Este método pode ajudar a responder a perguntas-chave relacionadas ao controle biológico de patógenos vegetais transportados pelo solo. O padrão-ouro para testar materiais como adubo é ter um bioensaio vegetal para testar se é tóxico para as plantas. No entanto, isso leva três semanas.
Este método pode ser feito em cerca de dois a três dias. A principal vantagem dessa técnica é que ela é simples, acessível e eficaz. Este ensaio é uma rápida triagem de composto específico para suprimir o crescimento da Rizoctonia solani.
No entanto, este ensaio também pode ser usado contra outros patógenos vegetais transportados pelo solo, como Fusariums, Pythiums e Phytophthoras. A demonstração visual deste método é fundamental porque é preciso isolar e manter uma cultura pura de fungo, evitando a contaminação. Demonstrando o procedimento de isolamento será Taylor Readyhough, uma estudante de pós-graduação do meu laboratório.
Emma Wright, uma estudante de graduação do meu laboratório, vai demonstrar o ensaio da competição. Para começar, semeie sementes de rabanete vermelho no solo conhecido por ter um histórico de doença causada por R.solani. Após três a quatro semanas, retire as mudas do solo e enxágue-as com água da torneira.
Usando uma lâmina de barbear, corte segmentos de um centímetro do hipocotyl e raiz que tenham uma cor marrom. Em seguida, use fórceps esterilizados por chamas para mergulhar os segmentos em solução de alvejante de 10% por um minuto. Depois disso, enxágue os segmentos em água estéril.
Em seguida, use fórceps esterilizados por chamas para transferir os segmentos para uma toalha de papel. Bata os segmentos secos, e transfira-os para uma placa de Petri com ágar de água. Coloque a placa de Petri dentro de um recipiente com tampa, e incubar os segmentos à temperatura ambiente.
Para estabelecer uma cultura filha, transfira um dos segmentos para o centro de um prato fresco de dextrose de batata ágar. Depois disso, autoclave tubos de ensaio de 25 mililitros contendo 10 mililitros de água. Adicione duas amostras de 0,5 gramas de cada amostra de teste a um par de tubos de ensaio autoclaved com 10 mililitros de água estéril, e agite os tubos de ensaio durante a noite.
Após 24 horas, adicione 1,5 gramas de ágar simples e 90 mililitros de água destilada a um par de frascos cônicos. Depois de autoclavar os frascos, coloque-os em um banho de água Celsius de 45 graus por 30 minutos. Em seguida, despeje a amostra de referência autoclavada e a amostra viva no ágar derretido.
Despeje as misturas de cada frasco em cinco pratos de Petri. Para proteger os micróbios indígenas, é importante não adicionar o adubo enquanto o ágar estiver muito quente. Portanto, deixe o ágar esfriar a 45 graus Celsius antes de adicionar o adubo.
Utilizando técnica asséptica, transfira peças de R.solani para cada par de placas de amostra. Em seguida, incubar as placas em temperatura ambiente por um a dois dias. Finalmente, use uma régua clara e plana e um microscópio estéreo para medir o raio do micélio em cada placa até o milímetro mais próximo.
Neste protocolo, extratos de compostos vivos suprimiram significativamente mais o crescimento de R.solani do que amostras autoclavadas, demonstrando que o efeito era microbiano e não à base de nutrientes. A supressividade é medida como uma redução do crescimento em comparação com o controle autoclaved. O crescimento não foi afetado pela duração do amadurecimento ou cura do composto.
O crescimento foi significativamente afetado pelo método de compostagem e ingredientes de receita, especificamente com vermicompost, processos de windrow e receitas com casca de madeira. Após seu desenvolvimento, essa técnica pode ser candidata à certificação comercial de composto para propriedades supressivas de doenças.
