Esta pesquisa foi financiada pela grants-in-aid do Ministério da educação, cultura, esportes, ciência e tecnologia (MEXT) do Japão (n. º s 15 00408 K, 24659011, 24640156, 245900425 e 22390005 para Shin Aoki), uma subvenção a pesquisa bioquímica de Tóquio Fundação, Tóquio, Japão e pelo fundo para as áreas de investigação estratégica de TUS (Tokyo University of Science). Gostaríamos de agradecer as medições dos espectros NMR, Fukiko Hasegawa (Faculdade de Ciências Farmacêuticas, Universidade de Tokyo da ciência) para as medições da massa Noriko Sawabe (Faculdade de Ciências Farmacêuticas, Universidade de Tokyo da ciência) Espectros e Tomoko Matsuo (Instituto de pesquisa para a ciência e tecnologia, Universidade de Tokyo da ciência) para as medições das análises elementares.

Nota: Todos os dados experimentais [NMR, espectroscopia de infravermelha (IR), espectroscopia de massa (MS), rotações ópticas e elemental analisa dados] dos compostos sintetizados foram relatados em um anterior papel51.
1. procedimento para O- glicosilação reações
<ol><li>Síntese de compostos α/β-12 (12 entrada na tabela 1) Nota: 1-13 de entradas na tabela 1 foram realizadas usando um procedimento semelhante.<ol>
<li>
Protecção temporária de 2', 3'-diol de ribonucleoside40
		<ol>
<li>Em 10 mL de um balão em forma de pera (frasco 1), dissolver mannosyl doador α -9 (28,4 mg, 0.0486 mmol)52, uridina 10 (7,9 mg, 0.0324 mmol) e 4-(trifluorometil) phenylboronic ácido 11 c (9,3 mg, 0.0490 mmol) em piridina anidra (0,40 mL). Nota: O uso de um balão de 10 mL forma de pera é recomendado porque, na etapa 1.1.3.1, a mistura de reação vai ser transferida para balão 2 (um 10 mL 2-pescoço balão de fundo redondo com um septo anexado a ele) contendo molecular peneiras de pó.</li>
			<li>Co evapore a mistura de reação (obtida na etapa 1.1.1.1.) com piridina anidra (0,40 mL, 3x) e anidro 1,4-dioxano (0,40 mL, 3x) à temperatura ambiente para ca. 40 ° C para remover toda a água.</li>
			<li>Dissolver o resíduo (obtido na etapa 1.1.1.2.) em anidro 1,4-dioxano (0,32 mL) e agitar a mistura de reação a sua temperatura de refluxo por 1h formar um éster boronic (a protecção temporária).</li>
			<li>Remova o solvente usando um evaporador rotativo, seguido por uma bomba de vácuo.</li>
		</ol>
</li>
		<li>
Ativação de peneiras moleculares
		<ol>
<li>Num balão de fundo redondo 10 mL 2-pescoço com um septo anexado a ele (frasco 2), adicionar 4 Å pó de peneiras moleculares (64 mg). Nota: Peneiras moleculares apropriadas devem ser selecionadas de acordo com o solvente utilizado para a glicosilação (3 Å para acetonitrilo) e 4 Å para Propanonitrila, diclorometano e 1,4-dioxano.</li>
			<li>Aqueça no microondas sob pressão atmosférica, as peneiras moleculares e resfriá-los sob pressão reduzida evacuado por uma bomba de vácuo (3 x) e em seguida, seque-os com uma pistola de calor sob pressão reduzida enquanto substituindo o ar com gás argon várias vezes.</li>
		</ol>
</li>
		<li>
Glicosilação
		<ol>
<li>Dissolva o resíduo da etapa 1.1.1.4. no frasco 1 Propanonitrila (0,64 mL) ou outros solventes e transferir esta solução para balão 2. Nota: Acetonitrilo, 1,4-dioxano, diclorometano e Propanonitrila foram usados para as entradas 1-7 e 9, 10 entrada, entrada 11 e entradas, 8, 12 e 13, respectivamente.</li>
			<li>Agitar a mistura de reação num balão 2 à temperatura ambiente para 0,5 h seguido de refrigerá-la a-40 ° C. Nota: A temperatura foi alterada de acordo com o solvente utilizado para a glicosilação (-40 ° C para diclorometano e Propanonitrila), temperatura de 1,4-dioxano e -20 ° C para acetonitrilo.</li>
			<li>Adicione prata trifluormetanosulfonato (49,9 mg, 0,194 mmol) e p -cloreto de toluenesulfenyl (12.8 µ l, 0.0968 mmol) a mistura de reacção à mesma temperatura como usado na etapa 1.1.3.2.</li>
			<li>Agite a mistura de reação à mesma temperatura para 1,5 h.</li>
			<li>Verificar a reação por cromatografia de camada fina (TLC) com acetato de etila/hexano [3/1 (v/v)] para verificar os doadores glycosyl [o fator de retenção (Rf) (doador α -9) = 0,63] e com clorofórmio/metanol [10/1 (v/v))] para verificar a glycosyl aceitadores e produtos [Rf (aceitador 10) = 0,03, Rf (produto desejado) = 0,50].</li>
			<li>Saciar a mistura de reação com bicarbonato de sódio aquosa saturada (1,0 mL), diluir com clorofórmio (2,0 mL), remover os materiais insolúveis com Celitee lavar cuidadosamente a Celite com clorofórmio (20 mL).</li>
			<li>Lave o filtrado (camada orgânica) com bicarbonato de sódio aquoso saturado (20 mL, 3x) e salmoura (20 mL), usando um funil de separação de 100ml.</li>
			<li>Seque a camada orgânica resultante com sulfato de sódio, filtrar os materiais insolúveis e concentrar o filtrado usando um evaporador rotativo.</li>
			<li>Aproximadamente, purificar o resíduo restante por cromatografia em coluna [sílica gel, clorofórmio/metanol = 1/0 - 50/1 (v/v)] para pagar bruto 5'-O-(6"-O- acetil-2", 3", 4"- tri-O- benzil-α/β-ᴅ-mannopyranosyl) uridina contendo um pequena quantidade de subprodutos (15,2 mg, xarope incolor).</li>
		</ol>
</li>
		<li>
Acetilação
		<ol>
<li>Em um frasco de 5 mL, dissolva o composto bruto resultante, preparado na etapa 1.1.3.9 em piridina anidra (0,20 mL).</li>
			<li>Adicionar N,N-dimetil-4-aminopiridina (uma quantidade catalítica) e anidrido acético (20,4 µ l, mmol 0.0216: 10 equivalentes baseiam o composto bruto) para a solução a 0 ° C.</li>
			<li>Agite a mistura de reação à mesma temperatura para 0,5 h seguido de um aquecimento para a temperatura ambiente.</li>
			<li>Após a agitação durante a noite, verificar a reação do TLC com clorofórmio/metanol [30/1 (v/v)] [Rf (α/β-12) = 0,45].</li>
			<li>Dilua a mistura reacional com clorofórmio (20 mL).</li>
			<li>Lave a camada orgânica com ácido clorídrico de 1 M (20 mL, 3x), saturada de bicarbonato de sódio aquoso (20 mL, 3x) e salmoura (20 mL), usando um funil de separação de 100ml.</li>
			<li>Seque a camada orgânica resultante com sulfato de sódio, filtrar os materiais insolúveis e concentrar o filtrado usando um evaporador rotativo.</li>
			<li>Purificar o resíduo restante por cromatografia em coluna [sílica gel, clorofórmio/metanol = 1/0 - 90/1 (v/v)] dar α/β-12 (15,8 mg, 61%, α/β = 1/1.6, sólido incolor amorfo).</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>Síntese de compostos β-22 a β-30 (tabela 2) e β-33 (tabela 3) Nota: A síntese de β-22-Β-30e β-33foi realizada usando um procedimento semelhante.<ol><li>Síntese de compostos β-22 (entrada 1 na tabela 2)
		<ol>
<li>
Protecção temporária de 2', 3'-diol de ribonucleoside
			<ol>
<li>Em 10 mL de um balão em forma de pera (balão 3), dissolver adenosina 13 (20,4 mg, 0.0763 mmol), galactosyl doador β -21 (80,4 mg, 0.114 mmol)53e 4-(trifluorometil) phenylboronic ácido 11 c (21,7 mg, 0.114 mmol) em anidro piridina (0,76 mL). Nota: O uso de um balão de 10 mL forma de pera é recomendado porque a mistura de reação vai ser transferida para o frasco n º 4 (um 10 mL 2-pescoço balão de fundo redondo com um septo anexado a ele) contendo molecular peneiras de pó na etapa 1.2.1.3.1.</li>
				<li>Co evapore a mistura de reação (obtida na etapa 1.2.1.1.1.) com piridina anidra (0,76 mL, 3x) e anidro 1,4-dioxano (0,76 mL, 3x) à temperatura ambiente para ca. 40 ° C para remover toda a água.</li>
				<li>Dissolver o resíduo (obtido na etapa 1.2.1.1.2.) em anidro 1,4-dioxano (0,76 mL) e agitar a mistura de reação a sua temperatura de refluxo por 1h formar um éster boronic (uma protecção temporária).</li>
				<li>Remova o solvente usando um evaporador rotativo, seguido por uma bomba de vácuo.</li>
			</ol>
</li>
			<li>
Ativação de peneiras moleculares
			<ol>
<li>Num balão de fundo redondo 10 mL 2-pescoço com um septo anexado a ele (frasco n º 4), adicionar 4 Å pó de peneiras moleculares (150 mg).</li>
				<li>Aqueça no microondas sob pressão atmosférica, as peneiras moleculares e resfriá-los sob pressão reduzida evacuado por uma bomba de vácuo (3 x) e em seguida, seque-os com uma pistola de calor sob pressão reduzida enquanto substituindo o ar com gás argon várias vezes.</li>
			</ol>
</li>
			<li>
Glicosilação
			<ol>
<li>Dissolva o resíduo da etapa 1.2.1.1.4. balão 3 em Propanonitrila (1,50 mL) e transferir essa solução para balão 4.</li>
				<li>Agitar a mistura de reação à temperatura ambiente para 0,5 h, seguido de resfriamento é-40 ° c.</li>
				<li>Adicione prata trifluormetanosulfonato (117,6 mg, 0.458 mmol) e cloreto de p- toluenesulfenyl (µ l 30.3, 0.229 mmol) a mistura de reacção à mesma temperatura, conforme mencionado na etapa 1.2.1.3.2.</li>
				<li>Agite a mistura de reação, na mesma temperatura para 1,5 h.</li>
				<li>Verificar a reação do TLC com acetato de etila/hexano [2/1 (v/v)] para verificar os doadores glycosyl [Rf (doador β -21) = 0,62] e com clorofórmio/metanol [10/1 (v/v)] para verificar os aceitadores glycosyl e produtos [Rf (aceitador 13 ) = 0,05, Rf (produto desejado) = 0.30].</li>
				<li>Saciar a mistura de reação com bicarbonato de sódio aquosa saturada (2,0 mL), diluir com clorofórmio (3,0 mL), remover os materiais insolúveis através de Celitee lavar cuidadosamente a Celite com clorofórmio (30 mL).</li>
				<li>Lave o filtrado (camada orgânica) com saturada de bicarbonato de sódio aquoso (30 mL, 3x) e salmoura (30 mL) usando um funil de separação de 100ml.</li>
				<li>Seque a camada orgânica resultante com sulfato de sódio, filtrar os materiais insolúveis e concentrar o filtrado usando um evaporador rotativo.</li>
				<li>Purificar o resíduo restante por cromatografia em coluna [sílica gel, clorofórmio/metanol = 1/0 - 30/1 (v/v)] comprar β -22 (27,4 mg, 42%, sólido incolor).</li>
			</ol>
</li>
		</ol></li>
		<li>Síntese de compostos β-23 (entrada na tabela 2 de 2)
		<ol>
<li>Conduta a reação usando 14 (28,4 mg, 0.0765 mmol)54, β -21 (80,5 mg, 0.115 mmol), 11 c (21,8 mg, 0.115 mmol), cloreto de p- toluenesulfenyl (µ l 30.3, 0.229 mmol), prata trifluormetanosulfonato (117,8 mg, 0.458 mmol), anidro 1,4-dioxano (0,76 mL), Propanonitrila anidra (1,50 mL) e 4 peneiras moleculares de Å (150 mg). Purificar o resíduo resultante por cromatografia em coluna [sílica gel, clorofórmio/metanol = 1/0 - 50/1 (v/v)] dar β–23 (21,9 mg, 30%, sólido incolor). TLC: Rf (β -23) = 0,37 [clorofórmio/metanol = 10/1 (v/v)].</li>
		</ol></li>
		<li>Síntese de compostos β-24 (entrada na tabela 2 de 3)
		<ol>
<li>Realizar a reação usando 15 (21,6 mg, 0.0763 mmol), β -21 (80,5 mg, 0.115 mmol), 11 c (21,8 mg, 0.115 mmol), cloreto de p- toluenesulfenyl (µ l 30.3, 0.229 mmol), prata trifluormetanosulfonato (117,6 mg, 0.458 mmol), anidro (1,4-dioxano mL de 0,76), Propanonitrila anidra (1,50 mL) e 4 peneiras moleculares de Å (150 mg). Purificar o resíduo resultante por cromatografia em coluna [sílica gel, clorofórmio/metanol = 1/0 - 8/1 (v/v)] dar β -24 (8,1 mg, 12%, sólido incolor). TLC: Rf (β -24) = 0.20 [clorofórmio/metanol = 10/1 (v/v)].</li>
		</ol></li>
		<li>Síntese de compostos β-25 (entrada na tabela 2 de 4)
		<ol>
<li>Conduta a reação usando 16 (27,0 mg, 0.0764 mmol)55, β -21 (80,5 mg, 0.115 mmol), 11 c (21,8 mg, 0.115 mmol), cloreto de p- toluenesulfenyl (µ l 30.3, 0.229 mmol), prata trifluormetanosulfonato (117,8 mg, 0.458 mmol), anidro 1,4-dioxano (0,76 mL), Propanonitrila anidra (1,50 mL) e 4 peneiras moleculares de Å (150 mg). Purificar o resíduo resultante por cromatografia em coluna [sílica gel, clorofórmio/metanol = 1/0 - 20/1 (v/v)] dar β -25 (31,4 mg, 44%, sólido incolor). TLC: Rf (β -25) = 0,27 [clorofórmio/metanol = 10/1 (v/v)].</li>
		</ol></li>
		<li>Síntese de compostos β-26 (entrada na tabela 2 de 5)
		<ol>
<li>Realizar a reação usando 10 (18,6 mg, 0.0762 mmol), β -21 (80,4 mg, 0.114 mmol), 11 c (21,7 mg, 0.114 mmol), cloreto de p- toluenesulfenyl (µ l 30.3, 0.229 mmol), prata trifluormetanosulfonato (117,6 mg, 0.458 mmol), anidro (1,4-dioxano mL de 0,76), Propanonitrila anidra (1,50 mL) e 4 peneiras moleculares de Å (150 mg). Purificar o resíduo resultante por cromatografia em coluna [sílica gel, clorofórmio/metanol = 1/0 - 40/1 (v/v)] dar β -26 (26,1 mg, 42%, sólido incolor). TLC: Rf (β -26) = 0,45 [clorofórmio/metanol = 10/1 (v/v)].</li>
		</ol></li>
		<li>Síntese de compostos β-27 (entrada na tabela 2 de 6)
		<ol>
<li>Realizar a reação usando 17 (19,7 mg, 0.0763 mmol), β -21 (80,5 mg, 0.115 mmol), 11 c (21,8 mg, 0.115 mmol), cloreto de p- toluenesulfenyl (µ l 30.3, 0.229 mmol), prata trifluormetanosulfonato (117,6 mg, 0.458 mmol), anidro (1,4-dioxano mL de 0,76), Propanonitrila anidra (1,50 mL) e 4 peneiras moleculares de Å (150 mg). Purificar o resíduo resultante por cromatografia em coluna [sílica gel, clorofórmio/metanol = 1/0 - 40/1 (v/v)] dar β -27 (33,8 mg, 53%, sólido incolor). TLC: Rf (β -27) = 0,50 [clorofórmio/metanol = 10/1 (v/v)].</li>
		</ol></li>
		<li>Síntese de compostos β-28 (entrada na tabela 2 de 7)
		<ol>
<li>Realizar a reação usando 18 (20,0 mg, 0.0763 mmol), β -21 (80,4 mg, 0.114 mmol), 11 c (21,7 mg, 0.114 mmol), cloreto de p- toluenesulfenyl (µ l 30.3, 0.229 mmol), prata trifluormetanosulfonato (117,6 mg, 0.458 mmol), anidro (1,4-dioxano mL de 0,76), Propanonitrila anidra (1,50 mL) e 4 peneiras moleculares de Å (150 mg). Purificar o resíduo resultante por cromatografia em coluna [sílica gel, clorofórmio e acetato de etila/clorofórmio = 1/1 (v/v)] dar β–28 (38,8 mg, 61%, sólido incolor). TLC: Rf (β -28) = 0,33 [clorofórmio/metanol = 10/1 (v/v)].</li>
		</ol></li>
		<li>Síntese de compostos β-29 (entrada na tabela 2 de 8)
		<ol>
<li>Realizar a reação usando 19 (18,5 mg, 0.0761 mmol), β -21 (80,4 mg, 0.114 mmol), 11 c (21,7 mg, 0.114 mmol), cloreto de p- toluenesulfenyl (µ l 30.3, 0.229 mmol), prata trifluormetanosulfonato (117,6 mg, 0.458 mmol), anidro (1,4-dioxano mL de 0,76), Propanonitrila anidra (1,50 mL) e 4 peneiras moleculares de Å (150 mg). Purificar o resíduo resultante por cromatografia em coluna [sílica gel, clorofórmio/metanol = 1/0 - 10/1 (v/v)] dar β -29 (34,1 mg, 55%, sólido incolor). TLC: Rf (β -29) = 0,25 [clorofórmio/metanol = 10/1 (v/v)].</li>
		</ol></li>
		<li>Síntese de compostos β-30 (entrada 9 na tabela 2)
		<ol>
<li>Conduta a reação usando 20 (26,6 mg, 0.0766 mmol)56, β -21 (80,6 mg, 0.115 mmol), 11 c (21,8 mg, 0.115 mmol), cloreto de p- toluenesulfenyl (µ l 30.3, 0.229 mmol), prata trifluormetanosulfonato (117,8 mg, 0.458 mmol), anidro 1,4-dioxano (0,76 mL), Propanonitrila anidra (1,50 mL) e 4 peneiras moleculares de Å (150 mg). Purificar o resíduo resultante por cromatografia em coluna [sílica gel, clorofórmio/metanol = 1/0 - 50/1 (v/v)] dar β -30 (28,0 mg, 40%, sólido incolor). TLC: Rf (β -30) = 0,48 [clorofórmio/metanol = 10/1 (v/v)].</li>
		</ol></li>
		<li>Síntese de compostos β-33 (1 de entrada na tabela 3)
		<ol>
<li>Conduta a reação usando 18 (20,0 mg, 0.0762 mmol), β -31 (80,4 mg, 0.114 mmol)57, 11 c (21,7 mg, 0.114 mmol), cloreto de p- toluenesulfenyl (µ l 30.3, 0.229 mmol), prata trifluormetanosulfonato (117,6 mg, 0.458 mmol), anidro 1,4-dioxano (0,76 mL), Propanonitrila anidra (1,50 mL) e 4 peneiras moleculares de Å (150 mg). Purificar o resíduo resultante por cromatografia em coluna [sílica gel, clorofórmio/metanol = 1/0 - 30/1 (v/v)] dar β -33 (34,5 mg, 54%, sólido incolor). TLC: Rf (β -33) = 0,33 [clorofórmio/metanol = 10/1 (v/v)].</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
</ol>2. a desproteção de β-28 (Figura 2)
<ol><li>Em um frasco de 5 mL, adicione β -28 (25,2 mg, 0.0300 mmol) e 10m metilamina em metanol (2,0 mL)58.</li>
	<li>Agite a mistura de reação a 0 ° C, durante 2 h, seguido de aquecimento, a temperatura ambiente.</li>
	<li>Após agitação a mistura para 13h, verificar a reação do TLC com clorofórmio/metanol [10/1 (v/v)] [Rf (β -35) = 0,20].</li>
	<li>Concentre-se a mistura de reação usando um evaporador rotativo.</li>
	<li>Dissolver o resíduo em água (15 mL) e lave a fase aquosa com diclorometano (15 mL, 3 x) usando um funil de separação de 50ml.</li>
	<li>Concentre-se a fase aquosa usando um evaporador rotativo.</li>
	<li>Purificar o resíduo restante por cromatografia líquida preparativa de alto desempenho (HPLC) [coluna: ODS (octadecilsilano) coluna (20Φ x 250 mm), eluente: água (contém ácido trifluoroacético de 0.1% [v/v]), taxa de fluxo: 8,0 mL/min, a deteção: 266 nm, temperatura: 25 ° C, tempo de retenção: 20 min] para dar β -35 (7,9 mg, 62%, sólido incolor amorfo)59.</li>
</ol>3. NMR estudos de éster Boronic cíclico (Figura 3 e 4)
<ol><li>
Preparação e medição de 36
	<ol>
<li>Balão em forma de pera de 10 mL, dissolver uridina 10 (34,3 mg, 0,140 mmol) e 4-(trifluorometil) phenylboronic ácido 11 c (40,0 mg, 0.211 mmol) em piridina anidra (1,00 mL).</li>
		<li>Co evapore a mistura reacional com piridina anidra (1,00 mL, 3x) e anidro 1,4-dioxano (1,00 mL, 3x) à temperatura ambiente para ca. 40 ° C para remover toda a água.</li>
		<li>Dissolver o resíduo em anidro 1,4-dioxano (1,40 mL) e agitar a mistura de reação a sua temperatura de refluxo por 1h formar um éster boronic (uma protecção temporária).</li>
		<li>Dispense a mistura de reação (0,14 mL) para um frasco de 5 mL.</li>
		<li>Remova o solvente do frasco 5ml usando um evaporador rotativo, seguido por uma bomba de vácuo.</li>
		<li>Dissolva o resíduo resultante 36 em acetonitrilo -d3 (0,64 mL).</li>
		<li>Medir 1H, 11B e espectroscopia NMR F de 19usando um tubo NMR de quartzo a 25 ° C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Preparação e medição de 38
	<ol>
<li>Preparar a mistura de reação 38 de 11 c (40,0 mg, 0.211 mmol) usando o procedimento similar como o do passo 3.1.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

O objetivo deste manuscrito é mostrar um método conveniente e sintético para preparar nucleosídeos dissacarídeo usando ribonucleosides desprotegidos sem manipulações de grupo protegendo tedioso. Nós relatamos aqui sobre o regioselective O- glycosylations de nucleosídeos através o temporário 2', 3'-diol proteção por um éster cíclico boronic (Figura 1B)51.
A preparação do éster cíclico bor...

Nucleosídeos dissacarídeo, que são conjugados de nucleosídeo e um grupo de carboidratos ligados através de um O-glicosídicas vínculo, constituem uma valiosa classe de naturalmente carboidratos derivados1,2 ,3,4,5,6,7. Por exemplo, são incorporados em macromoléculas biológicas, tais como o tRNA (ácido ribonucleico de transferência) e poly(ADP-ribose) (ADP = difosfato de adenosina), bem como em alguns agentes antibacterianos e outras substâncias biologicamente ativos (por exemplo, adenophostins, amicetins, ezomycin)5,6,8,9,10,11,12,13, 14,15,16,17,18,19. Daí, nucleosídeos dissacarídeo e seus derivados deverão ser compostos de chumbo para a pesquisa de descoberta de drogas. As metodologias para a síntese de nucleosídeos dissacarídeo são classificadas em três categorias; enzimática Oglycosylation -20,21, químico N- glicosilação5,9,16,22,23, 24e química Oglycosylation -7,9,14,16,18,19,24, 25,26,,27,28,29,30,31,32,33, 34,35,36,37. Em particular, Oquímico - glicosilação seria um método eficiente para a síntese de stereoselective e síntese em larga escala de nucleosídeos dissacarídeo. Pesquisa anterior mostrou que o O- glicosilação de 2'-desoxirribonucleosídeo 2 com o thioglycosyl doador 1, utilizando a combinação de cloreto de p- toluenesulfenyl e prata trifluormetanosulfonato, proporciona a desejado dissacarídeo nucleosídeo 3 (Figura 1A; Ar = aril e PG = grupo protegendo)38.
Na sequência destes resultados, decidimos desenvolver o O- glicosilação de ribonucleosides aplicação do sistema de promotor trifluormetanosulfonato p- toluenesulfenyl/cloreto de prata. Enquanto vários exemplos do - glicosilação de ribonucleosides parcialmente protegidas têm sido demonstradas7,9,14,16,18,19 ,24,32,33,34,35,36,37, o uso de desprotegida ou temporariamente protegido ribonucleosides como um aceitador glycosyl para O- glicosilação insignificante relatou. Portanto, o desenvolvimento de regioselective O- glicosilação de desprotegida ou temporariamente protegido ribonucleosides forneceria um método sintético mais benéfico sem proteger manipulações de grupo de ribonucleosides. Para alcançar o regioselective O- glicosilação de ribonucleosides, enfocamos os compostos de boro, porque vários exemplos de alquilação, acilação regio e / ou stereoselective, sililação e glicosilação do hidrato de carbono derivados, assistido por boronic ou ácido borinic foram relatados39,40,41,42,,43,44,45 ,46,47,,48,,49,50. Neste artigo, vamos demonstrar o procedimento para a síntese de nucleosídeos dissacarídeo utilizando regioselective O- glicosilação no grupo 5'-hidroxila de ribonucleosides através de um éster boronic intermediário. Na estratégia apresentada aqui, éster boronic intermediário 6 ia ser proporcionadas da esterificação do ribonucleoside 4 com o boronic ácido 5, que permite que o regioselective O- glicosilação na Grupo 5'-hidroxila com thioglycosyl doador 7 para dar o dissacarídeo nucleosídeo 8 (Figura 1B)51. Também estudamos a interação de um ribonucleoside e ácido boronic por espectroscopia de ressonância magnética nuclear (NMR), para observar a formação de um éster boronic. Esterificação, tornar-se um éster boronic e uma reação de glicosilação exigem condições anidras para evitar a hidrólise do éster boronic e o doador glycosyl. Neste artigo, vamos mostrar os procedimentos típicos para obter as condições anidras para reacções de glicosilação bem sucedido para pesquisadores e estudantes não somente em química, mas também em outros campos de pesquisa.

<table><tbody><tr><td>Silver trifluoromethanesulfonate</td><td>Nacalai Tesque</td><td>34945-61</td><td></td></tr><tr><td>Phenylboronic acid (contains varying amounts of anhydride)</td><td>Tokyo Chemical Industry</td><td>B0857</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;p&lt;/em&gt;-Methoxyphenylboronic acid</td><td>Wako Pure Chemical Industries</td><td>321-69201</td><td></td></tr><tr><td>4-(Trifluoromethyl)phenylboronic acid (contains varying amounts of anhydride)</td><td>Tokyo Chemical Industry</td><td>T1788</td><td></td></tr><tr><td>2,4-Difluorophenylboronic acid (contains varying amounts of anhydride)</td><td>Tokyo Chemical Industry</td><td>D3391</td><td></td></tr><tr><td>Cyclopentylboronic acid (contains varying amounts of Anhydride)</td><td>Tokyo Chemical Industry</td><td>C2442</td><td></td></tr><tr><td>4-Nitrophenylboronic acid (contains varying amounts of anhydride)</td><td>Tokyo Chemical Industry</td><td>N0812</td><td></td></tr><tr><td>4-Hexylphenylboronic acid (contains varying amounts of anhydride)</td><td>Tokyo Chemical Industry</td><td>H1489</td><td></td></tr><tr><td>Adenosine</td><td>Merck KGaA</td><td>862.</td><td></td></tr><tr><td>Guanosine</td><td>Acros Organics</td><td>411130050</td><td></td></tr><tr><td>Cytidine</td><td>Tokyo Chemical Industry</td><td>C0522</td><td></td></tr><tr><td>Uridine</td><td>Tokyo Chemical Industry</td><td>U0020</td><td></td></tr><tr><td>5-Fluorouridine</td><td>Tokyo Chemical Industry</td><td>F0636</td><td></td></tr><tr><td>5-Methyluridine</td><td>Sigma</td><td>M-9885</td><td></td></tr><tr><td>Methylamine (40% in Methanol,&amp;nbsp;ca. 9.8mol/L)</td><td>Tokyo Chemical Industry</td><td>M1016</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;N,N&lt;/em&gt;-dimethyl-4-aminopyridine</td><td>Wako Pure Chemical Industries</td><td>044-19211</td><td></td></tr><tr><td>Acetic anhydride</td><td>Nacalai Tesque</td><td>00226-15</td><td></td></tr><tr><td>Pyridine, Dehydrated</td><td>Wako Pure Chemical Industries</td><td>161-18453</td><td></td></tr><tr><td>Acetonitrile</td><td>Kanto Chemical</td><td>01031-96</td><td></td></tr><tr><td>1,4-Dioxane</td><td>Nacalai Tesque</td><td>13622-73</td><td></td></tr><tr><td>Dichloromethane</td><td>Wako Pure Chemical Industries</td><td>130-02457</td><td></td></tr><tr><td>Propionitrile</td><td>Wako Pure Chemical Industries</td><td>164-04756</td><td></td></tr><tr><td>Molecular sieves 4A powder</td><td>Nacalai Tesque</td><td>04168-65</td><td></td></tr><tr><td>Molecular sieves 3A powder</td><td>Nacalai Tesque</td><td>04176-55</td><td></td></tr><tr><td>Celite 545RVS</td><td>Nacalai Tesque</td><td>08034-85</td><td></td></tr><tr><td>Acetonitrile-D3 (D,99.8%)</td><td>Cambridge Isotope Laboratories</td><td>DLM-21-10</td><td></td></tr><tr><td>Trifluoroacetic acid</td><td>Nacalai Tesque</td><td>34831-25</td><td></td></tr><tr><td>TLC Silica gel 60 F&lt;sub&gt;254&lt;/sub&gt;</td><td>Merck KGaA</td><td>1.05715.0001</td><td></td></tr><tr><td>Chromatorex</td><td>Fuji Silysia Chemical</td><td>FL100D</td><td></td></tr><tr><td>Sodium hydrogen carbonate</td><td>Wako Pure Chemical Industries</td><td>191-01305</td><td></td></tr><tr><td>Hydrochloric acid</td><td>Wako Pure Chemical Industries</td><td>080-01061</td><td></td></tr><tr><td>Sodium sulfate</td><td>Nacalai Tesque</td><td>31915-96</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Kanto Chemical</td><td>07278-81</td><td></td></tr><tr><td>Sodium chloride</td><td>Wako Pure Chemical Industries</td><td>194-01677</td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Nacalai Tesque</td><td>21914-74</td><td></td></tr><tr><td>JEOL Always 300</td><td>JEOL</td><td></td><td>Measurement of NMR</td></tr><tr><td>Lamda 400</td><td>JEOL</td><td></td><td>Measurement of NMR</td></tr><tr><td>PerkinElmer Spectrum 100 FT-IR Spectrometer</td><td>Perkin Elmer</td><td></td><td>Measurement of IR</td></tr><tr><td>JEOL JMS-700</td><td>JEOL</td><td></td><td>Measurement of MS</td></tr><tr><td>PerkinElmer CHN 2400 analyzer</td><td>Perkin Elmer</td><td></td><td>Measurement of elemental analysis</td></tr><tr><td>JASCO P-1030 digital polarimeter</td><td>JASCO</td><td></td><td>Measurement of optical rotation</td></tr><tr><td>JASCO PU-2089 Plus intelligent HPLC pump</td><td>JASCO</td><td></td><td>For HPLC</td></tr><tr><td>Jasco UV-2075 Plus Intelligent UV/Vis Detector</td><td>JASCO</td><td></td><td>For HPLC</td></tr><tr><td>Rheodyne Model 7125 Injector</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>58826</td><td>For HPLC</td></tr><tr><td>Chromatopac C-R8A</td><td>Shimadzu</td><td></td><td>For HPLC</td></tr><tr><td>Senshu Pak Pegasil ODS</td><td>Senshu Scientific</td><td></td><td>For HPLC</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;p&lt;/em&gt;-Toluenesulfenyl&amp;nbsp;chloride</td><td></td><td></td><td>Prepared&amp;nbsp; Ref. 38</td></tr><tr><td>Phenyl 6-O-acetyl-2,3,4-tri-&lt;em&gt;O&lt;/em&gt;-benzyl-1-thio-a-D-mannopyranoside (a-&lt;strong&gt;9&lt;/strong&gt;)</td><td></td><td></td><td>Prepared&amp;nbsp; Ref. 52</td></tr><tr><td>4-Metylphenyl 2,3,4,6-tetra-&lt;em&gt;O&lt;/em&gt;-benzoyl-1-thio-b-D-galactopyranoside (b-&lt;strong&gt;21&lt;/strong&gt;)</td><td></td><td></td><td>Prepared&amp;nbsp; Ref. 53</td></tr><tr><td>4-Metylphenyl 2,3,4,6-tetra-&lt;em&gt;O&lt;/em&gt;-benzoyl-1-thio-b-D-glucopyranoside (b-&lt;strong&gt;31&lt;/strong&gt;)</td><td></td><td></td><td>Prepared&amp;nbsp; Ref. 57</td></tr><tr><td>4-Metylphenyl 2,3,4,6-tetra-&lt;em&gt;O&lt;/em&gt;-benzoyl-1-thio-a-D-Mannopyranoside (a-&lt;strong&gt;32&lt;/strong&gt;)</td><td></td><td></td><td>Prepared&amp;nbsp; Ref. 67</td></tr><tr><td>6-&lt;em&gt;N&lt;/em&gt;-Benzoyladenosine (&lt;strong&gt;14&lt;/strong&gt;)</td><td></td><td></td><td>Prepared&amp;nbsp; Ref. 54</td></tr><tr><td>2-&lt;em&gt;N&lt;/em&gt;-Isobutyrylguanosine (&lt;strong&gt;16&lt;/strong&gt;)</td><td></td><td></td><td>Prepared&amp;nbsp; Ref. 55</td></tr><tr><td>4-&lt;em&gt;N&lt;/em&gt;-Benzoylcytidine (&lt;strong&gt;20&lt;/strong&gt;)</td><td></td><td></td><td>Prepared&amp;nbsp; Ref. 56</td></tr></tbody></table>

regioselective o-glycosylation of nucleosides via the temporary 2',3'-diol protection by a boronic ester for the synthesis of disaccharide nucleosides

Nucleosídeos dissacarídeo, que consistem em metades dissacarídeo e base, foram sabidos como um valioso grupo de produtos naturais, tendo bioactivities variadas. Embora O- glicosilação química é uma estratégia comumente benéfica para sintetizar nucleosídeos dissacarídeo, preparação de substratos tais como glycosyl doadores e aceitadores requer manipulações de grupo protegendo tedioso e uma purificação na cada etapa sintética. Entretanto, diversos grupos de pesquisa relataram que boronic e ésteres de borinic servem como uma proteção ou ativando o grupo dos derivados de carboidratos para atingir a regio e / ou stereoselective de acilação, alquilação, sililação e glicosilação. Neste artigo, vamos demonstrar o procedimento para o regioselective O- glicosilação de desprotegida ribonucleosides utilizando ácido boronic. A esterificação de 2', 3'-diol de ribonucleosides com ácido boronic faz a protecção temporária de diol e, a seguir O- glicosilação com um doador glycosyl na presença de p- toluenesulfenyl licenças trifluormetanosulfonato, cloreto e prata a reação de regioselective do grupo 5'-hidroxila para pagar os nucleosídeos dissacarídeo. Esse método pode ser aplicado a diversos nucleosídeos, tais como a guanosina, adenosina, citidina, uridina, metyluridine-5 e 5-fluorouridine. Este artigo e o vídeo que acompanha representam informações úteis (visuais), para o O- glicosilação de nucleosídeos desprotegidos e seus análogos para a síntese de não só nucleosídeos dissacarídeo, mas também uma variedade de biologicamente relevantes derivados.

Os resultados do - glicosilação de uridina 10 com thiomannoside α -9 estão resumidos na tabela 160,61. Na entrada 1, o O- glicosilação de 10 com α -9 na ausência de derivados do ácido boronic resultou na formação de uma mistura complicada. Na entrada 2, 10 e phenylboronic acid 11a fora...

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Regioselective O-Glycosylation of Nucleosides via the Temporary 2',3'-Diol Protection by a Boronic Ester for the Synthesis of Disaccharide Nucleosides

Aqui, apresentamos os protocolos para a síntese de nucleosídeos dissacarídeo pelo regioselective O- glicosilação de ribonucleosides através de uma protecção temporária de seus 2', 3'-diol partes utilizando um éster cíclico boronic. Este método aplica-se a diversos nucleosídeos desprotegidos como adenosina, guanosina, citidina, uridina, methyluridine-5 e 5-fluorouridine para dar o correspondente nucleosídeos dissacarídeo.

Regioselective O- glicosilação de nucleosídeos através o temporário 2', 3'-Diol proteção por um éster de Boronic para a síntese de dissacarídeo nucleosídeos

Disaccharide nucleosides, which consist of disaccharide and nucleobase moieties, have been known as a valuable group of natural products having ...

regioselective-o-glycosylation-nucleosides-via-temporary-2-3-diol

Research

JoVE Journal

Chemistry

Regioselective O-Glycosylation of Nucleosides via the Temporary 2',3'-Diol Protection by a Boronic Ester for the Synthesis of Disaccharide Nucleosides

8.6K visualizações.  Tokyo University of Science. Aqui, apresentamos os protocolos para a síntese de nucleosídeos dissacarídeo pelo regioselective O- glicosilação de ribonucleosides através de uma protecção temporária de seus 2', 3'-diol partes utilizando um éster cíclico boronic. Este método aplica-se a diversos nucleosídeos desprotegidos como adenosina, guanosina, citidina, uridina, methyluridine-5 e 5-fluorouridine para dar o correspondente nucleosídeos dissacarídeo.

Vídeo: Regioselective O-Glycosylation of Nucleosides via the Temporary 2',3'-Diol Protection by a Boronic Ester for the Synthesis of Disaccharide Nucleosides

Nucleoside Triphosphates - From Synthesis to Biochemical Characterization

The traditional strategy for the introduction of chemical functionalities is the use of solid-phase synthesis by appending suitably modified phosphoramidite precursors to the nascent chain. However, the conditions used during the synthesis and the restriction to rather short sequences hamper the applicability of this methodology. On the other hand, modified nucleoside triphosphates are activated building blocks that have been employed for the mild introduction of numerous functional groups into nucleic acids, a strategy that paves the way for the use of modified nucleic acids in a wide-ranging palette of practical applications such as functional tagging and generation of ribozymes and DNAzymes. One of the major challenges resides in the intricacy of the methodology leading to the isolation and characterization of these nucleoside analogues.
	
	In this video article, we present a detailed protocol for the synthesis of these modified analogues using phosphorous(III)-based reagents. In addition, the procedure for their biochemical characterization is divulged, with a special emphasis on primer extension reactions and TdT tailing polymerization. This detailed protocol will be of use for the crafting of modified dNTPs and their further use in chemical biology.

The protocol described herein aims to explain and abridge the numerous obstacles in the way of the intricate route leading to modified nucleoside triphosphates. Consequently, this protocol facilitates both the synthesis of these activated building-blocks and their availability for practical applications.

Nucleosídeos Trisfosfatos - Da síntese à Caracterização Bioquímica

The  traditional strategy for the introduction of chemical functionalities is the  use of solid-phase synthesis by appending suitably modified ...

Química

Synthesis of Indoxyl-glycosides for Detection of Glycosidase Activities

Indoxyl glycosides proved to be valuable and versatile tools for monitoring glycosidase activities. Indoxyls are released by enzymatic hydrolysis and are rapidly oxidized, for example by atmospheric oxygen, to indigo type dyes. This reaction enables fast and easy screening in vivo without isolation or purification of enzymes, as well as rapid tests on agar plates or in solution (e.g., blue-white screening, micro-wells) and is used in biochemistry, histochemistry, bacteriology and molecular biology. Unfortunately the synthesis of such substrates proved to be difficult, due to various side reactions and the low reactivity of the indoxyl hydroxyl function. Especially for glucose type structures low yields were observed. Our novel approach employs indoxylic acid ester as key intermediates. Indoxylic acid esters with varied substitution patterns were prepared on scalable pathways. Phase transfer glycosylations with those acceptors and peracetylated glycosyl halides can be performed under common conditions in high yields. Ester cleavage and subsequent mild silver mediated glycosylation yields the peracetylated indoxyl glycosides in high yields. Finally deprotection is performed according to Zempl&#233;n.

Indoxyl glycosides are well-established and widely used tools for enzyme screening and enzyme activity monitoring. Especially for glucose type structures previous syntheses proved to be challenging and low yielding. Our novel approach employs indoxylic acid esters as precious intermediates to yield a considerable number of indoxyl glycosides in good yields.

Indoxyl glycosides proved to be valuable and versatile tools for monitoring glycosidase activities. Indoxyls are released by enzymatic hydrolysis and are ...

High-throughput Synthesis of Carbohydrates and Functionalization of Polyanhydride Nanoparticles

Transdisciplinary approaches involving areas such as material design, nanotechnology, chemistry, and immunology have to be utilized to rationally design efficacious vaccines carriers. Nanoparticle-based platforms can prolong the persistence of vaccine antigens, which could improve vaccine immunogenicity1. Several biodegradable polymers have been studied as vaccine delivery vehicles1; in particular, polyanhydride particles have demonstrated the ability to provide sustained release of stable protein antigens and to activate antigen presenting cells and modulate immune responses2-12.
The molecular design of these vaccine carriers needs to integrate the rational selection of polymer properties as well as the incorporation of appropriate targeting agents. High throughput automated fabrication of targeting ligands and functionalized particles is a powerful tool that will enhance the ability to study a wide range of properties and will lead to the design of reproducible vaccine delivery devices.
The addition of targeting ligands capable of being recognized by specific receptors on immune cells has been shown to modulate and tailor immune responses10,11,13 C-type lectin receptors (CLRs) are pattern recognition receptors (PRRs) that recognize carbohydrates present on the surface of pathogens. The stimulation of immune cells via CLRs allows for enhanced internalization of antigen and subsequent presentation for further T cell activation14,15. Therefore, carbohydrate molecules play an important role in the study of immune responses; however, the use of these biomolecules often suffers from the lack of availability of structurally well-defined and pure carbohydrates. An automation platform based on iterative solution-phase reactions can enable rapid and controlled synthesis of these synthetically challenging molecules using significantly lower building block quantities than traditional solid-phase methods16,17.
Herein we report a protocol for the automated solution-phase synthesis of oligosaccharides such as mannose-based targeting ligands with fluorous solid-phase extraction for intermediate purification. After development of automated methods to make the carbohydrate-based targeting agent, we describe methods for their attachment on the surface of polyanhydride nanoparticles employing an automated robotic set up operated by LabVIEW as previously described10. Surface functionalization with carbohydrates has shown efficacy in targeting CLRs10,11 and increasing the throughput of the fabrication method to unearth the complexities associated with a multi-parametric system will be of great value (Figure 1a).

In this article, a high throughput method is presented for the synthesis of oligosaccharides and their attachment to the surface of polyanhydride nanoparticles for further use in targeting specific receptors on antigen presenting cells.

Alta capacidade de síntese de hidratos de carbono e funcionalização de nanopartículas polianidrido

Transdisciplinary approaches involving areas such as material design, nanotechnology, chemistry, and immunology have to be utilized to rationally design ...

Bioengenharia

Chemoselective Modification of Viral Surfaces via Bioorthogonal Click Chemistry

The modification of virus particles has received a significant amount of attention for its tremendous potential for impacting gene therapy, oncolytic applications and vaccine development.1,2,3 Current approaches to modifying viral surfaces, which are mostly genetics-based, often suffer from attenuation of virus production, infectivity and cellular transduction.4,5 Using chemoselective click chemistry, we have developed a straightforward alternative approach which sidesteps these issues while remaining both highly flexible and accessible.1,2
The goal of this protocol is to demonstrate the effectiveness of using bioorthogonal click chemistry to modify the surface of adenovirus type 5 particles. This two-step process can be used both therapeutically1 or analytically,2,6 as it allows for chemoselective ligation of targeting molecules, dyes or other molecules of interest onto proteins pre-labeled with azide tags. The three major advantages of this method are that (1) metabolic labeling demonstrates little to no impact on viral fitness,1,7 (2) a wide array of effector ligands can be utilized, and (3) it is remarkably fast, reliable and easy to access.1,2,7
In the first step of this procedure, adenovirus particles are produced bearing either azidohomoalanine (Aha, a methionine surrogate) or the unnatural sugar O-linked N-azidoacetylglucosamine (O-GlcNAz), both of which contain the azide (-N3) functional group. After purification of the azide-modified virus particles, an alkyne probe containing the fluorescent TAMRA moiety is ligated in a chemoselective manner to the pre-labeled proteins or glycoproteins. Finally, an SDS-PAGE analysis is performed to demonstrate the successful ligation of the probe onto the viral capsid proteins. Aha incorporation is shown to label all viral capsid proteins (Hexon, Penton and Fiber), while O-GlcNAz incorporation results in labeling of Fiber only.
In this evolving field, multiple methods for azide-alkyne ligation have been successfully developed; however only the two we have found to be most convenient are demonstrated herein &#x2013; strain-promoted azide-alkyne cycloaddition (SPAAC) and copper-catalyzed azide-alkyne cycloaddition (CuAAC) under deoxygenated atmosphere.

Adenovirus particles are engineered to contain either the unnatural amino acid analogue azidohomoalanine or the azido sugar O-GlcNAz. The azide group of each is chemoselectively ligated via "click" chemistry reactions as a means of viral surface modification.

Modificação de Superfícies quimiosseletiva virais através Química Clique Bioorthogonal

The modification of virus particles has received a significant amount of attention for its tremendous potential for impacting gene therapy, oncolytic ...

Imunologia e Infecção

Chemo-enzymatic Synthesis of N-glycans for Array Development and HIV Antibody Profiling

We present a highly efficient way for the rapid preparation of a wide range of N-linked oligosaccharides (estimated to exceed 20,000 structures) that are commonly found on human glycoproteins. To achieve the desired structural diversity, the strategy began with the chemo-enzymatic synthesis of three kinds of oligosaccharyl fluoride modules, followed by their stepwise &#945;-selective glycosylations at the 3-O and 6-O positions of the mannose residue of the common core trisaccharide having a crucial &#946;-mannoside linkage. We further attached the N-glycans to the surface of an aluminum oxide-coated glass (ACG) slide to create a covalent mixed array for the analysis of hetero-ligand interaction with an HIV antibody. In particular, the binding behavior of a newly isolated HIV-1 broadly neutralizing antibody (bNAb), PG9, to the mixture of closely spaced Man5GlcNAc2 (Man5) and 2,6-di-sialylated bi-antennary complex type N-glycan (SCT) on an ACG array, opens a new avenue to guide the effective immunogen design for HIV vaccine development. In addition, our ACG array embodies a powerful tool to study other HIV antibodies for hetero-ligand binding behavior.

Chemo-enzymatic Synthesis of N-glycans for Array Development and HIV Antibody Profiling

A modular approach to the synthesis of N-glycans for attachment to an aluminum oxide-coated glass slide (ACG slide) as a glycan microarray has been developed and its use for the profiling of an HIV broadly neutralizing antibody has been demonstrated.

Quimio-enzimático síntese de N- os glicanos para desenvolvimento de matriz e anticorpos de HIV de criação de perfil

We present a highly efficient way for the rapid preparation of a wide range of N-linked oligosaccharides (estimated to exceed 20,000 structures) that are ...

Protocol for the Solid-phase Synthesis of Oligomers of RNA Containing a 2'-O-thiophenylmethyl Modification and Characterization via Circular Dichroism

Solid-phase synthesis has been used to obtain canonical and modified polymers of nucleic acids, specifically of DNA or RNA, which has made it a popular methodology for applications in various fields and for different research purposes. The procedure described herein focuses on the synthesis, purification, and characterization of dodecamers of RNA 5&#39;-[CUA CGG AAU CAU]-3&#39; containing zero, one, or two modifications located at the C2&#39;-O-position. The probes are based on 2-thiophenylmethyl groups, incorporated into RNA nucleotides via standard organic synthesis and introduced into the corresponding oligonucleotides via their respective phosphoramidites. This report makes use of phosphoramidite chemistry via the four canonical nucleobases (Uridine (U), Cytosine (C), Guanosine (G), Adenosine (A)), as well as 2-thiophenylmethyl functionalized nucleotides modified at the 2&#39;-O-position; however, the methodology is amenable for a large variety of modifications that have been developed over the years. The oligonucleotides were synthesized on a controlled-pore glass (CPG) support followed by cleavage from the resin and deprotection under standard conditions, i.e., a mixture of ammonia and methylamine (AMA) followed by hydrogen fluoride/triethylamine/N-methylpyrrolidinone. The corresponding oligonucleotides were purified via polyacrylamide electrophoresis (20% denaturing) followed by elution, desalting, and isolation via reversed-phase chromatography (Sep-pak, C18-column). Quantification and structural parameters were assessed via ultraviolet-visible (UV-vis) and circular dichroism (CD) photometric analysis, respectively. This report aims to serve as a resource and guide for beginner and expert researchers interested in embarking in this field. It is expected to serve as a work-in-progress as new technologies and methodologies are developed. The description of the methodologies and techniques within this document correspond to a DNA/RNA synthesizer (refurbished and purchased in 2013) that uses phosphoramidite chemistry.

Protocol for the Solid-phase Synthesis of Oligomers of RNA Containing a 2'-O-thiophenylmethyl Modification and Characterization via Circular Dichroism

This article provides a detailed procedure on the solid-phase synthesis, purification, and characterization of dodecamers of RNA modified at the C2&#39;-O-position. UV-vis and circular dichroism photometric analyses are used to quantify and characterize structural aspects, i.e., single-strands or double-strands.

Protocolo para síntese de fase sólida de oligómeros de ARN contendo um 2&#39;-<em&gt; O</em&gt; -tiofenilmetilo Modificação e Caracterização através do Dicroísmo Circular

Solid-phase synthesis has been used to obtain canonical and modified polymers of nucleic acids, specifically of DNA or RNA, which has made it a popular ...

Hierarchical and Programmable One-Pot Oligosaccharide Synthesis

This article presents a general experimental protocol for programmable one-pot oligosaccharide synthesis and demonstrates how to use Auto-CHO software for generating potential synthetic solutions. The programmable one-pot oligosaccharide synthesis approach is designed to empower fast oligosaccharide synthesis of large amounts using thioglycoside building blocks (BBLs) with the appropriate sequential order of relative reactivity values (RRVs). Auto-CHO is a cross-platform software with a graphical user interface that provides possible synthetic solutions for programmable one-pot oligosaccharide synthesis by searching a BBL library (containing about 150 validated and &#62;50,000 virtual BBLs) with accurately predicted RRVs by support vector regression. The algorithm for hierarchical one-pot synthesis has been implemented in Auto-CHO and uses fragments generated by one-pot reactions as new BBLs. In addition, Auto-CHO allows users to give feedback for virtual BBLs to keep valuable ones for further use. One-pot synthesis of stage-specific embryonic antigen 4 (SSEA-4), which is a pluripotent human embryonic stem cell marker, is demonstrated in this work.

This protocol demonstrates how to use the Auto-CHO software for hierarchical and programmable one-pot synthesis of oligosaccharides. It also describes the general procedure for RRV determination&#160;experiments and one-pot glycosylation of SSEA-4.

Síntese de Oligosacárido de um pote programável e hierárquica

This article presents a general experimental protocol for programmable one-pot oligosaccharide synthesis and demonstrates how to use Auto-CHO software for ...

Synthesis of Information-bearing Peptoids and their Sequence-directed Dynamic Covalent Self-assembly

This protocol presents the use of Lewis acidic multi-role reagents to circumvent kinetic trapping observed during the self-assembly of information-encoded oligomeric strands mediated by paired dynamic covalent interactions in a manner mimicking the thermal cycling commonly employed for the self-assembly of complementary nucleic acid sequences. Primary amine monomers bearing aldehyde and amine pendant moieties are functionalized with orthogonal protecting groups for use as dynamic covalent reactant pairs. Using a modified automated peptide synthesizer, the primary amine monomers are encoded into oligo(peptoid) strands through solid-phase submonomer synthesis. Upon purification by high-performance liquid chromatography (HPLC) and characterization by electrospray ionization mass spectrometry (ESI-MS), sequence-specific oligomers are subjected to high-loading of a Lewis acidic rare-earth metal triflate which both deprotects the aldehyde moieties and affects the reactant pair equilibrium such that strands completely dissociate. Subsequently, a fraction of the Lewis acid is extracted, enabling annealing of complementary sequence-specific strands to form information-encoded molecular ladders characterized by matrix assisted laser desorption/ionization mass spectrometry (MALDI-MS). The simple procedure outlined in this report circumvents kinetic traps commonly experienced in the field of dynamic covalent assembly and serves as a platform for the future design of robust, complex architectures.

A protocol is presented for the synthesis of information-encoded peptoid oligomers and for the sequence-directed self-assembly of these peptoids into molecular ladders using amines and aldehydes as dynamic covalent reactant pairs and Lewis acidic rare-earth metal triflates as multi-role reagents.

Síntese de Peptoides portadores de informações e sua Auto-montagem Dinâmica Covalent e dirigida por sequência

This protocol presents the use of Lewis acidic multi-role reagents to circumvent kinetic trapping observed during the self-assembly of information-encoded ...

Chemical Triphosphorylation of Oligonucleotides

The 5&#8242;-triphosphate is an essential nucleic acid modification found throughout all life and increasingly used as a functional modification of oligonucleotides in biotechnology and synthetic biology. Oligonucleotide 5&#8242;-triphosphates have historically been prepared in vitro by enzymatic methods. However, these methods are limited to natural RNA oligonucleotides, have strong sequence preferences, and tend to produce heterogeneous products. New methods of chemical triphosphorylation complement both the reduced cost of automated oligonucleotide synthesis by phosphoramidite chemistry and the diverse range of nucleotide modifications now available. Thus, the synthesis of oligonucleotide triphosphates of arbitrary sequence and length, and optionally containing various nonnatural modifications, is now accessible.
This paper presents the appropriate methods and techniques for chemical triphosphorylation of oligonucleotides using salicyl phosphorochloridite and pyrophosphate. This method uses commercially available reagents, is compatible with most oligonucleotides prepared by standard solid-phase synthesis methods, and can be completed in 2 h following oligonucleotide synthesis, before deprotection and purification. Two uses of chemically triphosphorylated oligonucleotides as substrates for catalytic RNA enzymes are demonstrated, including the synthesis of a mirror-image version of the hammerhead ribozyme from nonbiological L-RNA triphosphates.

Oligonucleotide 5&#8242;-triphosphates are ubiquitous components in essential biological pathways and have seen increasing use in biotechnology applications. Here, we describe techniques for the routine synthesis and purification of oligonucleotide 5&#8242;-triphosphates, starting from oligonucleotides prepared by standard automated synthesis techniques.

Triphosforilação química de Oligonucleotídeos

The 5&#8242;-triphosphate is an essential nucleic acid modification found throughout all life and increasingly used as a functional modification of ...

<meta charset="utf8"></head><body>Microscopia de expansão para visualização de glicanos sialilados intracelulares via MOE

Visualizing Intracellular Sialylation with Click Chemistry and Expansion Microscopy

Metabolic labeling techniques allow the incorporation of bioorthogonal reporters into glycans, enabling the targeted bioconjugation of molecular dyes within cells through click and bioorthogonal chemistry. Metabolic oligosaccharide engineering (MOE) has attracted considerable interest due to the essential role of glycosylation in numerous biological processes that involve molecular recognition and its impact on pathologies ranging from cancer to genetic disorders to viral and bacterial infections.
Although MOE is better known for the detection of cell surface glycoconjugates, it is also a very important methodology for the study of intracellular glycans in physiological and pathological contexts. Such studies greatly benefit from high spatial resolution. However, super-resolution microscopy is not readily available in most laboratories and poses challenges for daily implementation. Expansion microscopy is a recent alternative that enhances the resolution of microscopy by physically enlarging biological specimens labeled with fluorescent markers. By embedding the sample in a swellable gel and causing it to expand isotropically through chemical treatment, subcellular structures can be visualized with enhanced precision and resolution without the need for super-resolution techniques.
In this work, we illustrate the capacity of expansion microscopy to visualize intracellular sialylated glycans through the combined use of MOE and click chemistry. Specifically, we propose a procedure for bioorthogonal labeling and expansion microscopy that employs a reporter targeting sialylation, which may be associated with immunofluorescence for co-localization studies. This protocol enables localization studies of sialoconjugate biosynthesis, intracellular trafficking, and recycling.

<meta charset="utf8"></head><body>Visualização da Sialilação Intracelular com Química Click e Microscopia de Expansão

Here, we propose a simple protocol combining metabolic oligosaccharide engineering, click chemistry, and expansion microscopy that allows bioimaging of intracellular sialylated N-glycoproteins with improved resolution using routine microscopy equipment.

Visualização da Sialilação Intracelular com Química Click e Microscopia de Expansão

Metabolic labeling techniques allow the incorporation of bioorthogonal reporters into glycans, enabling the targeted bioconjugation of molecular dyes ...