de polissacarídeo é o factor de virulência primária em Cryptococcus neoformans, e seu tamanho se correlaciona com a virulência da cepa. Medições de diâmetro da cápsula são usadas em testes fenotípicos e para avaliar a eficácia terapêutica. Aqui um método padrão de indução da cápsula é apresentado, e dois métodos de coloração e diâmetro de medição são comparados.

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Separating Bacteria by Capsule Amount Using a Discontinuous Density Gradient

Capsule is a key virulence factor in many bacterial species, mediating immune evasion and resistance to various physical stresses. While many methods are available to quantify and compare capsule production between different strains or mutants, there is no widely used method for sorting bacteria based on how much capsule they produce. We have developed a method to separate bacteria by capsule amount, using a discontinuous density gradient. This method is used to compare capsule amounts semi-quantitatively between cultures, to isolate mutants with altered capsule production, and to purify capsulated bacteria from complex samples. This method can also be coupled with transposon-insertion sequencing to identify genes involved in capsule regulation. Here, the method is demonstrated in detail, including how to optimize the gradient conditions for a new bacterial species or strain, and how to construct and run the density gradient.

We demonstrate the use of discontinuous density gradients to separate bacterial populations based on capsule production. This method is used to compare capsule amount between cultures, isolate mutants with a specific capsule phenotype, or to identify capsule regulators. Described here is the optimization and running of the assay.

Separando as bactérias por cápsula quantidade usando um gradiente descontínuo de densidade

Capsule is a key virulence factor in many bacterial species, mediating immune evasion and resistance to various physical stresses. While many methods are ...

Genética

Use of Image Cytometry for Quantification of Pathogenic Fungi in Association with Host Cells

Studies of the cellular pathogenesis mechanisms of pathogenic yeasts such as Candida albicans, Histoplasma capsulatum, and Cryptococcus neoformans commonly employ infection of mammalian hosts or host cells (i.e. macrophages) followed by yeast quantification using colony forming unit analysis or flow cytometry. While colony forming unit enumeration has been the most commonly used method in the field, this technique has disadvantages and limitations, including slow growth of some fungal species on solid media and low and/or variable plating efficiencies, which is of particular concern when comparing growth of wild-type and mutant strains. Flow cytometry can provide rapid quantitative information regarding yeast viability, however, adoption of flow cytometric detection for pathogenic yeasts has been limited for a number of practical reasons including its high cost and biosafety considerations. Here, we demonstrate an image-based cytometric methodology using the Cellometer Vision (Nexcelom Bioscience, LLC) for the quantification of viable pathogenic yeasts in co-culture with macrophages. Our studies focus on detection of two human fungal pathogens: Histoplasma capsulatum and Candida albicans. H. capsulatum colonizes alveolar macrophages by replicating within the macrophage phagosome, and here, we quantitatively assess the growth of H. capsulatum yeasts in RAW 264.7 macrophages using acridine orange/propidium iodide staining in combination with image cytometry. Our method faithfully recapitulates growth trends as measured by traditional colony forming unit enumeration, but with significantly increased sensitivity. Additionally, we directly assess infection of live macrophages with a GFP-expressing strain of C. albicans. Our methodology offers a rapid, accurate, and economical means for detection and quantification of important human fungal pathogens in association with host cells.

Here, we demonstrate how image cytometry can be used for quantification of pathogenic fungi in association with host cells in culture. This technique can be used as an alternative to CFU enumeration.

Uso de Citometria de imagem para quantificação de fungos patogênicos em associação com células do hospedeiro

Studies of the cellular pathogenesis mechanisms of pathogenic yeasts such as Candida albicans, Histoplasma capsulatum, and Cryptococcus neoformans ...

Imunologia e Infecção

Visualizing Non-lytic Exocytosis of Cryptococcus neoformans from Macrophages Using Digital Light Microscopy

Many aspects of the infection of macrophages by Cryptococcus neoformans have been extensively studied and well defined. However, one particular interaction that is not clearly understood is non-lytic exocytosis. In this process, yeast cells are released into the extracellular space by a poorly understood mechanism that leaves both the macrophage and Cn viable. Here, we describe how to follow a large number of individually infected macrophages for a 24 hr infection period by time-lapsed microscopy. Infected macrophages are housed in a heating chamber with a CO2 atmosphere attached to a microscope that provides the same conditions as a cell-culture incubator. Live digital microscopy can provide information about the dynamic interactions between a host and pathogen that is not available from static images. Being able to visualize each infected cell can provide clues as to how macrophages handle fungal infections, and vice versa. This technique is a powerful tool in studying the dynamics that are behind a complex phenomenon.

Visualizing Non-lytic Exocytosis of Cryptococcus neoformans from Macrophages Using Digital Light Microscopy

We describe how to visualize macrophage-C. neoformans (Cn) interactions in real time, with specific emphasis on the process of non-lytic exocytosis using digital light microscopy. Using this technique individually infected macrophages can be studied to ascertain various aspects of this phenomenon.

A visualização não-lítica exocitose de<em&gt; Cryptococcus neoformans</em&gt; De macrófagos Usando Digital Microscopia de Luz

Many aspects of the infection of macrophages by Cryptococcus neoformans have been extensively studied and well defined. However, one particular ...

Macrophage Cholesterol Depletion and Its Effect on the Phagocytosis of Cryptococcus neoformans

Cryptococcosis is a life-threatening infection caused by pathogenic fungi of the genus Cryptococcus. Infection occurs upon inhalation of spores, which are able to replicate in the deep lung. Phagocytosis of Cryptococcus by macrophages is one of the ways that the disease is able to spread into the central nervous system to cause lethal meningoencephalitis. Therefore, study of the association between Cryptococcus and macrophages is important to understanding the progression of the infection. The present study describes a step-by-step protocol to study macrophage infectivity by C. neoformansin vitro. Using this protocol, the role of host sterols on host-pathogen interactions is studied. Different concentrations of methyl--cyclodextrin (MCD) were used to deplete cholesterol from murine reticulum sarcoma macrophage-like cell line J774A.1. Cholesterol depletion was confirmed and quantified using both a commercially available cholesterol quantification kit and thin layer chromatography. Cholesterol depleted cells were activated using Lipopolysacharide (LPS) and Interferon gamma (IFN&#947;) and infected with antibody-opsonized Cryptococcus neoformans wild-type H99 cells at an effector-to-target ratio of 1:1. Infected cells were monitored after 2 hr of incubation with C. neoformans and their phagocytic index was calculated. Cholesterol depletion resulted in a significant reduction in the phagocytic index. The presented protocols offer a convenient method to mimic the initiation of the infection process in a laboratory environment and study the role of host lipid composition on infectivity.

Macrophage Cholesterol Depletion and Its Effect on the Phagocytosis of Cryptococcus neoformans

In this article, a protocol for infection of macrophages with Cryptococcus neoformans is described. Also, a method for sterol depletion from the macrophages is explained. These protocols provide a guide to study fungal infections in vitro and examine the role of sterols in such infections.

Macrófago Colesterol Exaustão e seu efeito sobre a fagocitose de<em&gt; Cryptococcus neoformans</em

Cryptococcosis is a life-threatening infection caused by pathogenic fungi of the genus Cryptococcus. Infection occurs upon inhalation of spores, which are ...

Automated Measurement of Cryptococcal Species Polysaccharide Capsule and Cell Body

The purpose of this technique is to provide a consistent, accurate, and manageable process for large numbers of polysaccharide capsule measurements.
First, a threshold image is generated based on intensity values uniquely calculated for each image. Then, circles are detected based on contrast between the object and background using the well-established Circle Hough Transformation (CHT) algorithm. Finally, the detected cell capsules and bodies are matched according to center coordinates and radius size, and data is exported to the user in a manageable spreadsheet.
The advantages of this technique are simple but significant. First, because these calculations are performed by an algorithm rather than a human both accuracy and reliability are increased. There is no decline in accuracy or reliability regardless of how many samples are analyzed. Second, this approach establishes a potential standard operating procedure for the Cryptococcus field instead of the current situation where capsule measurement varies by lab. Third, given that manual capsule measurements are slow and monotonous, automation allows rapid measurements on large numbers of yeast cells that in turn facilitates high throughput data analysis and increasingly powerful statistics.
The major limitations of this technique come from how the algorithm functions. First, the algorithm will only generate circles. While Cryptococcus cells and their capsules take on a circular morphology, it would be difficult to apply this technique to non-circular object detection. Second, due to how circles are detected the CHT algorithm can detect enormous pseudo-circles based on the outer edges of several clustered circles. However, any misrepresented cell bodies caught within the pseudo-circle can be easily detected and removed from the resulting data sets.
This technique is meant for measuring the circular polysaccharide capsules of Cryptococcus species based on India Ink bright field microscopy; though it could be applied to other contrast based circular object measurements.

Automated Measurement of Cryptococcal Species Polysaccharide Capsule and Cell Body

This technique describes an automated batch image processor designed to measure polysaccharide capsule and body radii. While initially designed for Cryptococcus neoformans capsule measurements the automated image processor can also be applied to other contrast based detection of circular objects.

Automáticos de medição de criptocócica espécie polissacarídeo cápsula e corpo celular

The purpose of this technique is to provide a consistent, accurate, and manageable process for large numbers of polysaccharide capsule measurements.
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Automation of Bio-Atomic Force Microscope Measurements on Hundreds of C. albicans Cells

The method presented in this paper aims to automate Bio-AFM experiments and the recording of force curves. Using this method, it is possible to record forces curves on 1000 cells in 4 hours automatically. To maintain a 4 hour analysis time, the number of force curves per cell is reduced to 9 or 16. The method combines a Jython based program and a strategy for assembling cells on defined patterns. The program, implemented on a commercial Bio-AFM, can center the tip on the first cell of the array and then move, automatically, from cell to cell while recording force curves on each cell. Using this methodology, it is possible to access the biophysical parameters of the cells such as their rigidity, their adhesive properties, etc. With the automation and the large number of cells analyzed, one can access the behavior of the cell population. This is a breakthrough in the Bio-AFM field where data have, so far, been recorded on only a few tens of cells.

Automation of Bio-Atomic Force Microscope Measurements on Hundreds of C. albicans Cells

This protocol aims to automate AFM measurements on hundreds of microbial cells. First, microbes are immobilized into PDMS stamp microstructures and then force spectroscopy measurements are performed automatically on hundreds of immobilized cells.

Automação de Medições de Microscópio de Força Bio-Atômica em centenas de células de C. albicans

The method presented in this paper aims to automate Bio-AFM experiments and the recording of force curves. Using this method, it is possible to record ...

Bioengenharia

Complementary Use of Microscopic Techniques and Fluorescence Reading in Studying Cryptococcus-Amoeba Interactions

To simulate Cryptococcus infection, amoeba, which is the natural predator of cryptococcal cells in the environment, can be used as a model for macrophages. This predatory organism, similar to macrophages, employs phagocytosis to kill internalized cells. With the aid of a confocal laser-scanning microscope, images depicting interactive moments between cryptococcal cells and amoeba are captured. The resolution power of the electron microscope also helps to reveal the ultrastructural detail of cryptococcal cells when trapped inside the amoeba food vacuole. Since phagocytosis is a continuous process, quantitative data is then integrated in the analysis to explain what happens at the timepoint when an image is captured. To be specific, relative fluorescence units are read in order to quantify the efficiency of amoeba in internalizing cryptococcal cells. For this purpose, cryptococcal cells are stained with a dye that makes them fluoresce once trapped inside the acidic environment of the food vacuole. When used together, information gathered through such techniques can provide critical information to help draw conclusions on the behavior and fate of cells when internalized by amoeba and, possibly, by other phagocytic cells.

Complementary Use of Microscopic Techniques and Fluorescence Reading in Studying Cryptococcus-Amoeba Interactions

This paper details a protocol for preparing a co-culture of cryptococcal cells and amoebae that is studied using still, fluorescent images and high-resolution transmission electron microscope images. Illustrated here is how quantitative data can complement such qualitative information.

Uso complementar de técnicas microscópicas e leitura de fluorescência no estudo de Cryptococcus-Amoeba interações

To simulate Cryptococcus infection, amoeba, which is the natural predator of cryptococcal cells in the environment, can be used as a model for ...

Broth Microdilution In Vitro Screening: An Easy and Fast Method to Detect New Antifungal Compounds

Fungal infections have become an important medical condition in the last decades, but the number of available antifungal drugs is limited. In this scenario, the search for new antifungal drugs is necessary. The protocol reported here details a method to screen peptides for their antifungal properties. It is based on the broth microdilution susceptibility test from the Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) M27-A3 guidelines with modifications to suit the research of antimicrobial peptides as potential new antifungals. This protocol describes a functional assay to evaluate the activity of antifungal compounds and may be easily modified to suit any particular class of molecules under investigation. Since the assays are performed in 96-well plates using small volumes, a large-scale screening can be completed in a short amount of time, especially if carried out in an automation setting. This procedure illustrates how a standardized and adjustable clinical protocol can help the bench-work pursuit of new molecules to improve the therapy of fungal diseases.

Broth Microdilution In Vitro Screening: An Easy and Fast Method to Detect New Antifungal Compounds

An easy and adaptable broth microdilution method for screening antifungal compounds and extracts.

Como caldo em Vitro rastreio: um método fácil e rápido para detectar novos compostos antifúngicos

Fungal infections have become an important medical condition in the last decades, but the number of available antifungal drugs is limited. In this ...

Biologia

Quantitative Analysis of Aspergillus nidulans Growth Rate using Live Microscopy and Open-Source Software

It is well established that colony growth of filamentous fungi, mostly dependent on changes in hyphae/mycelia apical growth rate, is macroscopically estimated on solidified media by comparing colony size. However, to quantitatively measure the growth rate of genetically different fungal strains or strains under different environmental/growth conditions (pH, temperature, carbon and nitrogen sources, antibiotics, etc.) is challenging. Thus, the pursuit of complementary approaches to quantify growth kinetics becomes mandatory in order to better understand fungal cell growth. Furthermore, it is well-known that filamentous fungi, including Aspergillus spp., have distinct modes of growth and differentiation under sub-aerial conditions on solid media or submerged cultures. Here, we detail a quantitative microscopic method for analyzing growth kinetics of&#160;the model fungus Aspergillus nidulans, using live imaging in both submerged cultures and solid media. We capture images, analyze, and quantify growth rates of different fungal strains in a reproducible and reliable manner using an open source, free software for bio-images (e.g., Fiji), in a way that does not require any prior image analysis expertise from the user.

Quantitative Analysis of Aspergillus nidulans Growth Rate using Live Microscopy and Open-Source Software

We present a label-free live imaging protocol using transmitted light microscopy techniques to capture images, analyze and quantify growth kinetics of the filamentous fungus A. nidulans in both submerged cultures and solid media. This protocol can be used in conjunction with fluorescence microscopy.

Análise quantitativa da taxa de crescimento de nidulans aspergillus usando microscopia ao vivo e software de código aberto

It is well established that colony growth of filamentous fungi, mostly dependent on changes in hyphae/mycelia apical growth rate, is macroscopically ...

Assessing the Putative Anticryptococcal Properties of Crude and Clarified Extracts from Mollusks

Cryptococcus neoformans is an encapsulated human fungal pathogen with a global distribution that primarily infects immunocompromised individuals. The widespread use of antifungals in clinical settings, their use in agriculture, and strain hybridization have led to increased evolution of resistance. This rising rate of resistance against antifungals is a growing concern among clinicians and scientists worldwide, and there is heightened urgency to develop novel antifungal therapies. For instance, C. neoformans produces several virulence factors, including intra- and extra-cellular enzymes (e.g., peptidases) with roles in tissue degradation, cellular regulation, and nutrient acquisition. The disruption of such peptidase activity by inhibitors perturbs fungal growth and proliferation, suggesting this may be an important strategy for combating the pathogen. Importantly, invertebrates such as mollusks produce peptidase inhibitors with biomedical applications and anti-microbial activity, but they are underexplored in terms of their usage against fungal pathogens. In this protocol, a global extraction from mollusks was performed to isolate potential peptidase inhibitors in crude and clarified extracts, and their effects against classical cryptococcal virulence factors were assessed. This method supports the prioritization of mollusks with antifungal properties and provides opportunities for the discovery of anti-virulence agents by harnessing the natural inhibitors found in mollusks.

The human fungal pathogen Cryptococcus neoformans produces a variety of virulence factors (e.g., peptidases) to promote its survival within the host. Environmental niches represent a promising source of novel natural peptidase inhibitors. This protocol outlines the preparation of extracts from mollusks and the assessment of their effect on fungal virulence factor production.

Avaliando as Propriedades Anticriptocócicas Putativas de Extratos Brutos e Clarificados de Moluscos

Cryptococcus neoformans is an encapsulated human fungal pathogen with a global distribution that primarily infects immunocompromised individuals. The ...

Size Matters: Medição do diâmetro da cápsula em Cryptococcus neoformans

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