We gratefully acknowledge Dr. Hans Clevers (Hubrecht Institute for Developmental Biology and Stem Cell Research, Netherlands) for the kind gift of TOPflash cells.
This project was supported in part by NIH-R01DK083325 (MAH); NIH P30 DK078392 (Digestive Health Center); NIH UL1RR026314 (CTSA).

Declaração de Ética: NOTA: Todos experimentação utilizando tecidos humanos aqui descritos foi aprovado por um IRB em CCHMC (IRB # 2012-2858; # 2.014-0.427). O consentimento informado para a recolha de tecido, armazenamento e utilização das amostras foi obtida a partir dos dadores a CCHMC. 1. Preparação para a Cultura NOTA: Todos os reagentes estão listados na Tabela 1. <ol><li> Preparar a solução de estoque de EDTA como se segue: preparar 0,5 M de ácido etilenodiaminotetraacético, pH 8 (EDTA) em ultrapura H2O, esterilizada por filtração com filtros de 0,22 um. Opcionalmente, armazenar a solução de EDTA a RT indefinidamente. </li><li> Preparar tampão quelante, como segue: misturar 2% de sorbitol, 1% de sacarose, 1% de fracção V de albumina de soro bovino (BSA) e gentamicina 1x / solução de anfotericina em fosfato de Dulbecco tamponado com solução salina, sem Ca 2+ e Mg 2+ (DPBS), esterilizado por filtração com filtro de 0,22 um. Prepare o buf quelantefer fresco. </li><li> Prepare meio de Wnt-3A-condicionado como se segue: O meio de Wnt-3A-condicionado é feito em casa utilizando a linha celular de Wnt-L 3A de acordo com as instruções do fabricante (ATCC, CRL-2647). Suplementar o meio com 2 mM de glutamina, 10 mM de HEPES, 100 U / ml de penicilina, 100 g / ml de estreptomicina, 1 suplemento N2, 1 B27 suplemento, 1% de BSA e esterilizado por filtração com um filtro de 0,22? M. NOTA: Teste todos os lotes para a atividade Wnt usando um ensaio TOPflash. Utilize uma linha celular HEK293 TOPflash estável (Hans Clevers laboratório) com um kit de ensaio de luciferase de Renilla de acordo com as instruções do fabricante. Normalizar o ensaio TOPflash com 100 ng / ml de recombinante humano Wnt-3A. Confirme pelo menos uma atividade de 10 fold-change dos meios condicionados relação ao controle. Divide meio de Wnt-3A-condicionado fresco em alíquotas de 10 ml em tubos cónicos de 15 ml e congeladas a -20 ° C durante até 6 meses. Loja descongeladas aliquotas até 5 dias a 4 ° C sem perda de actividade. </li><li> Prepare meio minigut humano como se segue: Suplemento avançada meio DMEM / F12 com 2 mM de glutamina, 10 mM de HEPES, 100 U / mL de penicilina, 100 g / mL de estreptomicina, 1 suplemento N2, 1 B27 suplemento, 1% de BSA e esterilizado por filtração com 0,22 filtro de? m. NOTA: Dividir meio minigut humano fresco em 10 ml de partes alíquotas em tubos cónicos de 15 ml e congeladas a -20 ° C durante até 3 meses. Loja descongeladas aliquotas até 5 dias a 4 ° C sem perda de actividade. </li><li> Prepare meio completo minigut humana da seguinte forma: Prepare fresco antes de cultura cripta ou mudança médio médio minigut humana (ver 1.4) suplementado com 50% de Wnt-condicionado-3A meio (ver 1.3), 1 mg / ml R-espondina 1 (1: 1.000 diluição de 1 mg / ml de stock), Noggin 100 ng / ml (1: 1000 de diluição de 100 g / mL de estoque), 50 ng / mL de EGF (diluição 1: 10.000 de 500 ug / mL de estoque), 500 nM de A-83 -01 (1: 1000 de diluição de 500 M estoque), 10 uM SB202190 (1: 3000 de diluição de estoque 30 mM), 10 nM de [Leu] 15-Gastrina 1 (diluição 1: 10.000 de 100 uMestoque), 10 mM de nicotinamida (diluição 1: 100 de 1 M) e 1 mM de N-Acetilcisteína (1: 1000 de diluição de 1 M). NOTA: Loja completos media minigut humanos até 2 dias a 4 ° C, sem perda de atividade. </li></ol> 2. Crypt Isolamento da Whole Tissue NOTA: A partir da coleta de tecido, é essencial para manter a amostra em solução salina. Recomenda-se a manter o tecido em gelo durante o transporte. Preparação da amostra para o isolamento de cripta deve ser realizada o mais rapidamente possível. NOTA: Todos os reagentes estão listados na Tabela 1, ferramentas, equipamento, e materiais de consumo estão listados na Tabela 2. <ol><li> Preparar todos os reagentes antes de se iniciar a experiência. Descongelar a matriz da membrana basal em gelo e pré-incubar uma placa de 24 cavidades em uma incubadora de CO 2 a 37 ° C. NOTA: Como alternativa fazer uma fina camada de membrana basal da matriz, utilizando 15 uL / ​​cavidade no centro de um 24-bem placa e colocá-lo em uma incubadora de CO 2 a 37 ° C. Esta etapa facultativa mantém a matriz da membrana basal, como uma queda durante a polimerização. </li><li> Lavar o tecido com gelado de Dulbecco tamponada com fosfato salino sem Ca 2+ e Mg 2+ (DPBS). Continuar até que o teor de DPBS é clara. </li><li> Usando 0,2 mm de diâmetro minutien pinos, proteger o tecido sobre uma placa de Petri de vidro revestidas com silicone preenchida com DPBS gelado. Esticar e fixar o tecido plano com o lado da mucosa voltada para cima. </li><li> Sob um microscópio de dissecação, remover a mucosa sobrejacente a partir da submucosa e tecido conjuntivo usando micro-dissecação tesouras e pinças curvas do ponto fino (Figura 2A, B). </li><li> Esticar e fixar o dissecados mucosa plana no vidro placa de Petri com revestimento de silicone com o lado da mucosa voltada para cima. O restante da submucosa e tecido conjuntivo pode ser descartado ou usado para experimentos posteriores (Figura 2C). </li><li> Suavementeraspar a superfície da mucosa com pinças curvas. Este passo é necessário para melhorar a qualidade da preparação. <ol><li> Para intestino delgado, raspe a mucosa para remover as vilosidades. </li><li> Para cólon, raspe a mucosa para remover muco e detritos. </li></ol></li><li> Lava-se a mucosa 3-4 vezes com tampão arrefecido com gelo de quelação para remover detritos e vilosidades. </li><li> Cubra a mucosa com tampão de quelação EDTA 2 preparada na hora (200 mL de 0,5 M EDTA em 49,6 ml de tampão de quelação). </li><li> Coloque a placa de Petri no gelo e agitar suavemente durante 30 min num agitador orbital horizontal. </li><li> Lavar o tecido 3-4 vezes com tampão de quelação gelada sem EDTA. Após a lavagem, deixar a mucosa em tampão de quelação gelada. </li><li> Processar a mucosa sob um microscópio de dissecação usando uma pinça curva e multa. Raspe o mucosa para libertar criptas intestinais utilizando a pinça curvos. </li><li> Remova cuidadosamente a suspensão cripta da placa de Petri usando um pipette e transferi-lo para um tubo de 50 ml. NOTA: verificar o tecido para se certificar de que quase todas as criptas foram removidas a partir da mucosa. </li><li> Filtra-se a suspensão através de criptas a 150 mm de malha 2 vezes. Nota: Verifique o flow-through para o enriquecimento cripta sob um microscópio (Figura 2D). </li><li> Centrifugar a suspensão cripta 5 min a 50 xg, 4 ° C. Descartar o sobrenadante. </li><li> Ressuspender o sedimento em 5 ml de tampão arrefecido com gelo de quelação. </li><li> Contar o número de criptas por queda de 10 ul da suspensão do passo 2.15. Transferir o número de criptas necessários para chapeamento de um tubo de 5 mL de fundo redondo. Use 200 a 500 criptas por poço de um prato de 24 cavidades para estabelecer enteroids ou colonoids. </li><li> Centrifugar a fracção cripta durante 10 min a 150 g, 4 ° C. Remover o sobrenadante. </li><li> Use criptas para a cultura subseqüente. </li></ol> 3. Crypt Isolamento de Biópsia <ol><li> Prepare todos os reagentes antes dainício da experiência. Descongelar a matriz da membrana basal em gelo e pré-incubar uma placa de 24 cavidades em uma incubadora de CO 2 a 37 ° C. </li><li> Lava-se a biópsia com gelado de Dulbecco tamponada com fosfato salino sem Ca 2+ e Mg 2+ (DPBS). </li><li> Utilizando 0,1 mm de diâmetro minutien pinos, garantir a biópsia sobre uma placa de Petri de vidro revestidas com silicone preenchida com DPBS gelado. Esticar e fixar a mucosa plana com o lado da mucosa voltada para cima (Figura 2E). </li><li> Raspe a superfície da mucosa com pinças curvas para remover detritos e vilosidades. Este passo é necessário para melhorar a qualidade da preparação. </li><li> Lava-se a biópsia 3-4 vezes com tampão arrefecido com gelo de quelação para remover detritos e vilosidades. </li><li> Cubra a biópsia com tampão de quelação EDTA 2 preparada na hora (200 mL de 0,5 M EDTA em 49,8 ml de tampão de quelação). </li><li> Coloque a placa de Petri no gelo e agitar suavemente durante 30 min num agitador orbital horizontal. </li> &lt;li&gt; Lavar a biópsia 3-4 vezes com tampão de quelação gelada sem EDTA. Após a lavagem, deixar a biópsia em tampão de quelação gelada. </li><li> Processar a biópsia sob um microscópio de dissecação usando uma pinça curva e multa. Raspe a mucosa para liberar as criptas intestinais usando uma pinça curva. </li><li> Remova cuidadosamente a suspensão cripta da placa de Petri com uma pipeta e transferi-lo para um tubo de 50 ml. NOTA: verificar o tecido para se certificar de que quase todas as criptas foram removidas a partir da mucosa. </li><li> Filtra-se a suspensão através de uma cripta de nylon de 150 um de malha 2 vezes. Nota: Verifique o flow-through para o enriquecimento cripta sob um microscópio. </li><li> Centrifugar a suspensão cripta 5 min a 50 xg, 4 ° C. Descartar o sobrenadante. </li><li> Ressuspender o sedimento em 1 ml de tampão arrefecido com gelo de quelação. Transferir a suspensão cripta de um tubo de 1,5 mL de microcentrífuga. </li><li> Centrifugar a fracção cripta durante 10 minutos a 150 xg, a 4 ° C. Remover o sobrenadante. &lt;/ Li&gt; <li> Use criptas para a cultura subseqüente. </li></ol> 4. Crypt Cultura em Basement Membrane Matrix <ol><li> Usando pontas de pipetas pré-refrigerados, colocar o agregado de crypt (a partir do passo 2.18 ou 3.15) na matriz da membrana basal (200 a 500 criptas / matriz da membrana basal 50 ul). </li><li> Aplicar 50 ul de suspensão cripta na matriz da membrana basal por poço na placa pré-aquecida. Lentamente ejectar a matriz da membrana basal no centro do poço. </li><li> Colocar a placa de 24 cavidades em uma de 37 ° C, 5% de CO2 durante 30 min para permitir uma polimerização completa da matriz da membrana basal. </li><li> Overlay a matriz da membrana basal com 500 mL de meio minigut humano completo suplementado com 2,5 mM CHIR99021 (1: 4000 diluição de 10 estoque mM) e 2,5 mM Thiazovivin (1: 4000 diluição de estoque 10 mM). </li><li> Incubar a placa em uma temperatura de 37 ° C, 5% de CO2. </li><li> Substituir o meio com huma completo frescon minigut média a cada 2 dias. </li></ol> 5. Passaging de Cultivadas Enteroids e Colonoids. NOTA: Passage Enteroids e Colonoids cada 7 a 10 dias após o início do cultivo. Geralmente, dividir um bem em 3-4 poços. <ol><li> Preparar todos os reagentes antes do início da experiência. Descongelar a matriz da membrana basal em gelo e pré-incubar uma placa de 24 cavidades em uma incubadora de CO 2 a 37 ° C. </li><li> Remova a mídia usando dicas estéreis e sobreposição com 1 ml de DPBS geladas. </li><li> Pipeta para trás e para a frente com uma ponta de 1.000 l. Transferir a solução em um novo tubo cónico de 15 ml. </li><li> Adicionar 2 ml de meio minigut humano suplementado com 5% de FBS por 1 ml de meio. </li><li> Centrifuga-se a solução durante 5 min a 50 xg, 4 ° C. Descartar o sobrenadante. </li><li> Ressuspender o sedimento com 2 mL de enzima de dissociação de células suplementadas com 10 uM Y-27632 (1: 1000 de diluição de estoque 10 mM). Incubar por 5 mno a 37 ° C em um banho de água. </li><li> Dissociar os aglomerados de células usando a 3 ml Luer-Lock seringa equipada com um 18-G enchimento / agulha romba. Pipeta suavemente a solução para trás e para a frente utilizando a seringa 10 vezes. </li><li> Centrifuga-se a suspensão durante 5 minutos a 500 xg, a 4 ° C. Descartar o sobrenadante. </li><li> Usando pontas de pipetas de pré-refrigerada, ressuspender o sedimento celular em matriz de membrana basal. </li><li> Aplicar 50 ul de suspensão cripta na matriz da membrana basal por poço na placa pré-aquecida. Lentamente ejectar a matriz da membrana basal no centro do poço. </li><li> Colocar a placa de 24 cavidades em uma de 37 ° C, 5% de CO2 durante 20 min para permitir uma polimerização completa da matriz da membrana basal. </li><li> Overlay a matriz da membrana basal com 500 mL de meio minigut humano completo suplementado com 10 mM Y-27632 (1: 1000 diluição de estoque 10 mM). </li><li> Incubar a placa em uma temperatura de 37 ° C, 5% de CO2. </li><li> Após 2 dias, Substituir o meio com meio completo minigut humano fresco suplementado com 10 uM Y-27632 (1: 1000 de diluição de estoque 10 mM). Depois disso, substituir o meio com fresco, meio completo minigut humano todos os dias. </li></ol> 6. Congelamento de Cultivadas Enteroids e Colonoids NOTA: Normalmente, congelar um poço em 2-3 cryovials. <ol><li> Repita os passos de 5,1-5,8. </li><li> Ressuspender o sedimento com meio frio. Transferir 1 ml de solução em um frasco de congelação congelando marcado. Inserir o frasco de congelação num recipiente de congelamento contendo 500 ml de álcool isopropílico. </li><li> Transferir o recipiente de congelamento a 80 ° C um congelador durante 24 h, em seguida, transferir criotubo para armazenamento em azoto líquido. NOTA: Loja Enteroids e Colonoids por até 1 ano. </li></ol>

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F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+functional+CFTR+assay+using+primary+cystic+fibrosis+intestinal+organoids.">A functional CFTR assay using primary cystic fibrosis intestinal organoids.</a> Nat Med. 19 (7), 939-945 (2013).</li><li>Kovbasnjuk, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+enteroids:+preclinical+models+of+non-inflammatory+diarrhea.">Human enteroids: preclinical models of non-inflammatory diarrhea.</a> Stem Cell Res Ther. 4, S3 (2013).</li><li>Fujii, M., Sato, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culturing+intestinal+stem+cells:+applications+for+colorectal+cancer+research.">Culturing intestinal stem cells: applications for colorectal cancer research.</a> Front Genet. 5, 169 (2014).</li><li>Koo, B. K., Sasselli, V., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retroviral+gene+expression+control+in+primary+organoid+cultures.">Retroviral gene expression control in primary organoid cultures.</a> Curr Protoc Stem Cell Biol. 27 (Unit 5A), 6 (2013).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Este método oferece um sistema completo de reprodução de linhagens epiteliais do intestino e dinâmicas epiteliais, que constituem uma ferramenta útil para estudar biologia epitelial intestinal. O método aqui apresentado foi adaptado a partir do estudo original de murino por Sato e Clevers 22, que de forma eficiente resulta em enteroids humanos e colonoids. Aqui, nós colhidos manualmente até as criptas por microdissection para evitar quaisquer contaminantes celulares. Este método permite uma visualização direta das criptas e leva a horas extras consistência em relação à coleta cripta original por &quot;agitação&quot;. Outros grupos desenvolveram técnicas similares usando abordagens ligeiramente diferentes especialmente substituindo a quelação pelo EDTA com colagenase 25. Além das diferenças de recolha cripta, essas técnicas usam um meio definido que é necessário para crescer as enteroids humanos em cultura 22. Para aumentar a eficiência de crescimento a cripta semeadura, nós adicionamos um inibidor da GSK3 (CHIR99021)para os dois primeiros dias 12. A manipulação do tecido ou biópsias é importante e o isolamento cripta deve ser realizado logo que o tecido chega ao laboratório. No entanto, o isolamento e cultura cripta retardada pode ser realizada até 24 horas após a recolha de tecidos (dados não mostrados) tal como anteriormente descrito para o tecido 26 de murino. O tecido intestinal deve ser colocada num tubo cónico completamente preenchido com DPBS para evitar a ruptura de tecido e deve ser mantida a 4 ° C. A preparação atrasada permite o transporte do tecido, mas a variação de temperatura deve ser evitada durante o transporte. O tempo total necessário para o plaqueamento inicial cripta é de aproximadamente 2 horas com 15 a 30 min para processar o tecido e 1 a 2 horas para isolar e placa da cripta. O microdissection do tecido é um determinante crítico e predicado de uma preparação cripta limpo. No entanto, a liberação cripta por mão-agitando como descrito em vários protocolos é possível 22,23. Apesar das semelhanças com o sistema enteroid murino (enteroids), os enteroids humanos exigem moléculas específicas para aumentar e sustentar seu crescimento ao longo do tempo. Os factores de crescimento, EGF, Noggin, R-espondina são utilizados de forma semelhante para os Organóides epiteliais murino. No entanto, o uso de Wnt-3A é crítica. Observou-se que a formação, bem como a eficiência do crescimento é maior utilizando um meio condicionado de Wnt-3A do que a proteína humana recombinante. Concomitantemente, que demonstrou melhoria das condições de cultura utilizando um inibidor da glicogénio sintase quinase 3 (CHIR99021) 12. Factores de crescimento recombinantes que podem ser substituídos por Wnt-3A, R-espondina, e Noggin condicionado meios. Uma linha de células L expressando Wnt-3A-se comercialmente disponível (ATCC). Outros grupos desenvolveram R-1- espondina 23,27, Noggin- 19, e Wnt-3A / R-spondin3 / Noggin- 28 linhas celulares que expressam. Dois inibidores de moléculas pequenas são utilizadas na cultura mediâmetro e são necessários para a manutenção da cultura 29. A-83-01 é um inibidor selectivo do factor de transformação de crescimento β e receptores de Activina / nodais (activina-quinase semelhante a 4, 5, 7) e SB202190 é um inibidor de proteína quinase p38 mitogen-activated (MAPK). Ambos os inibidores foram utilizados, respectivamente, para sustentar humana induzida células-tronco pluripotentes auto-renovação e estabelecer células pluripotentes ingênuos humanos tronco 30-32. Além disso, a nicotinamida, um precursor de dinucleótido nicotinamida adenina, é necessária para manter enteroids e expansão colonoids de forma a longo prazo 22,29. A quelação de EDTA é um passo importante, uma vez que determina o rendimento a partir da preparação da cripta. Temos sido bem sucedidos com 2 tratamento EDTA mM. No entanto, a concentração de EDTA pode ser modificado a partir de 2 mM a 15 mM em relação ao tipo de tecido. Nesse caso, o tempo de incubação tem que ser determinado empiricamente. Após a colocação inicial, a cripta vai arredondar-up e, eventualmente, formar enteroids. No entanto, os enteroids ou colonoids muitas vezes demonstram um fenótipo &quot;tronco&quot;, formando esferas com pouco ou nenhum células diferenciadas. Nesse caso, a diferenciação pode ser iniciada através da retirada de Wnt-3A, nicotinamida e o inibidor de p38 MAPK. O uso de inibidor de Notch, como DAPT ou DBZ ajuda a reforçar a diferenciação dentro dos enteroids 22. Este modelo recapitula a fisiologia intestinal com eventos de brotamento cripta contínuas decorrentes de um compartimento de células estaminais, bem como domínios epiteliais vilo-como contendo tanto de absorção e secreção diferenciadas linhagens. Curiosamente, este sistema não contém células mesenquimais e usa condições de mídia específicos para atender às exigências de sinal nicho. Como o modelo de murino, enteroids humanos podem ser gerados a partir de células epiteliais intestinais isoladas para testar a capacidade das referidas células para funcionar como uma célula estaminal. Several estudos usaram conjunto de marcadores de diferenciação (CD44, CD24 ou CD166) e células positivas EphB2 para enriquecimento em células estaminais com propriedades 12,23,33. Juntos, estes estudos demonstram a utilidade de enteroids humanos culturas para testar a stemness. Outros pesquisadores estão usando esse modelo para investigar doenças intestinais, como doenças infecciosas diarréicas, fibrose cística, ou câncer colorretal 22,34-37. Estes estudos demonstram que enteroids humanos constituem um modelo da doença humana confiável, com uma possibilidade de avançar para uma triagem personalizado. Enteroids humanos podem ser geneticamente modificadas utilizando transfecção de DNA ou a infecção com 38 partículas virais. Isto proporciona uma ferramenta poderosa para estudar as funções específicas do gene dentro das Organóides epiteliais humanas ou corrigir mutações genéticas. Recentemente, Cambaleas e colegas demonstraram a possibilidade de modificar o genoma com o sistema CRISPR / Cas9 e corrigir a mutação no gene de CFTR causando acfibrose ystic 24. Enteroids Humanos constituem um sistema valioso para estudar células-tronco intestinal e biologia da mucosa epitelial e servir como um sistema experimental novela para estudar fisiologia gastrointestinal normal e anormal.

O epitélio de revestimento do trato gastrointestinal está em constante renovação. Este processo é desencadeado por proliferação de células estaminais intestinais (ISC), que produzem continuamente descendência para substituir rapidamente o epitélio intestinal, uma vez que se vira. O compartimento proliferativa compreendendo os ISC está confinada à parte inferior das criptas. As ISC dar origem a descendência que eventualmente se diferenciar em linhagens de absorção ou secreção. Saindo da cripta e para o vilo ou superfície do epitélio, as células diferenciam-se progressivamente à medida que migram para cima antes de esfoliação para o lúmen 1. ISC dar origem a todos os tipos de células epiteliais do intestino incluindo enterócitos, células microfold, células enteroendócrinas, células caliciformes, células topete e células de Paneth. O cólon é caracterizada por criptas alongadas composta principalmente de colonócitos e células caliciformes, com enteroendï¿½rina dispersa e células topete 2. Ex vivo culsistemas tura constituem ferramenta promissora para o estudo de manutenção ISC e homeostase do tecido intestinal. No entanto, é difícil contar com técnicas de cultura de tecidos como condições fisiológicas não são inteiramente reproduzida e o microambiente epitelial, muitas vezes alterados 3,4. Um grande avanço no campo ISC foi o estabelecimento de técnicas de cultura de tecidos para manter e expandir ISC murino individuais utilizando fatores de crescimento definidas para substituir os sinais de nicho intestinal normal. Condições de cultura a longo prazo foram descritos por Sato et al., Em que criptas individuais ou isolados a partir de células estaminais do epitélio intestinal crescer para formar estruturas epiteliais 3-dimensional, incluindo vários domínios das criptas do tipo 5-7. Estas estruturas tridimensionais sofrer eventos de fissão para expandir continuamente. Curiosamente, todos os tipos de células intestinais específicas para o tecido de origem são produzidos e assim são extrudidas em um lúmen 8. Utilizando modificações deste sistema, epitelialOrganóides pode ser gerado a partir do estômago, intestino delgado e cólon. Mais especificamente, Organóides epiteliais do intestino delgado são enteroids 9, e os do cólon são colonoids 9,10. Esses sistemas de cultura organï¿½de epiteliais foram usadas para testar a capacidade das células individuais isoladas funcionar como células estaminais in vitro, testando assim a &quot;stemness&quot; de células isoladas 5,6,10-15. Outros pesquisadores utilizaram ambos enteroids e colonoids para estudar a função das células epiteliais individuais 16-21. Assim, culturas enteroid colonoid e pode ser utilizado para avaliar ambas as funções estaminais e células não estaminais e dar uma nova visão em interacções celulares fundamentais dentro dos intestinos. Em 2011, Sato e colegas gerado cultura de longo prazo de Organóides epiteliais derivadas do intestino delgado e cólon 22,23 humano. Além das diferenças na composição da mídia, os enteroids epiteliais humanase colonoids apresentam as mesmas características que o seu homólogo murino. Além disso, eles podem ser gerados a partir de tecidos doentes, tais como esófago, adenoma ou adenocarcinoma de Barrett, e fibrose cística 22,24. Enteroids humanos constituem um sistema valioso para estudar de células-tronco da mucosa intestinal e da biologia epitelial e servir como um novo sistema experimental para estudar a fisiologia gastrointestinal tanto normal como anormal 3. Aqui, descrevemos métodos para estabelecer enteroids e colonoids de intestino delgado humano e criptas do cólon (Figura 1). Nesta revisão metodológica, enfatizamos a coleção cripta do tecido inteiro e biópsias. Nós recapitular as modalidades de cultura que são essenciais para o crescimento bem sucedido e manutenção de enteroids e colonoids humanos e as possíveis estratégias experimentais realizados por este modelo.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="803">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:480px;">Name of Reagent</td>
			<td style="width:195px;">Company</td>
			<td style="width:129px;">Catalog Number</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">Dulbecco&#8217;s Phosphate buffered saline Ca2+, Mg2+ free (DPBS)</td>
			<td>Life technologies; Gibco</td>
			<td>14190-144</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>431788</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sorbitol</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>BP439-500</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sucrose</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>BP220-1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bovine serum albumin (BSA) Fraction V</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>BP1600-100</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Gzntamycin/Amphotericin B solution</td>
			<td>Life technologies; Gibco</td>
			<td>R-015-10</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Wnt-3A conditionned medium</td>
			<td>in house</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Advanced DMEM/F12</td>
			<td>Life technologies; Gibco</td>
			<td>12634-028</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HEPES 1M</td>
			<td>Life technologies; Gibco</td>
			<td>15630-080</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">GlutaMAX (glutamine)</td>
			<td>Life technologies; Gibco</td>
			<td>35050-061</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)</td>
			<td>Life technologies; Gibco</td>
			<td>15140-148</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">N2 Supplement</td>
			<td>Life technologies; Gibco</td>
			<td>17502-048</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">B27 Supplement</td>
			<td>Life technologies; Gibco</td>
			<td>17504-044</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">N-Acetylcysteine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9165-5G</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nicotidamide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>N0636</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Matrigel, GFR, Phenol free (basement membrane matrix)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356231</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">human recombinant Noggin</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>6057-NG/CF</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">human recombinant R-Spondin</td>
			<td>Preprotech</td>
			<td>120-38</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">human recombinant EGF</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E9644-.2MG</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Y-27632</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Y0503-1MG</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">A-83-01</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>2939</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SB202190</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7067-5MG</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">human [Leu]15-Gastrin 1</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G9145-.1MG</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CHIR99021</td>
			<td>Stemgent</td>
			<td>04-0004</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Thiazovivin</td>
			<td>Stemgent</td>
			<td>04-0017</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TrypLE Express Enzyme (1X), phenol red (cell dissociation enzyme)</td>
			<td>Life technologies; Gibco</td>
			<td>12605-010</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Life technologies; Gibco</td>
			<td>10082-147</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CTS Synth-a-Freeze Medium (freezing medium)</td>
			<td>Life technologies; Gibco</td>
			<td>A13713-01</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L Wnt-3A cell line</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-2647</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Renilla luciferase assay</td>
			<td>Promega</td>
			<td>E2710</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">human recombinant Wnt-3A</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>5036-WN/CF</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">HEK293 TOPflash cell line</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

establishment of human epithelial enteroids and colonoids from whole tissue and biopsy

The epithelium of the gastrointestinal tract is constantly renewed as it turns over. This process is triggered by the proliferation of intestinal stem cells (ISCs) and progeny that progressively migrate and differentiate toward the tip of the villi. These processes, essential for gastrointestinal homeostasis, have been extensively studied using multiple approaches. Ex vivo technologies, especially primary cell cultures have proven to be promising for understanding intestinal epithelial functions. A long-term primary culture system for mouse intestinal crypts has been established to generate 3-dimensional epithelial organoids. These epithelial structures contain crypt- and villus-like domains reminiscent of normal gut epithelium. Commonly, termed &#8220;enteroids&#8221; when derived from small intestine and &#8220;colonoids&#8221; when derived from colon, they are different from organoids that also contain mesenchyme tissue. Additionally, these enteroids/colonoids continuously produce all cell types found normally within the intestinal epithelium. This in vitro organ-like culture system is rapidly becoming the new gold standard for investigation of intestinal stem cell biology and epithelial cell physiology. This technology has been recently transferred to the study of human gut. The establishment of human derived epithelial enteroids and colonoids from small intestine and colon has been possible through the utilization of specific culture media that allow their growth and maintenance over time. Here, we describe a method to establish a small intestinal and colon crypt-derived system from human whole tissue or biopsies. We emphasize the culture modalities that are essential for the successful growth and maintenance of human enteroids and colonoids.

A Figura 2D mostra um exemplo típico de criptas recentemente isoladas a partir de tecido inteiro (Figura 2D). O número de criptas isolados a partir de uma biópsia é mais baixa do que no tecido todo. Utilizando uma pinça de biópsia capacidade padrão com agulha, que costumam fazer duas mordidas de biópsia em uma única passagem. Cada biopsia de mordida resulta numa superfície de 10 milímetros 2 com uma média de 50 a 100 criptas por biópsia (Figura 2F). Depois de cultura na matriz da membrana basal, as criptas completam para formar enterospheres para intestino delgado e colonospheres para dois pontos. A cripta brotamento geralmente ocorre dentro de 5 a 6 dias, após a semeadura. No entanto, não é incomum ver tanto enteroids (enteroids) ou colonoids (colonoids) formando esferas na matriz da membrana basal (Figura 3A-C; Filme 1). O passaging pode ser feito depois de 7 dias, dependendo do tamanho dos enteroids. O enteroids ou colonoids establtada a partir de biópsias de submeter o mesmo desenvolvimento em cultura. No entanto, como a densidade cripta de sementeira é menor, o passaging é feito geralmente após 10 a 12 dias de cultura (Figura 4a, b). Enteroids colonoids culturas e expandir de uma maneira reprodutível. Ambos os enteroids e colonoids apresentar um lado luminal e são revestidas com um epitélio (Figura 5A, B). Células proliferativas pode ser observado dentro dos enteroids e está localizado dentro das pontas de gemas (Figura 5C, D). Imagem confocal de enteroids manchadas de E-caderina (Ecad) mostra as células epiteliais (Figura 5E). Ambos enteroids e colonoids pode ser estabelecida a partir de tecido obtidos de pacientes com doenças genéticas / congênitas. A Figura 6 mostra enteroids representativos que crescem de uma paciente com fibrose cística (Figura 6A) e uma enteropatia acolchoamento devido a uma mutação congênita no anúncio de células epiteliaisgene da molécula hesion (EpCAM) (Figura 6B). Ao lado do defeito genético, as enteroids não apresentam diferenças na condição basal. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52483/52483fig1highres.jpg" /> Figura 1. Fluxo de Trabalho de criptas dissociação e geração de enteroids humanos e colonoids em cultura. Crypts (do intestino delgado ou do cólon humano) são isolados por quelante EDTA. Criptas cultivadas formar enteroids para o intestino delgado e colonoids para o cólon. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52483/52483fig1large.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52483/52483fig2highres.jpg" /> Figura 2. Processo de dissecação para o isolamento cripta. (A) O intestino pequeno specimen é esticado e preso plana em uma placa de Petri com revestimento de silicone. (B) A mucosa é separada a partir da submucosa subjacente. (C) A mucosa dissecada é esticado e preso liso para um prato de Petri com revestimento de silicone. (D) Depois quelante EDTA, as criptas são isoladas a partir do tecido. (E) Uma biópsia é esticado e preso plana em uma placa de Petri com revestimento de silicone. (F) Depois de quelante EDTA, criptas são isolados da biópsia. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52483/52483fig2large.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/52483/52483fig3highres.jpg" /> Figura 3. cultura Crypt e enteroid humano e geração colonoid a partir de tecido inteiro. (A) criptas Jejuno banhados na matriz da membrana basal após isolamento. As criptas estão fechando-se depois de 3 a 4 horas e começar a inflar-se para formar enterospheres além deste tempo. Aos 7 dias, os enteroids jejunais são formados. (B) Após o isolamento e cultura, as criptas do íleo se comportam como as criptas do jejuno e íleo formar enteroids. (C) criptas colônicas são banhados em matriz da membrana basal após o isolamento. As criptas próximos e formulário colonoids após 7 dias (barras de escala: 100 m). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52483/52483fig3large.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/52483/52483fig4highres.jpg" /> Figura 4. cultura Crypt e enteroid humano e geração colonoid de biópsia. (A) criptas duodenais banhados em matriz da membrana basal após o isolamento. As criptas estão fechando-se depois de 3 a 4 horas e começar a inflar-se Beyond este tempo para formar enterospheres. Aos 7 dias, os enteroids são formados. (B) Após o isolamento e cultura, criptas do cólon são plaqueadas em matriz de membrana basal. As criptas fechar-se para formar colonospheres então colonoids após 7 dias (barras de escala: 100 m). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52483/52483fig4large.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/52483/52483fig5highres.jpg" /> Figura 5. linhagens intestinais dos enteroids humanos. (A) enteroid humano após 6 dias em cultura. (B) secções com Hematoxilina-eosina dos enteroids em (A) demonstram o revestimento epitelial (Barras de escala: 100 uM). (CD) de imagem confocal de enteroids após coloração EdU (magenta) mostra a presença de células proliferativas. (E </strong&gt;) imagem confocal de enteroids demonstra a presença de: E-caderina em células epiteliais (ECAD, verde) (Escala:. 50 mm) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52483/52483fig5large.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 6" src="/files/ftp_upload/52483/52483fig6highres.jpg" /> Figura 6. cultura cripta e geração enteroid humano a partir de tecido doente. (A) Enteroids estabelecida a partir de um espécime de fibrose cística. (B) Enteroids estabelecida a partir de uma amostra congênitas acolchoamento enteropatia (barras de escala: 100 mm). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52483/52483fig6large.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> Filme 1. Enterosphere formando enteroid humano em cultura. 32 hr de tempo voltase filme mostra um enterosphere estabelecida a partir de intestino delgado humano retraindo para formar um enteroid na cultura. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/52483/Movie1_v2.mp4" target="_blank">Por favor clique aqui para ver este vídeo.</a> <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Nome do Reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de Catálogo </td><td> Solvente </td><td> Da Concentração </td><td> Concentração final </td><td> Comentário </td></tr><tr><td> Fosfato de Dulbecco solução salina tamponada Ca 2+, Mg 2+ livre (DPBS) </td><td> Tecnologias da vida; Gibco </td><td> 14190-144 </td><td> - </td><td> - </td><td> 1x </td><td></td></tr><tr><td> Etilenodiamina ácido tetra-acético (EDTA) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 431788 </td><td> Ultrapura dH2O </td><td&gt; 0,5 M </td><td> 2 mM </td><td></td></tr><tr><td> Sorbitol </td><td> Fischer Scientific </td><td> BP439-500 </td><td> DPBS </td><td> Pó </td><td> 2% </td><td></td></tr><tr><td> Sacarose </td><td> Fischer Scientific </td><td> BP220-1 </td><td> DPBS </td><td> Pó </td><td> 1% </td><td></td></tr><tr><td> Albumina de soro bovino (BSA) Fracção V </td><td> Fischer Scientific </td><td> BP1600-100 </td><td> DPBS </td><td> Pó </td><td> 1% </td><td></td></tr><tr><td> Solução Gzntamycin / Anfotericina B </td><td> Tecnologias da vida; Gibco </td><td> R-015-10 </td><td> - </td><td> 500x </td><td> 1x </td><td></td></tr><tr><td> Wnt-3A conditionned médio </td><td> em casa </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td></td></tr><tr><td> Avançada DMEM / F12 </td><td> Tecnologias da vida; Gibco </td><td> 12634-028 </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td></td></tr><tr><td> HEPES 1M </td><td> Tecnologias da vida; Gibco </td><td> 15630-080 </td><td> - </td><td> 1 H </td><td> 10 mM </td><td></td></tr><tr><td> GlutaMAX (glutamina) </td><td> Tecnologias da vida; Gibco </td><td> 35050-061 </td><td> - </td><td> 100X </td><td> 1X </td><td></td></tr><tr><td> Penicilina-estreptomicina (10.000 U / ml) </td><td> Tecnologias da vida; Gibco </td><td> 15140-148 </td><td> - </td><td> 100X </td><td> 1X </td><td></td></tr><tr><td> N2 Suplemento </td><td> Tecnologias da vida; Gibco </td><td> 17502-048 </td><td> - </td><td> 100X </td><td> 1X </td><td></td></tr><tr><td> B27 Supplement </td><td> Tecnologias da vida; Gibco </td><td> 17504-044 </td><td> - </td><td> 50X </td><td> 1X </td><td></td></tr><tr><td> N-Acetilcisteína </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A9165-5G </td><td> DPBS </td><td> 1 H </td><td> 1 mM </td><td> &lt;/ Td&gt; </tr><tr><td> Nicotidamide </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> N0636 </td><td> DPBS </td><td> 1 H </td><td> 10 mM </td><td></td></tr><tr><td> Matrigel, GFR, Fenol (matriz da membrana basal) livre </td><td> Corning </td><td> 356231 </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td> NECESSÁRIO </td></tr><tr><td> Noggin humana recombinante </td><td> R &amp; D </td><td> 6057-NG / CF </td><td> DPBS </td><td> 100 ug / ml </td><td> 100 ng / ml </td><td rowspan="3"> Outros fornecedores: I &amp; D; Anaspec e PreproTech </td></tr><tr><td> humano recombinante R-espondina </td><td> PreproTech </td><td> 120-38 </td><td> DPBS </td><td> 1 mg / ml </td><td> 1 ug / ml </td></tr><tr><td> EGF humano recombinante </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> E9644-.2MG </td><td> DBPS </td><td> 500 ug / ml </td><td> 50 ng / mL </td></tr><tr><td> Y-27632 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> Y0503-1MG </td><td> DPBS </td><td> 10 mM </td><td> 10 uM </td><td></td></tr><tr><td> A-83-01 </td><td> Tocris </td><td> 2939 </td><td> DMSO </td><td> 500 uM </td><td> 500 nM </td><td></td></tr><tr><td> SB202190 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> S7067-5MG </td><td> DMSO </td><td> 30 mM </td><td> 10 uM </td><td></td></tr><tr><td> humano [Leu] 15 1-Gastrina </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> G9145-.1MG </td><td> DPBS </td><td> 100 uM </td><td> 10 nM </td><td></td></tr><tr><td> CHIR99021 </td><td> Stemgent </td><td> 04-0004 </td><td> DMSO </td><td> 10 mM </td><td> 2,5 uM </td><td></td></tr><tr><td> Thiazovivin </td><td> Stemgent </td><td> 04-0017 </td><td> DMSO </td><td> 10 mM </td><td> 2,5 uM </td><td></td></tr><tr><td> TrypLE expresso Enzima (1X), vermelho de fenol (enzima de dissociação de células) </td><td> Tecnologias da vida; Gibco </td><td> 12605-010 </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td> Para passaging </td></tr><tr><td> Soro Bovino Fetal </td><td> Tecnologias da vida; Gibco </td><td> 10082-147 </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td> Para passaging </td></tr><tr><td> CTS Synth-a-Freeze (meio de congelamento) Medium </td><td> Tecnologias da vida; Gibco </td><td> A13713-01 </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td> Para congelamento </td></tr><tr><td> Linha de células L Wnt-3A </td><td> ATCC </td><td> CRL-2647 </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td> Wnt-3A conditionned produção de mídia </td></tr><tr><td> Ensaio de luciferase de Renilla </td><td> Promega </td><td> E2710 </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td> Wnt-3A conditionned atividade de mídia </td></tr><tr><td> humano recombinante Wnt-3A </td><td> R &amp; D </td><td> 5036-WN / CF </td><td> DPBS </td><td> 100 ug / ml </td><td> 100 ng / ml </td><td&gt; Wnt-3A conditionned atividade de mídia </td></tr><tr><td> Linha celular HEK293 TOPflash </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td> Wnt-3A conditionned atividade de mídia; Presente de Hans Clevers laboratório </td></tr></tbody></table> Tabela 1. lista detalhada com reagente fabricante preferido e número de catálogo. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Equipamento </td><td> Consumível </td><td> Ferramentas </td></tr><tr><td> Câmara de fluxo laminar </td><td> 15 e 50 ml tubos cônicos </td><td> Dumont # 5 fórceps padrão (FST; # 11251-20) </td></tr><tr><td> CO 2 Incubadora </td><td> Tubos de microcentrífuga </td><td> Dumont # 7, uma pinça fina curvas (FST; # 11274-20) </td></tr><tr><td> Stereo-microscópio </td><td> Placas de 24 poços </td><td> Tesoura fina (FST; # 14060-09) </td></tr><tr&gt; <td> Centrifugador </td><td> Filtros de 0,22 um (Sartorius) </td><td> Tesoura primavera Vannas (FST; # 15018-10) </td></tr><tr><td> Shaker Orbital </td><td> Pipetas sorológicas </td><td> Minutien diâmetro dos pinos 0,2 milímetros (FST; # 26002-20) </td></tr><tr><td> Recipiente de congelamento (Nalgene) </td><td> Dicas micropipeta </td><td> Diâmetro minutien pinos 0,1 milímetros (FST; # 26002-10) </td></tr><tr><td> Sylgard 184 de silicone (Dow Corning) </td><td> 150 mm aberturas de malha, uma triagem de nylon (Aqua-fornecimento dinâmico) </td><td></td></tr><tr><td> Vidro placa de Petri </td><td> 5 ml tubos de polipropileno de fundo redondo (Falcon) </td><td></td></tr><tr><td> Pipeta sorológica </td><td> 18G agulha de preenchimento sem corte (BD) </td><td></td></tr><tr><td> Micropipeta </td><td> 3 ml lsyringes com pontas Luer-Lock (BD) </td><td></td></tr><tr><td></td><td> Cryovials </td><td></td></tr></tbody></table><strong&gt; Tabela 2. detalhada de consumo, ferramentas e equipamentos necessários para o isolamento das criptas e da cultura.

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Establishment of Human Epithelial Enteroids and Colonoids from Whole Tissue and Biopsy

We describe a method to establish human enteroids from small intestinal crypts and colonoids from colon crypts collected from both surgical tissue and biopsies. In this methodological article, we present the culture modalities that are essential for the successful growth and maintenance of human enteroids and colonoids.

Estabelecimento de epiteliais humanas Enteroids e Colonoids de tecido inteiro e biópsia

The epithelium of the gastrointestinal tract is constantly renewed as it turns over. This process is triggered by the proliferation of intestinal stem ...

establishment-human-epithelial-enteroids-colonoids-from-whole-tissue

Research

JoVE Journal

Medicine

34.4K visualizações.  Cincinnati Children's Hospital Medical Center. We describe a method to establish human enteroids from small intestinal crypts and colonoids from colon crypts collected from both surgical tissue and biopsies. In this methodological article, we present the culture modalities that are essential for the successful growth and maintenance of human enteroids and colonoids.

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Establishment and Propagation of Human Retinoblastoma Tumors in Immune Deficient Mice

Culturing retinoblastoma tumor cells in defined stem cell media gives rise to primary tumorspheres that can be grown and maintained for only a limited time. These cultured tumorspheres may exhibit markedly different cellular phenotypes when compared to the original tumors. Demonstration that cultured cells have the capability of forming new tumors is important to ensure that cultured cells model the biology of the original tumor. 
Here we present a protocol for propagating human retinoblastoma tumors in vivo using Rag2-/- immune deficient mice. Cultured human retinoblastoma tumorspheres of low passage or cells obtained from freshly harvested human retinoblastoma tumors injected directly into the vitreous cavity of murine eyes form tumors within 2-4 weeks. These tumors can be harvested and either further passaged into murine eyes in vivo or grown as tumorspheres in vitro. Propagation has been successfully carried out for at least three passages thus establishing a continuing source of human retinoblastoma tissue for further experimentation. 
Wesley S. Bond and Lalita Wadhwa are co-first authors.

A method is described to propagate human retinoblastoma tumors in mice. Tumor cells are directly injected into the eyes of immune deficient mice. Secondary tumors have been successfully established using both cells directly harvested from human tumors and cultured tumorspheres.

Estabelecimento e propagação de Tumores Humanos em Retinoblastoma Imune camundongos deficientes

Culturing retinoblastoma tumor cells in defined stem cell media gives rise to primary tumorspheres that can be grown and maintained for only a limited ...

Medicina

Real-time Cytotoxicity Assays in Human Whole Blood

A live cell-based whole blood cytotoxicity assay (WCA) that allows access to temporal information of the overall cell cytotoxicity is developed with high-throughput cell positioning technology. The targeted tumor cell populations are first preprogrammed to immobilization into an array format, and labeled with green fluorescent cytosolic dyes. Following the cell array formation, antibody drugs are added in combination with human whole blood. Propidium iodide (PI) is then added to assess cell death. The cell array is analyzed with an automatic imaging system. While cytosolic dye labels the targeted tumor cell populations, PI labels the dead tumor cell populations. Thus, the percentage of target cancer cell killing can be quantified by calculating the number of surviving targeted cells to the number of dead targeted cells. With this method, researchers are able to access time-dependent and dose-dependent cell cytotoxicity information. Remarkably, no hazardous radiochemicals are used. The WCA presented here has been tested with lymphoma, leukemia, and solid tumor cell lines. Therefore, WCA allows researchers to assess drug efficacy in a highly relevant ex&#160;vivo condition.

The whole blood cytotoxicity assay (WCA) is a cytotoxicity assay developed by incorporating high-throughput cell positioning technology with fluorescence microscopy and automated image processing. Here, we describe how lymphoma cells treated with an anti-CD20 antibody can be analyzed real-time in human whole blood to provide quantitative cellular cytotoxicity analysis.

Em tempo real de Citotoxicidade em Sangue Total Humano

A live cell-based whole blood cytotoxicity assay (WCA) that allows access to temporal information of the overall cell cytotoxicity is developed with ...

Isolation and Immortalization of Patient-derived Cell Lines from Muscle Biopsy for Disease Modeling

The generation of patient-specific cell lines represents an invaluable tool for diagnostic or translational research, and these cells can be collected from skin or muscle biopsy tissue available during the patient&#8217;s diagnostic workup. In this protocol, we describe a technique for live cell isolation from small amounts of muscle or skin tissue for primary cell culture. Additionally, we provide a technique for the immortalization of myogenic cell lines and fibroblast cell lines from primary cells. Once cell lines are immortalized, substantial expansion of patient-derived cells can be achieved. Immortalized cells are amenable to many downstream applications, including drug screening and in vitro correction of the genetic mutation. Altogether, these protocols provide a reliable tool to generate and preserve patient-derived cells for downstream applications.

This protocol describes techniques for live cell isolation and primary culture of myogenic and fibroblast cell lines from muscle or skin tissue. A technique for the immortalization of these cell lines is also described. Altogether, these protocols provide a reliable tool to generate and preserve patient-derived cells for downstream applications.

Isolamento e Imortalidade de linhas celulares derivadas do paciente a partir de biópsia muscular para a doença Modeling

The generation of patient-specific cell lines represents an invaluable tool for diagnostic or translational research, and these cells can be collected ...

Preparation and Respirometric Assessment of Mitochondria Isolated from Skeletal Muscle Tissue Obtained by Percutaneous Needle Biopsy

Respirometric profiling of isolated mitochondria is commonly used to investigate electron transport chain function. We describe a method for obtaining samples of human Vastus lateralis, isolating mitochondria from minimal amounts of skeletal muscle tissue, and plate based respirometric profiling using an extracellular flux (XF) analyzer. Comparison of respirometric profiles obtained using 1.0, 2.5 and 5.0 &#956;g of mitochondria indicate that 1.0 &#956;g is sufficient to measure respiration and that 5.0 &#956;g provides most consistent results based on comparison of standard errors. Western blot analysis of isolated mitochondria for mitochondrial marker COX IV and non-mitochondrial tissue marker GAPDH indicate that there is limited non-mitochondrial contamination using this protocol. The ability to study mitochondrial respirometry in as little as 20 mg of muscle tissue allows users to utilize individual biopsies for multiple study endpoints in clinical research projects.

Methods for biopsy of Vastus lateralis, preparation of purified mitochondria, and respirometric profiling are described. The use of small muscle volume makes this technique suitable for clinical research applications.

Preparação e Avaliação respirométrico de mitocôndrias isoladas de tecido muscular esquelético Obtido por meio de agulha de biópsia percutânea

Respirometric profiling of isolated mitochondria is commonly used to investigate electron transport chain function. We describe a method for obtaining ...

Human Vastus Lateralis Skeletal Muscle Biopsy Using the Weil-Blakesley Conchotome

Percutaneous muscle biopsy using the Weil-Blakesley conchotome is well established in both clinical and research practice. It is a safe, effective and well tolerated technique. The Weil-Blakesley conchotome has a sharp biting tip with a 4 - 6 mm wide hollow. It is inserted through a 5 - 10 mm skin incision and can be maneuvered for controlled tissue penetration. The tip is opened and closed within the tissue and then rotated through 90 -180&#176; to cut the muscle. The amount of muscle obtained following repeated sampling can vary from 20 mg to 290 mg which can be processed for both histology and molecular studies. The wound needs to be kept dry and vigorous physical activity kept to a minimum for approximately 72 hr although normal levels of activity can restart immediately following the procedure. This procedure is safe and effective when close attention is paid to the selection of subjects, full asepsis and post procedure care. &#160;Both right and left vastus lateralis are suitable for biopsy dependent on participant preference.

Human Vastus Lateralis Skeletal Muscle Biopsy Using the Weil-Blakesley Conchotome

This video demonstrates the technique of percutaneous muscle biopsy of the human vastus lateralis using the Weil-Blakesley conchotome.

Humano<em&gt; vasto lateral</em&gt; Biópsia de músculo esquelético Usando o Weil-Blakesley Conchotome

Percutaneous muscle biopsy using the Weil-Blakesley conchotome is well established in both clinical and research practice. It is a safe, effective and ...

3D Whole-heart Myocardial Tissue Analysis

Cardiac regenerative therapies aim to protect and repair the injured heart in patients with ischemic heart disease. By injecting stem cells or other biologicals that enhance angio- or vasculogenesis into the infarct border zone (IBZ), tissue perfusion is improved, and the myocardium can be protected from further damage. For maximum therapeutic effect, it is hypothesized that the regenerative substance is best delivered to the IBZ. This requires accurate injections and has led to the development of new injection techniques. To validate these new techniques, we have designed a validation protocol based on myocardial tissue analysis. This protocol includes whole-heart myocardial tissue processing that enables detailed two-dimensional (2D) and three-dimensional (3D) analysis of the cardiac anatomy and intramyocardial injections. In a pig, myocardial infarction was created by a 90-min occlusion of the left anterior descending coronary artery. Four weeks later, a mixture of a hydrogel with superparamagnetic iron oxide particles (SPIOs) and fluorescent beads was injected in the IBZ using a minimally-invasive endocardial approach. 1 h after the injection procedure, the pig was euthanized, and the heart was excised and embedded in agarose (agar). After the solidification of the agar, magnetic resonance imaging (MRI), slicing of the heart, and fluorescence imaging were performed. After image post-processing, 3D analysis was performed to assess the IBZ targeting accuracy. This protocol provides a structured and reproducible method for the assessment of the targeting accuracy of intramyocardial injections into the IBZ. The protocol can be easily used when the processing of scar tissue and/or validation of the injection accuracy of the whole heart is desired.

This protocol describes a novel method for the 3D comparison of whole-heart myocardial tissue with MRI. This is designed for the accurate assessment of intramyocardial injections in the infarct border zone of a chronic porcine model of myocardial infarction.

Análise Tecidos do Miocárdio Whole-coração 3D

Cardiac regenerative therapies aim to protect and repair the injured heart in patients with ischemic heart disease. By injecting stem cells or other ...

A Technique for Subcutaneous Abdominal Adipose Tissue Biopsy via a Non-diathermy Method

Adipose tissue biopsies offer tissue samples that, upon analysis, may provide insightful overviews of mechanisms relating to metabolism and disease. To obtain subcutaneous adipose tissue biopsies in the abdominal area, researchers and physicians use either a surgical or a needle-based technique. However, surgical subcutaneous fat biopsies can offer tissue samples that may provide a more comprehensive overview of the complexities of biological indices in white adipose tissue. Usually, a surgical adipose tissue biopsy includes a diathermy treatment for cauterizing blood vessels to prevent excessive bleeding. Nevertheless, side effects, such as flash fires and skin lesions in the tissue, have been reported after diathermy. Therefore, we aimed to standardize a surgical abdominal adipose tissue biopsy performed under local anesthesia using a non-diathermy method. We conducted 115 subcutaneous adipose tissue biopsies in healthy men using a non-diathermy abdominal surgical biopsy method. Our results showed three cases of excessive post-operation bleeding out of 115 operations (2.61%).In conclusion, our standardized subcutaneous abdominal adipose tissue surgical biopsy using a non-diathermy method can be safely applied to healthy men at the bedside, with minimal side effects.

We standardized an abdominal adipose tissue biopsy using a non-diathermy method performed under local anesthesia. Three cases of excessive post-operation bleeding out of 115 operations (2.61%) occurred.We conclude that an abdominal adipose tissue surgical biopsy using a non-diathermy method can be safely applied to healthy men.

Uma técnica para biopsia de tecido adiposo Abdominal subcutâneo através de um método não-diatermia

Adipose tissue biopsies offer tissue samples that, upon analysis, may provide insightful overviews of mechanisms relating to metabolism and disease. To ...

Whole Body and Regional Quantification of Active Human Brown Adipose Tissue Using 18F-FDG PET/CT

In endothermic animals, brown adipose tissue (BAT) is activated to produce heat for defending body temperature in response to cold. BAT&#39;s ability to expend energy has made it a potential target for novel therapies to ameliorate obesity and associated metabolic disorders in humans. Though this tissue has been well studied in small animals, BAT&#39;s thermogenic capacity in humans remains largely unknown due to the difficulties of measuring its volume, activity, and distribution. Identifying and quantifying active human BAT is commonly performed using 18F-Fluorodeoxyglucose (18F-FDG) positron emission tomography and computed tomography (PET/CT) scans following cold-exposure or pharmacological activation. Here we describe a detailed image-analysis approach to quantify total-body human BAT from 18F-FDG PET/CT scans using an open-source software. We demonstrate the drawing of user-specified regions of interest to identify metabolically active adipose tissue while avoiding common non-BAT tissues, to measure BAT volume and activity, and to further characterize its anatomical distribution. Although this rigorous approach is time-consuming, we believe it will ultimately provide a foundation to develop future automated BAT quantification algorithms.

Whole Body and Regional Quantification of Active Human Brown Adipose Tissue Using 18F-FDG PET/CT

Using free, open-source software, we have developed an analytical approach to quantify total and regional brown adipose tissue (BAT) volume and metabolic activity of BAT using 18F-FDG PET/CT.

Todo o corpo e quantificação Regional de ativo humano marrom tecido adiposo usando 18F-FDG PET-CT

In endothermic animals, brown adipose tissue (BAT) is activated to produce heat for defending body temperature in response to cold. BAT&#39;s ability to ...

Culture and Imaging of Human Nasal Epithelial Organoids

Individualized therapy for cystic fibrosis (CF) patients can be achieved with an in vitro disease model to understand baseline Cystic Fibrosis Transmembrane conductance Regulator (CFTR) activity and restoration from small molecule compounds. Our group recently focused on establishing a well-differentiated organoid model directly derived from primary human nasal epithelial cells (HNE). Histology of sectioned organoids, whole-mount immunofluorescent staining, and imaging (using confocal microscopy, immunofluorescent microscopy, and bright field) are essential to characterize organoids and confirm epithelial differentiation in preparation for functional assays. Furthermore, HNE organoids produce lumens of varying sizes that correlate with CFTR activity, distinguishing between CF and non-CF organoids. In this manuscript, the methodology for culturing HNE organoids are described in detail, focusing on the assessment of differentiation using the imaging modalities, including the measurement of baseline lumen area (a method of CFTR activity measurement in organoids that any laboratory with a microscope can employ) as well as the developed automated approach to a functional assay (which requires more specialized equipment).

A detailed protocol is presented here to describe an in vitro organoid model from human nasal epithelial cells. The protocol has options for measurements requiring standard laboratory equipment, with additional possibilities for specialized equipment and software.

Cultura e Imagem de Organoides Epiteliais Nasais Humanos

Individualized therapy for cystic fibrosis (CF) patients can be achieved with an in vitro disease model to understand baseline Cystic Fibrosis ...

Testing Epithelial Permeability in Fetal Tissue-Derived Enteroids

Human fetal tissue-derived enteroids are emerging as a promising in vitro model to study intestinal injuries in preterm infants. Enteroids exhibit polarity, consisting of a lumen with an apical border, tight junctions, and a basolateral outer layer exposed to growth media. The consequences of intestinal injuries include mucosal inflammation and increased permeability. Testing intestinal permeability in vulnerable preterm human subjects is often not feasible. Thus, an in vitro fetal tissue-derived intestinal model is needed to study intestinal injuries in preterm infants. Enteroids can be used to test changes in epithelial permeability regulated by tight junction proteins. In enteroids, intestinal stem cells differentiate into all epithelial cell types and form a three-dimensional structure on a basement membrane matrix secreted by mouse sarcoma cells. In this article, we describe the methods used for establishing enteroids from fetal intestinal tissue, characterizing the enteroid tight junction proteins with immunofluorescent imaging, and testing epithelial permeability. As gram-negative dominant bacterial dysbiosis is a known risk factor for intestinal injury, we used lipopolysaccharide (LPS), an endotoxin produced by gram-negative bacteria, to induce permeability in the enteroids. Fluorescein-labeled dextran was microinjected into the enteroid lumen, and serial dextran concentrations leaked into the culture media were measured to quantify the changes in paracellular permeability. The experiment showed that apical exposure to LPS induces epithelial permeability in a concentration-dependent manner. These findings support the hypothesis that gram-negative dominant dysbiosis contributes to the mechanism of intestinal injury in preterm infants.

This protocol details the establishment of enteroids, a three-dimensional intestinal model, from fetal intestinal tissue. Immunofluorescent imaging of epithelial biomarkers was used for model characterization. Apical exposure of lipopolysaccharides, a bacterial endotoxin, using microinjection technique induced epithelial permeability in a dose-dependent manner measured by the leakage of fluorescent dextran.