A OCT é um agente de criopreservação incompatível com a análise de espectrometria de massas. Usando este protocolo, os pesquisadores podem remover OCT dos tecidos e quantificar esfingolipídios com espectrometria de massa por cromatografia líquida tandem. A preparação de mechas de secagem de tecidos, lavagem de tecidos e pesagem de tecidos será demonstrada por April Boyd, da Virginia Commonwealth University, e a extração lipídica será demonstrada pelo Dr. Jeremy Allegood, diretor do Virginia Commonwealth Metabolomics and Lipidomics Core.
Para começar, limpe a tesoura cirúrgica imergindo-a em metanol por cinco minutos, seguida de limpá-las com um tecido de grau laboratorial limpo. Usando luvas sem pó, gire a extremidade de um tecido de grau de laboratório para criar um pavio finamente cônico de 30 a 40 milímetros de comprimento. Em seguida, usando a tesoura limpa de metanol, corte o pavio na extremidade grossa e coloque-o em uma caixa de papelão limpa.
Em seguida, usando a tesoura limpa de metanol, corte de quatro a cinco milímetros da ponta de uma ponta de pipeta de um mililitro e coloque a ponta de volta no suporte da ponta. Para lavar o OCT dos tecidos, adicione 10 mililitros de água deionizada ultrapura gelada a cada tubo contendo tecido pulmonar humano e cubra-os com força. Deixe os tubos incubarem por 10 minutos.
Vórtice vigorosamente cada tubo até que todo o tecido depositado nas paredes do tubo ou no pellet de tecido seja completamente ressuspenso. Em seguida, centrifugar os tubos em uma centrífuga de balde oscilante pré-refrigerada a 4.000 a 5.000 vezes G por 10 minutos a quatro graus Celsius. Uma vez que a centrifugação esteja completa, destrate os tubos no gelo.
Aspirar cuidadosamente a solução de lavagem, deixando aproximadamente 0,5 mililitros do sobrenadante no tubo e, em seguida, reencapa o tubo. Depois de remover o sobrenadante de todos os tubos, lave os tecidos mais duas vezes da mesma maneira. Após as três lavagens de remoção OCT, use a ponta da pipeta encurtada preparada para adicionar 500 microlitros de PBS gelado ao tubo.
Usando a mesma ponta, ressuspeite suavemente o pellet e transfira todo o tecido ressuspenso para um tubo de centrífuga de 1,5 mililitro pré-rotulado e pré-pesado. Mantenha o tubo no gelo até que todas as amostras de tecido sejam transferidas. Pellet os tecidos centrifugando os tubos em uma centrífuga pré-refrigerada, em seguida, aspirar cuidadosamente o máximo possível do PBS sem perturbar o pellet e coloque os tubos de volta no gelo.
Usando as mechas de secagem de tecido preparadas anteriormente, remova suavemente qualquer solução de lavagem restante, feche o tubo e coloque-o no gelo. Para pesar os tubos, coloque um tubo de cada vez em uma balança analítica alcatroada e zerada recentemente calibrada e feche a porta da câmara. Uma vez que o peso tenha se estabilizado, registre-o em uma planilha eletrônica.
Após a pesagem, coloque o tubo de volta no gelo e adicione 300 microlitros de PBS gelado. Usando uma ponta de pipeta encurtada, transfira cuidadosamente todo o tecido em dois mililitros de metanol gelado em um tubo de vidro superior de parafuso pré-rotulado. Antes da extração lipídica, permita que os tecidos e os padrões lipídicos internos de espectrometria de massa se equilibrem à temperatura ambiente por 20 minutos, depois vortex e mergulhem as soluções padrão internas em um banho-maria ultrassônico até que os padrões lipídicos tenham se dissolvido completamente.
Usando uma pipeta de repetição, adicione 250 picomoles dos padrões internos de espectrometria de massa a cada tubo e recapitule levemente os tubos. Para facilitar a homogeneização, ajuste o volume de metanol para dois mililitros e, em seguida, triture o tecido usando um homogeneizador movendo a ponta do homogeneizador em um movimento circular suavemente pressionado contra a parede do tubo. Quando os aglomerados não estiverem mais visíveis, recapeie o tubo.
Mergulhe o tubo em um ângulo de 45 graus em um banho de água ultra-sônico por 5 a 10 segundos. Em seguida, sob um exaustor, adicione clorofórmio e metanol a cada tubo para obter uma proporção de metanol para clorofórmio para água de dois para um para 0,1. Sele bem os tubos e deixe-os na bancada até o final do dia.
Antes de sair naquela noite, coloque os tubos bem tampados em um banho de água de 48 graus Celsius para uma incubação durante a noite. No dia seguinte, pelota qualquer solvente e detritos solúveis por centrifugação. Em seguida, em um exaustor, decante cuidadosamente o sobrenadante em tubos de ensaio de vidro borossilicato de 13 a 100 milímetros pré-rotulados de 13 a 45 graus para facilitar a decantação.
Depois de decantar o sobrenadante de todos os tubos, use um concentrador de vácuo no vácuo máximo com uma etapa inicial de aquecimento de uma hora a 40 graus Celsius para evaporar todo o solvente e, em seguida, adicione 500 microlitros de metanol a cada tubo. Para ressuspender os extratos lipídicos secos, vortex o tubo por 5 a 10 segundos, em seguida, mergulhe o tubo em um banho de água ultra-sônico em um ângulo de 45 graus com rotação por dois minutos. Re-vórtice o tubo por cinco segundos e re-imergir no banho de água ultra-sônico por um minuto adicional.
Remova quaisquer detritos insolúveis por centrifugação e, em seguida, decante o sobrenadante em um frasco para injetáveis autoinjetor pré-rotulado inclinado em um ângulo de 30 a 45 graus para facilitar a decantação. Tampar os frascos para injetáveis firmemente antes de os armazenar a menos 80 graus Celsius até à análise. A análise de espectrometria de massa em tandem de ionização por cromatografia líquida após a remoção da OCT confirma que várias espécies de ceramidas e monohexosil-ceramidas de comprimento de cadeia estão significativamente elevadas em tumores de adenocarcinoma pulmonar humano em comparação com tecidos adjacentes normais não envolvidos.
Os padrões esfingolipídicos eluem sequencialmente na seguinte ordem:d17:1 esfingosina, d17:1 esfingosina-1-fosfato, C12 lactosil-ceramida, C12 monohexosil-ceramida, C12 esfingomielina e C12 ceramida. Para cada uma dessas espécies de esfingolipídios, usando as configurações de gradiente e instrumentação no texto, há um deslocamento positivo aproximado de 0,15 minuto no tempo de retenção para cada dois aumentos de carbono no comprimento da cadeia. No entanto, lipídios de maior comprimento de cadeia, como C24 e C26, podem ter maiores mudanças no tempo de retenção.
Além disso, uma ligação dupla no ácido graxo geralmente resulta em uma mudança negativa de 0,15 minuto no tempo de retenção. Assim, a ceramida C18:1 terá um tempo de retenção semelhante à ceramida C16. Em vez de depender quase exclusivamente de tecidos recém-coletados, este protocolo expande as fontes de tecido que podem ser usadas para análise de espectrometria de massa para incluir aquelas criogenicamente armazenadas em biorrepositórios.
