Este método pode ajudar a classificar subtipos neuronais e estender nossa compreensão do mapa funcional dos circuitos corticais. Este protocolo foi otimizado para preservar a ultraestrutura dos neurônios e obter excelente recuperação de arbores dendríticas e axionais, permitindo reconstruções de alta qualidade. No final de uma gravação eletrofisiológica, transfisiológico, transfira a fatia contendo a célula gravada para um pequeno prato de ACSF.
Enquanto trabalha em um capô de fumaça, enrole a fatia em um pequeno pedaço de papel filtro de qualidade fina e coloque outro pedaço de papel filtro umedecido sobre a fatia. Coloque o tecido em um pequeno pote plástico contendo 5 a 10 mililitros de solução fixa e armazene a quatro graus Celsius durante a noite. No dia seguinte, transfira o tecido do recipiente com solução fixa para um recipiente com dois mililitros de tampão de fosfato molar de 0,1 molar para enxaguar e corte qualquer excesso de tecido com uma lâmina de bisturi.
Remova o excesso de tecido colocando a fatia em uma placa de Petri, e corte o excesso de tecido com uma lâmina de bisturi. Transfira o tecido aparado para uma placa de Petri limpa, garantindo que ele fique liso sem dobras ou vincos. Remova o excesso de tampão usando uma escova de tinta seca.
Cubra o tecido com solução de gelatina quente e coloque a placa de Petri em um bloco congelado para esfriar rapidamente a solução. Em seguida, mova o prato de definição de gelatina para 4 graus Celsius por 30 a 60 minutos. Em um capô de fumaça, use uma lâmina de bisturi para cortar um pequeno bloco de 1 X 1 centímetro contendo o tecido embutido da gelatina.
Levante o bloco usando uma pequena espátula e transfira cuidadosamente para uma solução fixativa fresca. Deixe fixar por pelo menos 30 minutos a quatro graus Celsius. Após esta segunda fixação, lave o bloco de gelatina em cinco mililitros de PB três vezes.
Depois de lavar, seque o bloco usando um pedaço de tecido de papel. Em seguida, use uma pequena quantidade de cola cianoacrilato para furar o bloco, orientado com o tecido na parte superior, em um caminhão vibratome usando super cola. Sele a fatia a 50 mícrons de espessura usando um vibratome e coloque cada seção cuidadosamente em um frasco de vidro contendo 10% de sacarose.
Após a secção, pegue cuidadosamente uma seção do frasco e coloque-a plana em uma tampa de placa de Petri. Em seguida, use uma lâmina de bisturi fresco para remover a gelatina ao redor da seção. Coloque as seções em um frasco contendo 2 mililitros de sacarose fresca de 10% na PB, e agitar por 10 minutos para iniciar o processo de crioproteção.
Após a crioproteção, coloque as seções planas sobre um pequeno retângulo de papel alumínio usando uma escova de tinta. Remova qualquer excesso de líquido das seções e dobre cuidadosamente a folha em uma parcela. Segure a folha de alumínio perto da superfície do nitrogênio líquido sem tocar na superfície por 30 segundos.
E então permitir que as seções descongelem completamente por aproximadamente 30 segundos. Repita o congelamento mais duas vezes. Remova todas as seções da folha com um pincel e coloque-as em um frasco de vidro contendo dois mililitros de PB para lavar o excesso de sacarose sob agitação constante.
Depois de imunostaining para imagens de fluorescência, coloque o slide em uma placa de vidro Petri contendo PBS, e remova cuidadosamente o deslizamento da tampa. Em seguida, lave as seções do slide usando pulsos suaves de PBS de uma pipeta Pasteur. Coloque as seções em um frasco de vidro limpo contendo PBS.
Realize a reação do HRP Avidin incubando primeiro as seções no complexo de biotina Avidin ou ABC, por pelo menos duas horas para amplificar o produto de reação HRP. Em seguida, lave as seções com PBS 3 vezes por 10 minutos e, em seguida, com tampão tris duas vezes por 10 minutos. Depois de remover a última lavagem tampão tris, adicione rapidamente uma gota de 8% de solução de cloreto de níquel à solução diaminobenzidina ou solução DAB.
Em seguida, pipeta a solução para misturar e adicionar rapidamente um mililitro desta solução sobre as seções. Incubar as seções nesta solução por 15 minutos. Em seguida, adicione 10 microliters de 1% de peróxido de hidrogênio à solução DAB.
Deixe a reação prosseguir no escuro sob agitação constante por cerca de um a dois minutos até que as células sejam rotuladas. Em um capô de fumaça, coloque um pequeno círculo de papel filtro em uma placa de Petri e umedeça-o com PB. Levante as seções uma de cada vez do frasco de vidro usando um pincel de tinta e coloque-as cuidadosamente sobre o papel. Cubra as seções com outro círculo umedecido de papel filtro e remova o excesso de tampão tocando suavemente o papel de tecido na superfície.
Aplique oito ou nove gotas de 1% de tetroxida de ósmio na PB ao papel superior. Cubra o prato e mantenha no capô da fumaça por pelo menos 30 minutos, mas não mais do que 1 hora. Depois de enxaguar, montar e cobrir as seções, desidratar através de uma série de 50%, 70%, 95% e 100% de soluções alcoólicas.
Após a etapa de desidratação, transfira as seções para um frasco de vidro contendo 100% de etanol em um agitador por aproximadamente cinco minutos. Substitua a solução alcoólica por óxido de propileno e lave três vezes por cinco minutos. Após a última lavagem, mantenha em torno de dois mililitros de óxido de propileno no frasco e adicione resina a uma proporção de 1:1.
Certifique-se de que a resina está dissolvida e mantenha as seções sob constante agitação por 30 minutos. Após 30 minutos, use uma vara de madeira para colocar cada seção em uma planchette de alumínio contendo resina epóxi, e incubar durante a noite. No dia seguinte, coloque o planchette em uma placa quente por aproximadamente 10 minutos.
Em seguida, pegue cada seção com uma vara de madeira e coloque em um slide limpo. Uma vez que todas as seções tenham sido transferidas para o slide, visualize o slide sob um microscópio dissecando para verificar a orientação das fatias e coloque uma mancha de cobertura sobre as seções. Cura no forno por 48 horas a 56 graus Celsius.
Use um objetivo de baixa ampliação para se concentrar na seção doméstica que contém o corpo celular. Em seguida, use um objetivo de 100x, concentre-se no corpo celular e clique no centro para marcar o ponto de referência. Para rastrear a soma em 3D usando o objetivo de 100x, selecione contorno da guia de rastreamento e selecione o contorno do corpo celular.
Use o joystick para mover o foco para a parte superior do corpo celular. Coloque os pontos clicando ao redor do perímetro da peça que está atualmente em foco. Clique com o botão direito do mouse e selecione contorno próximo para finalizar este primeiro contorno.
Repita este processo em diferentes posições z até que a parte inferior do corpo celular seja atingida. Para rastrear a árvore dendrítica, selecione dendrito ou dendrito apical, no menu de neurônios. Primeiro, rastreie um segmento inicial curto para cada dendrito usando a roda de rolagem do mouse para ajustar o diâmetro do cursor para combinar com o diâmetro do dendrito.
Rastreie cada dendrite. Quando um nó na árvore é alcançado, clique com o botão direito do mouse e selecione nó bifurcado ou nó de trifurcação no menu suspenso. Para identificar pontos de correspondência entre os dendritos em uma seção que corresponde à seção concluída, clique na guia mover e selecione match points.
Selecione o número de pontos necessários para ser correspondido e pressione OK. Clique no final de uma filial completa e clique no ramo. Repita isso para cada match point. Uma vez que todos os dendritos de cada seção tenham sido rastreados, rastreie o axônio usando o mesmo processo Mostrado aqui é uma reconstrução de uma célula cesta CA2 com dendrítica restrita e axona arbornal usando um tubo de desenho.
Os dendritos estão em preto e o axônio está em vermelho. Esta é uma imagem de exemplo da célula de cesta cheia de biocytina seguindo o protocolo Avidin HRP descrito aqui. Mostrado aqui é um vídeo de uma reconstrução neuronal 3D da célula cesta CA2.
Dendrites estão em rosa escuro e o axônio está em branco. Por fim, esta imagem mostra um dendrograma da célula cesta CA2. Levará tempo para se tornar proficiente com este protocolo.
No entanto, essa abordagem otimizada pode gerar imagens de alta resolução de estruturas corticais e hipocampais complexas in vitro.
