Este método permite o cultivo de três espécies diferentes de bactérias magnetotacticas chamadas MSR-1, AMB-1 e MS-1. Todas as espécies de água doce, e todas do gênero magnetospirillum. É um primeiro passo essencial para qualquer tipo de pesquisa reprodutível envolvendo esses organismos.
As bactérias magnetotacticas têm requisitos de oxigênio muito específicos, e é por isso que desenvolveram um sistema de navegação magnética. Por isso, é muito importante controlar a quantidade de oxigênio disponível para eles. Todo este protocolo foi otimizado para algumas cepas específicas de magnetospirilla de água doce.
Seus detalhes podem ser otimizados para acomodar os requisitos de oxigênio e nutrientes de outras bactérias magnetotacticas. Instale com segurança um tanque de gás nitrogênio perto de um banco no qual há espaço suficiente para configurar a estação de nitrogênio. Conecte um pedaço de tubo ao tanque que é tempo suficiente para chegar à área onde a estação será construída.
Se necessário, aplique fita Teflon na saída do tanque para evitar qualquer vazamento. Para construir uma estação capaz de borbulhar cinco garrafas de meio ao mesmo tempo, corte quatro pedaços de tubulação de aproximadamente cinco centímetros de comprimento. Monte os pedaços de tubo em uma linha com três encaixes plásticos em forma de T de 3 vias.
Conecte uma extremidade desta linha ao pedaço de tubo na saída do tanque de nitrogênio através de um encaixe extra em forma de T. Adicione um encaixe de cotovelo de 90 graus na outra extremidade. Use fita adesiva para anexar a estrutura a uma haste metálica horizontal colocada aproximadamente 30 centímetros acima do banco.
Conecte cinco pedaços de tubulação de aproximadamente 20 centímetros de comprimento às três saídas dos encaixes instalados. Remova os pistões de cinco seringas plásticas de um mililitro e corte a extremidade maior dessas seringas, mantendo apenas a parte graduada. Encha essas seringas com algodão, tomando cuidado para não embalar muito bem.
Insira as seringas nos pedaços verticais de tubo de 20 centímetros de comprimento. Ligue o gás e use água com sabão para garantir que não haja vazamento quando o nitrogênio estiver fluindo. Remova as tampas de cinco agulhas de calibre 25 e insira essas agulhas em pedaços de 10 centímetros de tubulação fina.
Coloque as agulhas preparadas nas seringas da estação de nitrogênio. Certifique-se de que o nitrogênio está fluindo através das cinco linhas, e mantenha a estação em espera. Prepare uma solução de citrato ferrico de 10 mililitros adicionando 0,245 gramas de citrato férrico a 100 mililitros de água destilada desionizada.
Aqueça e mexa para dissolver até obter uma solução laranja clara. Autoclave a solução usando um ciclo padrão de pelo menos 15 minutos de exposição a 121 graus Celsius antes de armazenar a solução de estoque esterilizada à temperatura ambiente no escuro. Para preparar cinco garrafas de meio de crescimento líquido para MSR-1, adicione os produtos químicos listados em um protocolo de texto a um béquer contendo 300 mililitros de água destilada desofilada.
A adição do citrato estéril e das soluções minerais deve ser realizada sob a chama de um queimador Bunsen usando técnicas estéreis. Condições estéreis são essenciais para evitar a contaminação da cultura por outras espécies bacterianas. Após a adição de todos os produtos químicos, ajuste o pH para 7.0 com uma solução de hidróxido de sódio molar.
Distribua o meio recém-preparado em garrafas de soro de 125 mililitros, despejando 60 mililitros de meio em cada garrafa. Bolha de nitrogênio no meio por 30 minutos para remover o oxigênio dissolvido usando o pequeno tubo conectado à estação de nitrogênio. Coloque uma rolha de borracha de butyl em cima de cada garrafa, deixando uma pequena abertura para permitir que o excesso de gás saia da garrafa.
Após 30 minutos, sele cada garrafa com a rolha preparada e um selo de alumínio. O selo de alumínio garante que a garrafa permaneça selada durante o resto do protocolo. Desconecte as agulhas e o tubo fino da estação de nitrogênio e substitua-as por agulhas limpas.
Ajuste as válvulas do tanque de nitrogênio para que um fluxo suave e contínuo de gás saia do tanque. Agora, insira uma das agulhas conectadas ao tanque de nitrogênio em uma garrafa de meio através da rolha de borracha. Insira imediatamente outra agulha limpa na mesma garrafa.
Repita este passo para as outras garrafas e deixe o nitrogênio fluir por cerca de 30 minutos para substituir o ar nas garrafas por nitrogênio. Após 30 minutos, desconecte uma garrafa da estação de nitrogênio removendo a agulha correspondente. Aguarde alguns segundos até que a pressão na garrafa de médio diminua para pressão atmosférica e remova a segunda agulha.
Repita este passo para todas as garrafas restantes. Para preparar 120 mililitros de meio de crescimento semisólida para MSR-1, cubra o béquer com papel alumínio e autoclave a solução preparada conforme descrito no protocolo de texto. Pouco antes do fim do ciclo da autoclave, prepare uma nova solução de cisteína de 4% e ajuste o pH para 7.0 com uma solução de hidróxido de sódio molar de cinco molares, conforme descrito no protocolo de texto.
Depois de autoclaving, deixe o meio esfriar até 50 a 60 graus Celsius, e leve o béquer sob a chama de um queimador bunsen. Remova a folha de alumínio e adicione rapidamente os produtos químicos listados no protocolo de texto usando técnicas estéreis enquanto mexe suavemente. Adicione 1,2 mililitros de solução de cisteína esterilizada por filtro.
Após a adição de todos os produtos químicos, transfira o meio quente para tubos de chave estéril de 16 mililitros. Transfira 12 mililitros do meio para cada tubo e sele os tubos. Para inocular as cepas MSR-1, AMB-1 e MS-1 em meio líquido, inflama os topos do oxigênio e garrafas médias frescas aplicando etanol nas rolhas e passando-os através da chama de um queimador Bunsen.
Usando uma seringa estéril e uma agulha, extraia um mililitro de oxigênio da garrafa de oxigênio e transfira-o para a garrafa média fresca. Se usar o inóculo de outra cultura cultivada em uma garrafa de vidro, inflama as duas garrafas. Em seguida, inocular um mililitro da cultura mais antiga para o meio fresco.
Incubar a cultura a 32 graus Celsius, e inocula-a em meio fresco após quatro a sete dias. Para inocular o MSR-1 no gradiente de oxigênio, meio semisólido, verifique se o tubo de meio fresco exibe um OAI bem definido, materializado por uma interface rosa a incolor cerca de um a três centímetros abaixo da superfície do meio. Se o inóculo vem de outra cultura semisódica gradiente de concentração de oxigênio, colmeia as bactérias aspirando 50 microliters da cultura com uma ponta de pipeta estéril colocada na faixa formada pela bactéria.
Inocular lentamente essas bactérias no OAI no meio fresco, evitando perturbar a interface. Sele o tubo e deixe as bactérias crescerem entre 25 graus Celsius e 30 graus Celsius. Para garantir que as bactérias sejam magnéticas e modais, coloque uma gota de cultura no deslizamento da tampa do microscópio.
Gire o deslizamento da tampa e instale-o em um anel O descansando em um slide de vidro. Certifique-se de que a gota não toque no slide inferior. Coloque a gota pendurada sob um microscópio e concentre-se em uma borda da gota.
Coloque o polo sul de um ímã perto dessa borda, e observe as bactérias nadarem em direção à borda. Vire o ímã para fazê-los nadar na direção oposta. Aqui são mostradas as garrafas de mídia líquida antes da inoculação e após o crescimento bacteriano.
A turbidez na segunda garrafa indica que as bactérias estão crescendo. Este filme duas vezes acelerado mostra o resultado esperado de um experimento de queda suspensa para uma cultura de bactérias magnetotacticas modais e magnéticas. As bactérias inicialmente nadaram em direção à borda da gotícula quando um campo magnético é aplicado.
Quando a direção do campo do ímã é invertida, as bactérias nadaram para longe da borda onde o campo magnético é aplicado. Aqui são mostrados tubos de meio semisólido antes da inoculação e após o crescimento bacteriano. Como esperado, um grupo de bactérias se forma na interface oxico-anoxic e migra ao longo do tempo à medida que o oxigênio é consumido e a interface se move para cima.
Mostrado aqui é um micrografo eletrônico representativo de um espi trilhão magnético. A flagela é indicada pelas setas negras, enquanto as setas vermelhas mostram os magnetosmos. Ao tentar este procedimento, é muito importante lembrar que as bactérias magnetotacticas têm requisitos muito específicos de nível de oxigênio, a fim de crescer adequadamente e produzir magnetosome.
Este protocolo mostra como controlar e monitorar os níveis de oxigênio na mídia de crescimento, a fim de alcançar as micro condições preferidas por esses organismos. Seguindo este método, altas concentrações de células saudáveis e altamente magnéticas podem ser obtidas. Dessa forma, podem ser realizados experimentos que requerem grandes quantidades de bactérias, como extração magnetômica, estudos genômicos e genéticos, ou observação do movimento coletivo por microscopia.
A possibilidade de cultivar bactérias magnetotacticas em laboratório é realmente o que permitiu aos cientistas explorar de forma sistemática as fascinantes propriedades bioquímicas e físicas desses organismos.
