Apresentamos pela primeira vez o iSCAT em 2004 no contexto de detecção e espectroscopia de nanopartículas de ouro. Nos 10 anos que se seguiram, desenvolvemos essa técnica ainda mais para detecção e rastreamento de nanopartículas biológicas como vírus e pequenas proteínas. A essência da técnica é que qualquer objeto material, por menor que seja, tem uma seção transversal de extinção finita.
A principal vantagem dessa técnica é a detecção sem rótulos. Isso significa que se formos sensíveis o suficiente, podemos detectar qualquer coisa, como proteínas ou exosóis secretados de células únicas. A questão que é preciso ter cuidado é como tratar o fundo de dispersão.
Uma grande vantagem de um microscópio iSCAT é que ele pode ser completamente construído em casa e pode ser adicionado a um microscópio comercial existente. Isso significa que ele pode ser facilmente combinado com outras técnicas ópticas, como a fluorescência, e esta é uma das razões pelas quais muitos grupos também estão agora empregando iSCAT e técnicas relacionadas. Aqui utilizamos as células LUZ como um sistema modelo para mostrar a detecção de proteínas individuais e secretas.
No entanto, este método também pode ser aplicado para sondar quase qualquer processo biológico a nível molecular. Para alcançar um microscópio estável, comece com uma tabela óptica amortecido e um bloco maciço rígido para o estágio amostral. Construa um estágio amostral de microscópio que incorpore um objetivo de abertura numérica elevada e uma unidade de tradução que permita a tradução lateral da amostra, bem como a mudança de posição de foco para o objetivo.
Use um espelho de acoplamento vertical de 45 graus e uma lente singlet de 50 centímetros para concentrar a luz de um laser de diodo no comprimento de onda 445 nanômetros no plano focal traseiro do objetivo. Esta lente de campo largo cria um feixe colidido no foco dianteiro do objetivo, que se tornará a fonte de iluminação iSCAT. Aplique uma gota de óleo de imersão ao objetivo e coloque uma mancha de vidro no plano amostral do estágio do microscópio.
Isso resultará em um feixe que reflete de volta através do objetivo de imagem. Para configurar o caminho de imagem, introduza um feixe revestido anti-reflexão em um ângulo de 45 graus em relação ao feixe de incidente e aproximadamente 10 centímetros após a lente de campo largo. Certifique-se de que o revestimento anti-reflexão aponta para a fonte de laser.
Preste atenção, pois um feixe espesso introduzirá deslocamento significativo do feixe para que o laser não entre mais na reta objetiva. Se necessário, realinhe o caminho do feixe de laser antes do feixe para garantir a propagação correta através do objetivo. Para garantir que o plano de amostra e a câmera sejam parfocal, comece colocando uma lente côncava com uma distância focal negativa de 45 centímetros em uma posição de cinco centímetros após a lente de campo largo no caminho do feixe incidente.
Isso resultará em um feixe colidido entrando na abertura traseira do objetivo. Com a tela colocada no braço reflexivo do interferômetro, mova o objetivo na direção vertical para encontrar a posição focal grosseira. O objetivo está em foco quando o feixe que bate na tela é colidido.
Remova tanto a lente de distância focal negativa quanto a tela quando o foco grosseiro estiver concluído. Adicione uma segunda lente de singlet de comprimento focal de 50 centímetros para focar a luz dispersa e para colidir a luz refletida. Certifique-se de que a lente seja colocada a 50 centímetros do plano focal traseiro do objetivo para que o raio laser transmitido seja colidido novamente.
Para completar o conjunto de configuração iSCAT, coloque a câmera CMOS a 50 centímetros de distância da lente de distância focal de 50 centímetros e posicione o feixe diretamente no meio do chip. Para configurar canais de imagem adicionais, acople a saída de uma fonte de luz LED em um objetivo de longa distância de trabalho. Instale componentes mecânicos acima da câmara de amostra que permitam o foco e o posicionamento lateral da saída led na amostra.
Mova o objetivo superior lateralmente para que o objetivo do campo superior e o objetivo inferior do iSCAT sejam colinear. Isso é determinado colocando uma tela sob o objetivo inferior e maximizando a intensidade da luz LED transmitida na tela. Agora, coloque um espelhodicrómico de passagem curta de 550 nanômetros para dividir a luz LED transmitida do caminho laser iSCAT.
Divida este feixe em dois canais com um 8% reflexivo, 92% transmissivo, transmissor. O caminho de 92% é o canal de fluorescência, e o caminho de 8% é usado para imagens de campo brilhante. Imagem do canal brightfield em uma câmera CMOS usando uma lente de comprimento duplo acromático de comprimento focal de cinco centímetros.
Imagem do canal de fluorescência em uma câmera CMOS separada usando uma lente de dois metros de comprimento focal de cinco centímetros. Além disso, use um filtro de passagem longa de 600 nanômetros para bloquear a luz de excitação. Para configurar o computador e o software, conecte todas as câmeras a um computador.
Na configuração totalmente montada, observe a imagem iSCAT na câmera CMOS e certifique-se de que ela está em foco, encontrando uma poeira residual ou partícula de sujeira na mancha de vidro. Verifique se a imagem da partícula é uma função de propagação de ponto circularmente simétrico. A função de propagação de ponto não terá uma forma circular se o raio laser entrar no objetivo do microscópio em um ângulo leve.
Isso pode ser corrigido por um pequeno ajuste do espelho de 45 graus para garantir o acoplamento reto no objetivo. Compare as imagens da câmera do campo brilhante e dos canais de fluorescência. Certifique-se de que ambos estão em foco e exiba a mesma área por meio de uma imagem de uma amostra fluorescente ou celular.
Verifique se a posição do laser iSCAT está aproximadamente no centro da imagem e tome nota de sua posição para referência posterior. Para mudar a posição e o campo de visão do campo brilhante e do canal de fluorescência, mova as câmeras sobre a mesa em relação às lentes de foco. Prepare-se para o experimento conforme detalhado no protocolo de texto.
Isso inclui a preparação das células e do meio de microscopia, bem como a amostra de microscópio cuvette. Certifique-se de que o raio laser está bloqueado para evitar que as células sejam diretamente expostas à luz laser iSCAT. Injete aproximadamente três microliters da amostra de célula preparada ligeiramente fora do centro na amostra cuvette.
Toque suavemente na ponta da pipeta na tampa e injete lentamente a solução celular. Deixe as células se acomodarem na tampa. Verifique o número de células próximas ao laser iSCAT.
Se o número de células for muito baixo, repita esta etapa até que um número suficiente esteja disponível. Se a cobertura das células for muito densa, use uma injeção de aproximadamente 20 microliters de meio de microscopia adicional para dispersar as células através do deslizamento. Usando o estágio de tradução piezoelétrica, mova a amostra lateralmente para posicionar uma célula próxima ao campo de visão iSCAT.
Certifique-se de que a célula não entre no campo de visão iSCAT, pois a exposição direta à luz laser de 445 nanômetros pode ser prejudicial para a célula. Desbloqueie o raio laser iSCAT e certifique-se de que a superfície do deslizamento ainda esteja em foco. Inclua a mesa de isolamento para minimizar a deriva e o acoplamento acústico do ambiente.
Inicie a medição adquirindo imagens das câmeras iSCAT, brightfield e fluorescence. Verifique periodicamente a viabilidade da célula e o foco do sistema. Aqui, o software de microscópio auto-escrito é usado para exibir as imagens da câmera.
Aqui, a imagem diferencial é realizada em tempo real por subtração de quadros consecutivos para tornar as ligações proteicas visíveis. Isso resulta em uma imagem filtrada que é visível na tela juntamente com a imagem da câmera bruta. Os resultados representativos de um experimento de secreção celular realizado com o iSCAT são mostrados aqui.
O vídeo mostra secreções de uma célula LAZ ao longo de dois minutos. Imagens diferenciais do iSCAT à esquerda visualizam a absorção de proteínas únicas na tampa. As imagens de brightfield e o canal de fluorescência à direita são usados para monitorar a viabilidade celular.
Este histograma mostra as proteínas detectadas e sua faixa de contraste dentro desse período de dois minutos. Os dados foram coletados analisando eventos de vinculação individuais em cada quadro dos dados de vídeo iSCAT usando um algoritmo de busca de pico personalizado. A microscopia ISCAT não é apenas uma ferramenta poderosa na biosensagem, mas também na microscopia, porque permite a detecção livre de rótulos de nanoí objetos em tempo real.
Em particular, pode ser aplicado a uma variedade de processos, como difusão e transporte de proteínas. Devido à sua sensibilidade requintada à dispersão de luz, o iSCAT pode detectar qualquer proteína ou entidade no campo de visão. Claro, isso também significa que a técnica não tem a especificidade que a fluorescência traz junto, mas para contornar essa questão, pode-se aplicar métodos adicionais como a funcionalização da superfície para detectar proteínas específicas de interesse.
Não se esqueça que trabalhar com lasers pode ser perigoso, e a proteção ocular apropriada deve ser sempre usada ao montar e ajustar o microscópio. A detecção em tempo real de secretomes é muito emocionante e um grande salto no diagnóstico médico, que atualmente requer muito mais tempo e está muito longe da sensibilidade de proteína única. Ainda há muito espaço para melhorar o desempenho do método e ampliar suas aplicações.
Portanto, esperamos que este vídeo ajude outros grupos a se juntar a este esforço emocionante.
