Este protocolo pode ser usado para criar xenoenxertos derivados do paciente que recapitulam a histopatologia de malformações venosas. Isso foi ainda permitido para realizar nossos testes terapêuticos pré-clínicos. Esta técnica fornece um sistema NVivo rápido e confiável que permite o monitoramento diário do crescimento das células endoteliais diretas do paciente e a resposta à terapia experimental.
Este método poderia ser facilmente adaptado para investigar outros tipos de anomalias vasculares ou linfáticas. Comece preparando a suspensão celular para injeção. Trypsinize as células endoteliais com cinco mililitros de 0,05% de tripsina-EDTA a 37 graus Celsius por dois minutos.
Neutralize a tripsina e adicionando cinco mililitros de EGM e colete as células em tubo cônico de 150 mililitros. Centrifuá-lo a 400 vezes G por cinco minutos, em seguida, aspirar o supernaspe e resuspensar as células em três mililitros de EGM. Conte as células com um hemócito.
Aventure o volume com o número celular desejado em um novo tubo cônico de 50 mililitros e pelota as células novamente por centrifugação. Aspire o supernasce deixando um pequeno volume para soltar a pelota celular. Resuspend a pelota celular com 220 microliters de BMEM por injeção.
Misture bem a suspensão celular no gelo, certificando-se de evitar a criação de bolhas. Aspire a cultura celular BMEM em uma abertura de seringa de um mililitro puxando o êmbolo. Você vai travar uma agulha estéril calibre 26 na seringa e manter as seringas preparadas planas no gelo antes da injeção.
Depois de garantir que o rato tenha anestesiado corretamente coloque-o em seu estômago e desinfete a região de injeção com 70% de etanol. Role suavemente a seringa preparada para resususpensar quaisquer células assentadas. Bolhas de flocos até o fim da seringa e expulsam um pequeno volume da suspensão celular.
Aperte a pele no local da injeção para criar uma tenda como estrutura. Em seguida, insira a agulha bem debaixo da pele e certifique-se de que a agulha é apenas profunda da pele liberando a pele de beliscão para evitar a injeção no tecido muscular. Segurando a agulha injete cuidadosamente 200 microliters da suspensão celular para criar uma pequena massa esférica.
Tome cuidado para evitar injetar a suspensão celular no músculo. Meça o comprimento e a largura de cada plugue com uma pinça. Alinhe os plugues de xenoenxerto dissecados em uma placa de corte ao lado de uma régua e tire uma imagem para registrar a vascularização bruta das lesões.
Em seguida, fixar os plugues submergindo-os em 10% de formalina durante a noite à temperatura ambiente. Após a dissecção, os plugues da lesão são processados para análise histológica e manchados para a UEA-1 detectar células endoteliais derivadas humanas dentro do plugue. Pegue cinco imagens de HPF por seção de lesão com um microscópio de campo brilhante a 20 X de ampliação em um padrão de plano X dentro da seção de lesão para evitar sobreposição.
Certifique-se de incluir uma barra de escala nas imagens tiradas. Abra as imagens do HPF na imagem J.To calibrar os pixels da barra de escala, usar a ferramenta em linha reta e passar por cima da barra de escala. Em seguida, converta os pixels medidos em milímetros clicando em Analisar e Definir escala.
Clique em Analisar medidas de conjunto e selecione área e adicione à sobreposição. Meça a área total de campo do HPF utilizando analisar e medir a economia desta medição para quantificação. Utilizando a ferramenta de seleções manuais gratuitas delineia manualmente o canal vascular positivo UEA-1.
Clique em Analisar e Medir para quantificar a área delineada. Meça todos os canais vasculares dentro do HPF. Repita o processo para os cinco HPF tomados dentro de cada seção e transfira os valores para o Excel para análise posterior.
Em seguida, calcule a porcentagem de área vascular e densidade vascular de acordo com as instruções do manuscrito. Usando este protocolo, os plugues de lesão com células endoteliais hiperativas TIE2 ou PIK3CA são visivelmente vascularizadas e perfundidas dentro de sete a nove dias após a injeção. Os plugues de lesão se assemelham muito às características histopatológicas do tecido VM humano e grandes canais vasculares alinhados por uma fina camada de células endoteliais são visíveis.
Essas estruturas vasculares normalmente contêm eritrócitos confirmando anastomose funcional com a vasculatura do rato hospedeiro. A coloração imunohistoquímica usando a lectina específica humana UEA-1 confirma que as células que revestem regiões vasculares são derivadas de células implantadas humanas em vez da vasculatura do rato. Após este procedimento, pode ser realizada uma coloração adicional de seções de lesões para marcadores de proliferação ou apoptose para analisar efeitos específicos de tratamentos experimentais.
Este modelo cenográfico tem sido usado para estudos pré-clínicos de novas terapias para malformação venosa, como o inibidor mTOR rapamicina, que tem mostrado eficácia em vários ensaios clínicos para pacientes com VM.
