O significado deste protocolo é o uso de uma nova proteína UTAG fluorescente de captura de SUM PARA a detecção do modificador de proteína SUM em várias células eucarióticas. A principal vantagem desta técnica é um protocolo simples para a detecção sem anticorpos de SUM em uma variedade de células, incluindo cultura de tecido mamífero e gônnadas nematoides. O SUM SUM desempenha papéis importantes em câncer e distúrbios neurodegenerativos, e isso reforça a necessidade de ferramentas robustas e confiáveis para a detecção e análise funcional de proteínas modificadas por SUM.
Como o SUM é altamente conservado, a proteína UTAG fluorescente de captura de SUMh pode ser usada para rotular o SUM conjugado em muitos organismos diferentes. Este vídeo demonstra seu uso em células de mamíferos. Além disso, o texto completo descreve seu uso em oócitos nematode.
A demonstração visual desta técnica fornece dicas críticas para o tratamento das células antes da coloração e detecção de SUMÔ. Para começar, cresça células de cultura tecidual escolhidas em deslizamentos de cobertura redonda de 22 milímetros em placas TC de seis poços até 70 a 80% de confluentes. Lave as células brevemente com um mililitro de DPBS.
Para corrigir as células, adicione dois mililitros de PFA fresco de 4%e DPBS a cada poço. Incubar as células por 20 minutos em temperatura ambiente. Lave as células fixas três vezes durante cinco minutos em um mililitro de DPBS enquanto emcrusta a placa.
Para permeabiliizar as células, incubar por 15 minutos com 1%Triton X-100 em DPBS. Lave as células de novo, como antes. Incubar as células com 500 microliters de 1 molar glycine HCL pH 2 por 10 segundos.
Em seguida, neutralize o pH imediatamente com 500 microliters de 10X SUMO Protease buffer, ou SPB. Depois de lavar as células como antes, remova os deslizamentos de cobertura do poço e coloque-as em uma câmara de umidade. Apenas para a coloração UTAG-FL, misture um micrograma de UTAG-FL com 100 microliters de 1X SPB contendo cinco mililitros de TCEP em um tubo.
Em seguida, pipete a mistura sobre as células no deslizamento de cobertura e incubar à temperatura ambiente por uma hora na câmara de umidade. Para lavar os deslizamentos de cobertura, pipeta 200 microliters de DPBS em cada deslizamento de cobertura e deixar no lugar por 10 minutos. Repita a lavagem mais duas vezes.
Remova os deslizamentos de cobertura da última lavagem e inverta em um slide de microscopia pré-limpo com uma gota de meio de montagem. Armazene as amostras durante a noite em um congelador de 20 graus Celsius antes de visualizar sob o microscópio. Visualize as células usando os conjuntos de filtros apropriados para DAPI e Texas Red.
Consulte o texto completo para um protocolo sobre como rotular SUM e gôndeas nematoides fixas. Embora rotular células de mamíferos seja bastante simples, rotular oócitos nematode requer treinamento prévio em dissecções de gônada. KmUTAG-FL incubado com células PMT2 fixas mostrou uma mancha nuclear distinta.
Tanto a coloração nuclear difusa quanto os focos nucleares distintos eram visíveis. A localização nuclear foi confirmada por meio de co-coloração com DAPI. Consistente com a atividade de captura de SUMÔ da KmUTAG-FL, o padrão de localização nuclear era uma reminiscência da coloração SUMO23.
A co-coloração com anticorpo anti-SUMO23 8A2 confirmou a co-localização do KmUTAG-FL com o sinal SUMO23. Isso valida a eficácia do KmUTAG-FL para detectar SUMO23 em células de mamíferos. Gônnadas isoladas da hermafrodita adulta produtora de oócito c.
nematoides elegans foram rotulados com anticorpo anti-SUM. Consistente com relatórios anteriores, anticorpo anti-SUM inicialmente localizado ao plasmo nuclear de oócitos de prophase mioticos tardios. Ele então redistribuiu para o complexo de anel central dos homólogos emparelhados como o envelope nuclear quebrou e os cromossomos congressos em direção à placa de metafásico.
Em preparações paralelas, gônadas rotuladas com KmUTAG-FL revelaram padrões semelhantes. KmUTAG-FL passou de rotular o nucleoplasma para concentrar-se no complexo do anel quando os oócitos começaram e concluíram o processo de quebra do envelope nuclear. Esses resultados validam o KmUTAG-FL como uma ferramenta útil para a análise de processos relacionados à mísia e sumô em c.
elegans e possivelmente outros nematoides. Ao realizar a fixação, é fundamental usar paraformaldeído fresco e um curto tempo de fixação para manter o SUMO dobrado nativamente para que possa ser reconhecido pelo KmUTAG. Uma vez que a estrutura terciária do SUMO é altamente conservada, é muito provável que as variantes SUMO de modelos adicionais e sistemas não-modelo possam ser analisadas com o reagente KmUTAG-FL.
Atualmente, estamos usando esta nova proteína UTAG fluorescente para estudar a função de SUM durante o estresse celular. Por fim, observe que todas as etapas que utilizam o paraformaldeído fixante devem ser realizadas em uma capa de segurança de laboratório e este reagente deve ser descartado corretamente.
