Este método pode ajudar a responder a perguntas-chave sobre o tratamento baseado em células-tronco de neuropatias periféricas, particularmente para neuropatia laríngea recorrente equina. As principais vantagens dessa técnica são que a colheita de células-tronco é minimamente invasiva, e que o método de injeção também pode ser transferido para outras neuropatias periféricas. As implicações dessa técnica se estendem a outros estudos de outros tipos de células, já que as células-tronco podem ser diferenciadas em outras células de interesse antes da injeção.
A demonstração visual deste método é crítica, pois o controle endoscópico em vídeo dos movimentos laríngeos e a manipulação das técnicas estimuladoras nervosas podem ser difíceis de aprender. Identifique o local da amostra na cabeça longa do músculo tríceps por inspeção visual e palpação, cerca de linha média entre o ponto do cotovelo e o ponto do ombro. Use cortadores elétricos para raspar uma área de aproximadamente dois por dois centímetros, e aplique um esfoliante cirúrgico composto por sabão líquido de poli-iodeto e compressas de álcool por um minuto à pele exposta.
Usando uma agulha de calibre 25, injete subcutâneamente um mililitro de solução de lidocaína de 2% no centro da área desinfetada. Depois de desinfetar com sabão antibacteriano limpo e vestir luvas estéreis, coloque uma agulha de biópsia semiautomática de calibre 14 em uma cortina estéril descartável e puxe o mecanismo de mola para armar a agulha. Monte uma cânula e obturador na posição trancada para formar um trochar, e introduza o trochar perpendicularmente através da pele dessensibilizada, aproximadamente 1,5 centímetros no tecido muscular subjacente.
Em seguida, remova o trochar e coloque o obturador em uma cortina estéril. Introduza a agulha através da cânula. Em seguida, introduza a agulha e a cânula através da incisão da pele no músculo, até que a ponta da agulha esteja no meio da cabeça longa do músculo tríceps.
Em seguida, solte a agulha de biópsia, puxe a agulha e a cânula para fora do músculo juntos, e remova a agulha da cânula. Puxe a mola com uma mão enquanto segura a agulha com a outra mão, até que o espécime se torne visível na ponta da agulha de biópsia. Com a ajuda de um assistente, abra um tubo de amostra contendo o meio amostral, e use uma agulha hipodérmica de calibre 19 para transferir a pequena peça muscular da agulha de biópsia para o meio amostral.
Feche o tubo com a tampa do parafuso e incline suavemente o tubo duas vezes para garantir que a amostra esteja flutuando no meio. Em seguida, rearquivar a agulha de biópsia e reintroduzir a cânula através da incisão da pele para coletar mais duas a três amostras até que aproximadamente 20 miligramas de tecido muscular tenha sido adquirido. Para injetar as células, depois de aquecer a suspensão celular à temperatura ambiente, aspire um mililitro de células em uma seringa de dois mililitros e confirme que o cavalo está na posição de cabeça para baixo que é indicativo de sedação total.
Em seguida, corte uma área de vinte por dez centímetros sobre a região laríngea esquerda, e aplique um esfoliante cirúrgico de sabão de poli-iodeto e álcool na região exposta. Coloque um endoscópio de vídeo padrão flexível através da nare esquerda do cavalo em direção à naofaringe, ajustando a posição do endoscópio até que uma visão completa das cartilagens aritóides e da epiglote seja obtida. Conecte a agulha de injeção de estimulação ao eletrodo negativo do estimulador nervoso.
Conecte a seringa que contém a suspensão celular à linha de injeção e pré-encha o tubo para retirar o ar do sistema. Conecte o eletrodo positivo do estimulador nervoso a um patch de eletrodo que ficará preso à área da pele exposta. Carregue uma seringa com um volume de solução salina estéril igual ao volume pré-preenchido do tubo, e introduza a agulha de injeção de estimulação em direção ao aspecto dorsolateral da laringe, iniciando o estimulador nervoso no modo de estimulação hertz, com uma corrente de dois miliamperes ao se aproximar do aspecto lateral dorsal da laringe.
Mova suavemente a agulha em direção ao nervo laríngeo recorrente. Assim que o movimento de abdução da cartilagem aritóide esquerda for visível, reduza a corrente, até que o movimento desapareça, mantendo a agulha no lugar. Quando for observada uma perda de resposta motora a 0,5 miliamperes, mantenha a posição da agulha e injete um mililitro das células-tronco autólogas, seguida por todo o volume de soro fisiológico pré-preparado.
Mantenha a agulha em posição estável durante este processo, pois a distância aos nervos é controlada pelas correntes que produzem uma resposta motora e pequenos movimentos da agulha podem produzir uma perda repentina de resposta. Em seguida, remova a agulha e o endoscópio, e permita que o cavalo se recupere com monitoramento. Em estudos anteriores, não foram observadas reações adversas durante ou após a amostragem, nem qualquer inflamação foi observada durante ou após a estimulação ou a injeção das células-tronco.
Além disso, não há diferenças entre os escores pré-injeção das funções laríngeas, e os escores obtidos nos dias um, sete e 28 após a injeção de células-tronco terem sido medidos. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar que o procedimento de coleta de células-tronco não é invasivo e permite a cultura de um grande número de células-tronco mesenquimais autólogas em um curto espaço de tempo. Após esse procedimento, outros métodos, como a injeção de células pré-diferenciadas, podem ser realizados para responder a perguntas adicionais sobre se as células Schwann são mais propensas a contribuir para a determinação dos nervos.
Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores da medicina regenerativa explorarem o uso de células-tronco na Neuropatia Laríngea Recorrente Equina.
