Agradecemos Kymberlee O&#39;Brien, Celia Moore e Edward Tronick (Departamento de Psicologia da Universidade de Massachusetts, Boston) para fornecer as amostras de cabelo humano analisadas neste estudo, e Stephen Suomi e Amanda Dettmer (Laboratório de Etologia Comparada, NICHD) para fornecer as amostras de cabelo macaco rhesus. Desenvolvimento inicial e continuada utilização deste método tem sido apoiado pelo NIH RR11122 para MAN

1. Coleta de Amostras e Armazenamento <ol><li> Cabelo humano <ol><li> Fixar a todo o comprimento do cabelo a ser amostrado (até um lápis de largura em diâmetro) com uma faixa de borracha ou clipe. Cortar o cabelo o mais próximo possível do couro cabeludo possível (tomando cuidado para não cortar a pele) com um pano limpo tesoura. Nota: A área de amostragem padrão é o vértice posterior do crânio. </li><li> Alguns investigadores relataram um declínio nos níveis de CORT cabelos humanos com a distância do couro cabeludo 6, que pode ser devido à lavagem da exposição repetida à água e shampoo 7 (apesar de ver Manenschijn et al. 8 e Thomson et al. 9 para resultados contrários em que não houve declínio segmentar) Para minimizar o impacto desse potencial &quot;efeito washout&quot;, recomendamos a coleta de segmentos proximal cabelo no couro cabeludo com um comprimento não superior a 3 cm (assumindo uma taxa de crescimento média de 1 cm / mês 10, um 3 centímetros segmento contém CTRO que foi depositado ao longo de aproximadamente os últimos 3 meses). Para isso, use uma régua para medir 3 cm do primeiro corte e cortar novamente para produzir a amostra de 3 cm. Observação: Uma vez que o cabelo foi cortado em comprimento, que não é mais necessária para manter os fios no alinhamento, a menos que o estudo envolve o corte da amostra em diferentes segmentos de 1 cm de comprimento para estabelecer um calendário retrospectiva de deposição CORT durante o período de tempo antes da amostragem 6. </li><li> Colocar a amostra de cabelo de uma bolsa feita de folha de alumínio, um envelope de papel limpa, ou a cerca de 15 ml com tampa de rosca de polipropileno tubo de centrífuga do tipo usado para a lavagem da amostra. Como CORT é extremamente estável no cabelo 2, as amostras podem ser armazenadas indefinidamente a -20 ° C e, se necessário, enviado durante a noite à temperatura ambiente. </li><li> O procedimento de coleta de cabelo deve ser praticado de voluntários e as amostras de prática devem ser pesados ​​antes de embarcar em um estudo completo. Nota: As amostras de cabelo como small como 5-10 mg podem ser analisadas utilizando os métodos descritos aqui, embora seja desejável para recolher amostras de&gt; 10 mg para minimizar a probabilidade de obtenção de leituras EIA abaixo do mais baixo nível CORT. </li></ol></li><li> Cabelo macaco <ol><li> Raspar o cabelo (100-250 mg) a partir da nuca usando um cortador de animais padrão. Raspar o mais próximo da pele quanto possível, tomando cuidado para não nick a pele e causar sangramento, porque os níveis de CORT sangue são extremamente elevados em relação aos encontrados no cabelo. Nota: A área do pescoço foi escolhido para a amostragem de rotina, porque geralmente é uma boa fonte de cabelo e pode ser facilmente observada para o crescimento do cabelo antes de reamostragem. </li><li> Coloque a amostra de cabelo em uma bolsa feita de folha de alumínio ou a 15 ml com tampa de rosca de polipropileno tubo de centrífuga. As amostras de cabelo do macaco devem ser armazenados e transportados da mesma maneira como acima descrito para as amostras de cabelo humano. </li><li> Porque o cabelo macaco, ao contrário de cabelo do couro cabeludo humano, cresce a um determinado período e depois ruaops crescimento 11, que não é geralmente possível, neste caso, ao usar a distância a partir da pele como um calendário para a deposição CORT. No entanto, se um animal pode ser amostrado mais do que uma vez (por exemplo, durante os exames periódicos de saúde de rotina), é desejável efectuar uma barbear inicial para definir um ponto de tempo de linha de base e, em seguida, reshave a mesma área, após o período de tempo desejado tenha decorrido. CORT na segunda amostra foi depositada durante o intervalo de barbear-reshave, o que permite uma atribuição precisa de conteúdo CORT da amostra a atividade do eixo HPA durante esse intervalo de 5. </li></ol></li></ol> 2. Lavar Sample e Secagem <ol><li> Lavagem <ol><li> Coloque cada amostra de cabelo para a 15 ml com tampa de rosca de polipropileno tubo de centrífuga. </li><li> Adicionar 5 ml de cromatografia líquida de alta eficiência de isopropanol (HPLC) de grau para cada tubo seguido por inversão repetida durante 3 minutos usando um rotor. </li><li> Decantar o isopropanol em um recipiente de resíduos, tendo csão para não perder qualquer da amostra. </li><li> Repita os passos 2.1.2 e 2.1.3, mais uma vez. </li></ol></li><li> Secagem <ol><li> Seca-se o cabelo, durante pelo menos 2-3 dias para assegurar a evaporação completa isopropanol. </li></ol></li></ol> 3. Moagem de amostras e CORT Extração - Método 1 para amostras grandes <ol><li> Amostra de moagem <ol><li> Colocar-se a 250 mg de cabelo seco em 10 ml de aço inoxidável de moagem frasco, juntamente com uma única bola de moagem de aço inoxidável de 12 mm. </li><li> Moer a amostra durante 6 min a uma velocidade de 25 Hz, utilizando um moinho de bolas. </li><li> Pesar até 50 mg de cabelo em pó em uma balança analítica e, em seguida, transferi-lo para um 2,0 ml de polipropileno tubo de microcentrífuga limpo para extração CORT subseqüente. </li></ol></li><li> Extração CORT <ol><li> Adicionar 1,0 ml de metanol de grau HPLC para o tubo de microcentrífuga contendo a amostra em pó. </li><li> Tapar o tubo e incubar a amostra durante 18-24 horas à temperatura ambiente com o coinversão nstant usando um rotor. </li><li> Centrifugar os tubos a 14.000 rpm durante 1 min à temperatura ambiente para sedimentar o cabelo em pó. </li><li> Transferir 0,6 ml do sobrenadante para um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml limpo, tomando cuidado para não perturbar o pellet de cabelo em pó. </li></ol></li></ol> 4. Moagem de amostras e CORT Extração - Método 2 para pequenas amostras <ol><li> Amostra de moagem <ol><li> Coloque até 60 mg de cabelo em um pré-pesado 2 ml tubo de microcentrífuga talão reforçado para bater. </li><li> Pesar novamente o frasco para obter o peso da amostra. </li><li> Adicionar três esferas de aço cromo 3,2 milímetros a cada frasco e depois moer a amostra durante pelo menos 2 minutos num batedor de esferas. Se a inspeção visual revela que a amostra não é suficientemente pulverizado, em seguida, executar moagem adicional para 0,5 ou 1 min. Nota: A transferência do cabelo chão é necessário neste caso, pois a extracção CORT é realizada no mesmo frasco, como moagem. </li></ol&gt; </li><li> Extração CORT <ol><li> Adicionar 1,5 ml de metanol de grau HPLC para o tubo de microcentrífuga contendo a amostra em pó. </li><li> Tapar o tubo e incubar a amostra durante 18-24 horas à temperatura ambiente, com inversão constante usando um rotor. </li><li> Centrifugar os tubos a 10.000 rpm durante 5 min à temperatura ambiente para sedimentar o cabelo em pó. Nota: As esferas de aço cromo permanecer no tubo com o cabelo durante os passos de extracção e centrifugação, que representa a velocidade de centrifugação mais baixa em comparação com o método 1. </li><li> Transferir 1,0 ml do sobrenadante para um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml limpo, tomando cuidado para não perturbar o pellet de cabelo em pó. </li></ol></li></ol> 5. A evaporação do solvente e da Amostra Reconstituição <ol><li> Seca-se o metanol utilizando um evaporador de vácuo ou de uma corrente de azoto gasoso, se um evaporador de vácuo não está disponível. Se um evaporador de vácuo é utilizada, o vapor de metanol pode ser presa por meiosde uma câmara de frio ou uma armadilha químico equipado com um cartucho de carvão ativado. </li><li> Após a remoção do metanol, reconstituir o extracto CORT num volume apropriado de tampão de ensaio EIA (ensaio de diluente). Se os valores relativamente altos de CORT são antecipados, então, usar um volume de tampão de 0,4 ml ou mais. Se os valores relativamente baixos estão previstos, em seguida, o volume pode ser reduzido para 0,2 ml ou menos para aumentar a sensibilidade. Nota: 0,2 ml de volume é suficiente para executar aliquotas duplicadas da amostra, pelo menos, duas vezes, no caso de uma repetição da amostra é requerida. </li><li> Ou ensaiar a amostra reconstituída imediatamente ou congelar a -20 ° C para análise posterior. Nota: Se a amostra reconstituída é congelada, é importante para evitar a sublimação durante o período de congelamento desde uma alteração no volume da amostra irá levar a um valor CORT falso quando os cálculos finais são realizadas. </li></ol> 6. CORT Ensaio e conversão de dados <ol><li> Analise os extratos de cabelo paraCORT usando uma enzima imunoensaio de alta sensibilidade kit (EIA). Nota: Se estiver usando um kit comercial salivar CORT EIA, siga as recomendações do fabricante, conforme especificado no folheto do kit, exceto que as amostras de teste será alíquotas duplicadas de cada extrato reconstituído cabelo em vez de amostras de saliva. </li><li> Prepare um controle de qualidade (QC) extrato de cabelo para uso em cada ensaio. <ol><li> Coletar uma série de amostras de cabelo extras e quer processá-los individualmente como nas etapas 4.1 e 4.2 ou da piscina-los para grande amostra de transformação como nos passos 3.1 e 3.2. </li><li> Evapora-se o solvente e reconstituir os extractos como nos passos 5.1 e 5.2, em seguida, reunir os extractos reconstituídos a partir de várias amostras individuais ou reunidos. </li><li> Alíquota um volume adequado do extracto reconstituído reunidas (por exemplo, 0,10 ml) em tubos de microcentrífuga individuais e congelar para uso posterior. </li><li> Descongele e executar uma alíquota QC em duplicado em cada microplaca imunoensaio para fornecer uma referência valor CORT para verificar a qualidade de cada execução. </li><li> Um coeficiente de intra-ensaio de variação (CV; definida como o desvio padrão dividido pela média de um conjunto de valores de amostra) pode ser calculada por meio da análise de 10-12 QC poços no mesmo ensaio, ao passo que um inter-ensaio pode ser calculada usando os valores de QC através de um grupo de pistas. Se um software de leitor de microplacas calcula um CV, nos alvéolos repetidos, representando cada extrato de cabelo, em seguida, um método alternativo para a determinação intra-ensaio é calcular a média desses valores de CV individuais em toda a placa. </li><li> Se qualquer extracto da amostra produz uma leitura maior do que o padrão mais elevado CORT no EIA, em seguida, uma outra parte alíquota do extracto é diluído com um volume adequado de tampão de ensaio e a leitura EIA subsequente é corrigido para o factor de diluição. As amostras também são rotineiramente reanalisados ​​se o CV, nos alvéolos repetidos é&gt; 10%. </li><li> Porque kits CORT EIA são projetados para medir CORT values em amostras de líquidos, tais como a saliva ou o plasma, a saída do suporte lógico do leitor de microplacas deve ser convertido em valor de CORT por unidade de peso de cabelo em pó. A fórmula a seguir converte saída ensaio em mg / dl para CORT pg por cabelo mg: (A / B) * (C / D) * E * 10.000 = F onde A = ug / dl a partir da saída de ensaio, B = peso (em mg) de cabelo sujeita a extracção, C = vol. (Em ml) de metanol para o cabelo em pó; D = vol. (Em ml) de metanol recuperado a partir do extracto e, subsequentemente, secou-se para baixo, E = vol. (Em ml) de tampão de ensaio utilizado para reconstituir o extracto seco, e F = valor final da concentração de CORT cabelo em pg / mg. </li></ol></li></ol>

<ol>
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Os autores não têm conflitos de interesse a declarar.

O procedimento CORT cabelo acima descrito é simples de realizar, é relativamente barato, faz uso de produtos químicos facilmente disponíveis, reagentes e material, e requer equipamento que, com uma excepção, é provável que esteja presente em um laboratório analítico típico. A excepção é um aparelho de moagem tal como um moinho de bolas ou um mini-beadbeater. Notamos que alguns grupos de pesquisa mediu amostras de cabelo em pequenos fragmentos de aproximadamente 1 mm de comprimento 12, mas com ba...

Medição de CORT no plasma, saliva, ou, ocasionalmente, na urina ou fezes tem sido utilizada como um índice de stress fisiológico desde a descoberta do papel do eixo HPA em tensão 1 de Selye. Embora inúmeros artigos têm sido publicados relativos atividade HPA a situações estressantes de forma aguda, o campo tem sido dificultada pela falta de um índice simples e confiável de estresse fisiológico crônica. Este problema surge porque plasma e saliva tanto rendimento &quot;Ponto&quot; estimativas da actividade HPA que estão sujeitas a variação circadiana e podem ser confundidos por distúrbios ambientais. Amostras urinária e fecal produzir medidas de CORT e / ou eliminação de metabolito que abrangem um número de horas até um dia inteiro em alguns casos. Recolha de amostras múltiplas, utilizando qualquer uma destas matrizes podem fornecer um índice composto bruto de níveis CORT ao longo do tempo, no entanto, nenhuma destas abordagens fornece um índice verdadeiramente de longa duração de actividade HPA e a capacidade de resposta deste sydeter a estressores crônicos. Medindo CORT no cabelo começou a preencher esta necessidade importante na literatura stress. Estudos iniciais por vários laboratórios demonstrou a presença de CORT em cabelo humano, mas não se investigar se os níveis de CORT cabelo alterado como uma função da tensão 2. Como o nosso laboratório tem se interessado por muitos anos na regulação do eixo HPA macaco rhesus por vários fatores sociais e comportamentais 3, nos propusemos a estabelecer e validar métodos para extração e análise de cabelo macaco rhesus 4. Com base na premissa de que CORT proveniente do sangue é lenta e continuamente incorporadas no crescimento do cabelo, o objectivo deste novo método é a utilização dos níveis de CORT derivado de cabelo como um índice de actividade HPA integrada ao longo de períodos de semanas a meses. Vários desafios metodológicos foram encontrados no desenvolvimento do presente protocolo. Em primeiro lugar, os estudos anteriores tinham mostrado que as pequenas quantidades of circulando CORT são excretados no suor e sebo e, portanto, poderia revestir a parte externa do fio de cabelo 2. A fim de eliminar este confundir potencial, desenvolvemos um procedimento de lavagem suave que aparece para remover CORT externo, tendo um efeito mínimo sobre CORT presentes na crescente eixo do cabelo. Assim, o cabelo macaco submetidos a este procedimento (ou seja, duas lavagens de 3 min, com o isopropanol) perdeu cerca de 7-8% do teor total de CORT cabelo, e uma terceira lavagem removido menos de 1% a mais de esteróides a partir da amostra 4. Parece haver CORT mais externo em cabelo humano, uma vez que o mesmo procedimento removeu uma média do conteúdo total CORT 27% das amostras (K. Rosenberg e J. Meyer, ainda não publicados). Como o cabelo macaco, no entanto, uma lavagem adicional contido muito menos CORT (cerca de 7%) do que as duas primeiras lavagens. Portanto, os resultados de ambos macaco e cabelo humano apoiar a afirmação de que a maioria (se não todos) CORT externo pode ser removido, mantendo uma grande fracção de CORT dentro da matriz do cabelo interna. Em segundo lugar, os nossos estudos piloto também mostraram que a moagem do cabelo antes da extracção aumentou significativamente a recuperação CORT a partir da amostra, presumivelmente ao romper a matriz proteica complexa do eixo do cabelo, bem como aumentando a área de superfície disponível para a penetração do solvente. Foram desenvolvidos dois métodos de moagem diferentes, cada um deles com vantagens e desvantagens. Método 1, que utiliza um moinho de bolas, tem a vantagem de produzir o pó fino. Contudo, num moinho de esferas é um item de equipamento relativamente dispendioso e, se utilizado com frascos de moagem convencionais e as esferas, que é capaz de moer somente duas amostras de cada vez. As amostras pequenas são também difíceis de processar utilizando um moinho de bolas com frascos de moagem convencionais. Método 2, que utiliza uma beadbeater, é menos eficaz na sua capacidade de moagem. Como resultado, a recuperação média CORT é aproximadamente 10% menor usando este método em comparação com o moinho de bolas (dados não publicados). Por outro lado, um beadbeateré consideravelmente menos dispendiosa do que um moinho de bolas, 16-24 amostras podem ser moídos em uma vez, dependendo do modelo, e o método é adequado para pequenas amostras. Devido à recuperação diferencial acima mencionado, é aconselhável utilizar o mesmo método de moagem para todas as amostras de um determinado estudo. Uma vez que as amostras de cabelo foram processados, eles são extraídos com metanol e CORT nos extractos são analisados ​​por meio de um kit comercial de EIA sensível e específico originalmente concebido para medir CORT salivar. Os procedimentos de extração e ensaio foram validados em parte, demonstrando que diluições em série de extratos de amostras de cabelo macaco rendeu leituras de AIA que se assemelhavam de perto as leituras obtidas a partir de padrões de CORT autênticos. Em seguida, mostrou que CORT cabelo (além de plasma e saliva CORT) foi sensível à grande estressor vida de uma deslocalização administrativamente mandato dos macacos para novos bairros habitacionais 4,5. O present documento fornece uma descrição detalhada dos métodos utilizados rotineiramente em nosso laboratório para processar amostras de cabelo humano e de macaco e extrair e analisar CORT de tais amostras.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="798">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">HPLC-grade isopropanol</td>
			<td style="width:116px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">A451</td>
			<td style="width:247px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">HPLC-grade methanol</td>
			<td style="width:116px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">A452</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">Salivary cortisol assay kits</td>
			<td style="width:116px;">Salimetrics</td>
			<td style="width:119px;">1-3002</td>
			<td>See manufacturer&#39;s kit insert for information on assay sensitivity and specificity</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">15-ml polypropylene screw-cap centrifuge tubes</td>
			<td style="width:116px;">Max Scientific</td>
			<td>10-9151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">1.5-ml Safe-Lock microcentrifuge tubes</td>
			<td style="width:116px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">05-402-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">2.0-ml Safe-Lock microcentrifuge tubes</td>
			<td style="width:116px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">05-402-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">2.0-ml XXTuff reinforced microvials</td>
			<td style="width:116px;">BioSpec</td>
			<td>330TX</td>
			<td>Use with mini-beadbeater</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">3.2-mm chrome-steel beads</td>
			<td style="width:116px;">BioSpec</td>
			<td>11079132c</td>
			<td>Use with mini-beadbeater</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">10-ml stainless steel grinding jars</td>
			<td style="width:116px;">Retsch</td>
			<td style="width:119px;">02.462.0061</td>
			<td>Use with mixer mill</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">12-mm stainless steel grinding balls</td>
			<td style="width:116px;">Retsch</td>
			<td style="width:119px;">05.368.0037</td>
			<td>Use with mixer mill</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Savant activated carbon cartridge</td>
			<td style="width:116px;">Fisher</td>
			<td>DTK120R</td>
			<td>Use with Savant chemical trap</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;"></td>
			<td style="width:116px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;"></td>
			<td style="width:116px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">Name of Equipment</td>
			<td style="width:116px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td>Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">Rotator for 15-ml centrifuge tubes</td>
			<td style="width:116px;">Fisher</td>
			<td>S02135</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">Rotator for microcentrifuge tubes</td>
			<td style="width:116px;">Fisher</td>
			<td>NC9854190&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Benchtop centrifuge for microcentrifuge tubes</td>
			<td style="width:116px;">Fisher</td>
			<td>13-100-675</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">MM 200 mixer mill</td>
			<td style="width:116px;">Retsch</td>
			<td style="width:119px;">20.746.0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mini-Beadbeater 16&#160;</td>
			<td style="width:116px;">BioSpec</td>
			<td>607</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Savant DNA Speedvac</td>
			<td style="width:116px;">Fisher</td>
			<td>DNA120-115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Savant refrigerated vapor trap</td>
			<td style="width:116px;">Fisher</td>
			<td>RVT400-115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Savant chemical trap</td>
			<td style="width:116px;">Fisher</td>
			<td>SCT120</td>
			<td>Alternative to refrigerated vapor trap</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microplate reader</td>
			<td style="width:116px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microplate washer</td>
			<td style="width:116px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microplate mixer</td>
			<td style="width:116px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">Multichannel pipetter</td>
			<td style="width:116px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Analytical balance</td>
			<td style="width:116px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

extraction and analysis of cortisol from human and monkey hair

O hormônio do estresse cortisol (CORT) está lentamente incorporado no eixo do cabelo crescente de seres humanos, primatas não-humanos e outros mamíferos. Temos desenvolvido e validado um método para extração e análise de CORT cabelo macaco rhesus e, posteriormente adaptado este método para uso com cabelo do couro cabeludo humano. Em contraste com CORT &quot;amostras pontuais&quot; obtidos a partir de plasma ou saliva, cabelo CORT fornece uma medida integrada da atividade do sistema hipotalâmico-pituitário-adrenal (HPA), e, assim, o estresse fisiológico, durante o período de hormônio de incorporação. Porque o cabelo do couro cabeludo humano cresce a uma taxa média de 1 cm / mês, os níveis de CORT obtidos a partir de segmentos de cabelo várias cm de comprimento pode potencialmente servir como um biomarcador de estresse experimentado ao longo de vários meses. No nosso método, cada amostra de cabelo é lavado primeiro duas vezes em isopropanol, para remover qualquer CORT a partir do exterior da haste do cabelo que foi depositada a partir de suor ou de sebo. Após a secagem, oamostra é moída a um pó fino, para quebrar a proteína da matriz do cabelo e aumentar a área de superfície para a extracção. CORT a partir do interior da haste do cabelo é extraído em metanol, o metanol é evaporado, e o extracto é reconstituída em tampão de ensaio. Extraído CORT, juntamente com padrões de qualidade e, em seguida, é analisada por meio de um imunoensaio de enzima disponível comercialmente sensível e específico kit (EIA). Leitura do EIA é convertido em CORT pg por mg de peso cabelo em pó. Este método tem sido utilizado em nosso laboratório para analisar CORT cabelo em humanos, várias espécies de macacos, sagüis, cães e ursos polares. Muitos estudos, tanto do nosso laboratório e de outros grupos de pesquisa demonstraram a ampla aplicabilidade da CORT cabelo para avaliar a exposição ao estresse crônico no natural, bem como as configurações de laboratório.

A Figura 1 mostra a impressão a partir de um conjunto representativo de amostras de cabelo humano (adulto masculino e feminino) sujeitos humanos processados ​​usando o método 2 de moagem e extração. O software de computador foi utilizada para gerar a saída de dados e para se ajustar uma curva sigmoidal de quatro parâmetros para os padrões CORT (Figura 2). Os entre-bem currículos deste prato variou 0,01-5,73%, com um intra-ensaio média de 1,34%. O CV inter-ensaio determinada...

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Extraction and Analysis of Cortisol from Human and Monkey Hair

O cortisol (CORT) acumula-se no eixo do crescimento de cabelo de humanos e primatas não-humanos. Nós descrevemos métodos para extrair e analisar CORT cabelo com alta precisão e sensibilidade. Medição de cabelo CORT é particularmente bem adequado para a avaliação de stress crónico durante períodos de semanas a meses.

Extração e Análise de Cortisol de cabelo humano e do macaco

The stress hormone cortisol (CORT) is slowly incorporated into the growing hair shaft of humans, nonhuman primates, and other mammals. We developed and ...

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Research

JoVE Journal

Biology

28.1K visualizações.  University of Massachusetts, Amherst.  O cortisol (CORT) acumula-se no eixo do crescimento de cabelo de humanos e primatas não-humanos. Nós descrevemos métodos para extrair e analisar CORT cabelo com alta precisão e sensibilidade. Medição de cabelo CORT é particularmente bem adequado para a avaliação de stress crónico durante períodos de semanas a meses. 

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A Neuronal and Astrocyte Co-Culture Assay for High Content Analysis of Neurotoxicity

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing measurement of multiple cellular phenotypes within a single assay. In this study, we utilized HCA to develop a novel assay for neurotoxicity. Neurotoxicity assessment represents an important part of drug safety evaluation, as well as being a significant focus of environmental protection efforts. Additionally, neurotoxicity is also a well-accepted in vitro marker of the development of neurodegenerative diseases such as Alzheimer's and Parkinson's diseases. Recently, the application of HCA to neuronal screening has been reported. By labeling neuronal cells with &beta;III-tubulin, HCA assays can provide high-throughput, non-subjective, quantitative measurements of parameters such as neuronal number, neurite count and neurite length, all of which can indicate neurotoxic effects. However, the role of astrocytes remains unexplored in these models. Astrocytes have an integral role in the maintenance of central nervous system (CNS) homeostasis, and are associated with both neuroprotection and neurodegradation when they are activated in response to toxic substances or disease states. GFAP is an intermediate filament protein expressed predominantly in the astrocytes of the CNS. Astrocytic activation (gliosis) leads to the upregulation of GFAP, commonly accompanied by astrocyte proliferation and hypertrophy. This process of reactive gliosis has been proposed as an early marker of damage to the nervous system. The traditional method for GFAP quantitation is by immunoassay. This approach is limited by an inability to provide information on cellular localization, morphology and cell number. We determined that HCA could be used to overcome these limitations and to simultaneously measure multiple features associated with gliosis - changes in GFAP expression, astrocyte hypertrophy, and astrocyte proliferation - within a single assay. In co-culture studies, astrocytes have been shown to protect neurons against several types of toxic insult and to critically influence neuronal survival. Recent studies have suggested that the use of astrocytes in an in vitro neurotoxicity test system may prove more relevant to human CNS structure and function than neuronal cells alone. Accordingly, we have developed an HCA assay for co-culture of neurons and astrocytes, comprised of protocols and validated, target-specific detection reagents for profiling &beta;III-tubulin and glial fibrillary acidic protein (GFAP). This assay enables simultaneous analysis of neurotoxicity, neurite outgrowth, gliosis, neuronal and astrocytic morphology and neuronal and astrocytic development in a wide variety of cellular models, representing a novel, non-subjective, high-throughput assay for neurotoxicity assessment. The assay holds great potential for enhanced detection of neurotoxicity and improved productivity in neuroscience research and drug discovery.

This article describes a novel protocol and reagent set designed for sensitive measurement of neurotoxic effects of compounds and treatments on co-cultures of neurons and astrocytes using high content analysis. Results demonstrate that high content analysis represents an exciting novel technology for neurotoxicity assessment.

A Neuronal e astrocitária Ensaio Co-Cultura de Análise de Conteúdo de Alta de neurotoxicidade

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing ...

Biologia

Extraction of High Molecular Weight Genomic DNA from Soils and Sediments

The soil microbiome is a vast and relatively unexplored reservoir of genomic diversity and metabolic innovation that is intimately associated with nutrient and energy flow within terrestrial ecosystems. Cultivation-independent environmental genomic, also known as metagenomic, approaches promise unprecedented access to this genetic information with respect to pathway reconstruction and functional screening for high value therapeutic and biomass conversion processes. However, the soil microbiome still remains a challenge largely due to the difficulty in obtaining high molecular weight DNA of sufficient quality for large insert library production. Here we introduce a protocol for extracting high molecular weight, microbial community genomic DNA from soils and sediments. The quality of isolated genomic DNA is ideal for constructing large insert environmental genomic libraries for downstream sequencing and screening applications. 
The procedure starts with cell lysis. Cell walls and membranes of microbes are lysed by both mechanical (grinding) and chemical forces (&beta;-mercaptoethanol). Genomic DNA is then isolated using extraction buffer, chloroform-isoamyl alcohol and isopropyl alcohol. The buffers employed for the lysis and extraction steps include guanidine isothiocyanate and hexadecyltrimethylammonium bromide (CTAB) to preserve the integrity of the high molecular weight genomic DNA. Depending on your downstream application, the isolated genomic DNA can be further purified using cesium chloride (CsCl) gradient ultracentrifugation, which reduces impurities including humic acids. The first procedure, extraction, takes approximately 8 hours, excluding DNA quantification step. The CsCl gradient ultracentrifugation, is a two days process. During the entire procedure, genomic DNA should be treated gently to prevent shearing, avoid severe vortexing, and repetitive harsh pipetting.

A methodology to isolate high molecular weight and high quality genomic DNA from soil microbial community is described.

Extração de DNA genômico de alto peso molecular de solos e sedimentos

The soil microbiome is a vast and relatively unexplored reservoir of genomic diversity and metabolic innovation that is intimately associated with ...

DNA Extraction from Paraffin Embedded Material for Genetic and Epigenetic Analyses

Disease development and progression are characterized by frequent genetic and epigenetic aberrations including chromosomal rearrangements, copy number gains and losses and DNA methylation. Advances in high-throughput, genome-wide profiling technologies, such as microarrays, have significantly improved our ability to identify and detect these specific alterations. However as technology continues to improve, a limiting factor remains sample quality and availability. Furthermore, follow-up clinical information and disease outcome are often collected years after the initial specimen collection. Specimens, typically formalin-fixed and paraffin embedded (FFPE), are stored in hospital archives for years to decades. DNA can be efficiently and effectively recovered from paraffin-embedded specimens if the appropriate method of extraction is applied. High quality DNA extracted from properly preserved and stored specimens can support quantitative assays for comparisons of normal and diseased tissues and generation of genetic and epigenetic signatures 1. To extract DNA from paraffin-embedded samples, tissue cores or microdissected tissue are subjected to xylene treatment, which dissolves the paraffin from the tissue, and then rehydrated using a series of ethanol washes. Proteins and harmful enzymes such as nucleases are subsequently digested by proteinase K. The addition of lysis buffer, which contains denaturing agents such as sodium dodecyl sulfate (SDS), facilitates digestion 2. Nucleic acids are purified from the tissue lysate using buffer-saturated phenol and high speed centrifugation which generates a biphasic solution. DNA and RNA remain in the upper aqueous phase, while proteins, lipids and polysaccharides are sequestered in the inter- and organic-phases respectively. Retention of the aqueous phase and repeated phenol extractions generates a clean sample. Following phenol extractions, RNase A is added to eliminate contaminating RNA. Additional phenol extractions following incubation with RNase A are used to remove any remaining enzyme. The addition of sodium acetate and isopropanol precipitates DNA, and high speed centrifugation is used to pellet the DNA and facilitate isopropanol removal. Excess salts carried over from precipitation can interfere with subsequent enzymatic assays, but can be removed from the DNA by washing with 70% ethanol, followed by centrifugation to re-pellet the DNA 3. DNA is re-suspended in distilled water or the buffer of choice, quantified and stored at -20&deg;C. Purified DNA can subsequently be used in downstream applications which include, but are not limited to, PCR, array comparative genomic hybridization 4 (array CGH), methylated DNA Immunoprecipitation (MeDIP) and sequencing, allowing for an integrative analysis of tissue/tumor samples.

This video demonstrates the protocol for DNA extraction from formalin-fixed paraffin-embedded material. This is a multi-day procedure in which tissue sections are deparaffinized with xylene, rehydrated with ethanol and treated with proteinase K to purify and isolate DNA for subsequent gene-specific or genome-wide analysis.

Extração de DNA de material parafinado Embedded para análises genéticas e epigenéticas

Disease development and progression are characterized by frequent genetic and epigenetic aberrations including chromosomal rearrangements, copy number ...

A Noninvasive Hair Sampling Technique to Obtain High Quality DNA from Elusive Small Mammals

Noninvasive genetic sampling approaches are becoming increasingly important to study wildlife populations. A number of studies have reported using noninvasive sampling techniques to investigate population genetics and demography of wild populations1. This approach has proven to be especially useful when dealing with rare or elusive species2. While a number of these methods have been developed to sample hair, feces and other biological material from carnivores and medium-sized mammals, they have largely remained untested in elusive small mammals. In this video, we present a novel, inexpensive and noninvasive hair snare targeted at an elusive small mammal, the American pika (Ochotona princeps). We describe the general set-up of the hair snare, which consists of strips of packing tape arranged in a web-like fashion and placed along travelling routes in the pikas&#x2019; habitat. We illustrate the efficiency of the snare at collecting a large quantity of hair that can then be collected and brought back to the lab. We then demonstrate the use of the DNA IQ system (Promega) to isolate DNA and showcase the utility of this method to amplify commonly used molecular markers including nuclear microsatellites, amplified fragment length polymorphisms (AFLPs), mitochondrial sequences (800bp) as well as a molecular sexing marker. Overall, we demonstrate the utility of this novel noninvasive hair snare as a sampling technique for wildlife population biologists. We anticipate that this approach will be applicable to a variety of small mammals, opening up areas of investigation within natural populations, while minimizing impact to study organisms.

We present a noninvasive sampling approach to efficiently collect hair samples from elusive small mammals, as shown for the American pika. We demonstrate the utility of this method by extracting DNA from sampled hair and amplifying several types of molecular markers commonly used in studies of wildlife ecology and conservation.

A técnica de amostragem não invasiva cabelo obter DNA de alta qualidade a partir de Elusive Pequenos Mamíferos

Noninvasive genetic sampling approaches are becoming increasingly important to study wildlife populations. A number of studies have reported using ...

Rapid Genetic Analysis of Epithelial-Mesenchymal Signaling During Hair Regeneration

Hair follicle morphogenesis, a complex process requiring interaction between epithelia-derived keratinocytes and the underlying mesenchyme, is an attractive model system to study organ development and tissue-specific signaling. Although hair follicle development is genetically tractable, fast and reproducible analysis of factors essential for this process remains a challenge. Here we describe a procedure to generate targeted overexpression or shRNA-mediated knockdown of factors using lentivirus in a tissue-specific manner. Using a modified version of a hair regeneration model 5, 6, 11, we can achieve robust gain- or loss-of-function analysis in primary mouse keratinocytes or dermal cells to facilitate study of epithelial-mesenchymal signaling pathways that lead to hair follicle morphogenesis. We describe how to isolate fresh primary mouse keratinocytes and dermal cells, which contain dermal papilla cells and their precursors, deliver lentivirus containing either shRNA or cDNA to one of the cell populations, and combine the cells to generate fully formed hair follicles on the backs of nude mice. This approach allows analysis of tissue-specific factors required to generate hair follicles within three weeks and provides a fast and convenient companion to existing genetic models.

Tissue-specific analysis of a hair follicle regeneration model using lentivirus to mediate gain- or loss-of-function.

Análise Genética rápida de epitelial-mesenquimal sinalização durante a regeneração do cabelo

Hair follicle morphogenesis, a complex process requiring interaction between epithelia-derived keratinocytes and the underlying mesenchyme, is an ...

Analysis of Gene Function and Visualization of Cilia-Generated Fluid Flow in Kupffer's Vesicle

Internal organs such as the heart, brain, and gut develop left-right (LR) asymmetries that are critical for their normal functions1. Motile cilia are involved in establishing LR asymmetry in vertebrate embryos, including mouse, frog, and zebrafish2-6. These 'LR cilia' generate asymmetric fluid flow that is necessary to trigger a conserved asymmetric Nodal (TGF-&beta; superfamily) signaling cascade in the left lateral plate mesoderm, which is thought to provide LR patterning information for developing organs7. Thus, to understand mechanisms underlying LR patterning, it is essential to identify genes that regulate the organization of LR ciliated cells, the motility and length of LR cilia and their ability to generate robust asymmetric flow.
In the zebrafish embryo, LR cilia are located in Kupffer's vesicle (KV)2,4,5. KV is comprised of a single layer of monociliated epithelial cells that enclose a fluid-filled lumen. Fate mapping has shown that KV is derived from a group of ~20-30 cells known as dorsal forerunner cells (DFCs) that migrate at the dorsal blastoderm margin during epiboly stages8,9. During early somite stages, DFCs cluster and differentiate into ciliated epithelial cells to form KV in the tailbud of the embryo10,11. The ability to identify and track DFCs&mdash;in combination with optical transparency and rapid development of the zebrafish embryo&mdash;make zebrafish KV an excellent model system to study LR ciliated cells.
Interestingly, progenitors of the DFC/KV cell lineage retain cytoplasmic bridges between the yolk cell up to 4 hr post-fertilization (hpf), whereas cytoplasmic bridges between the yolk cell and other embryonic cells close after 2 hpf8. Taking advantage of these cytoplasmic bridges, we developed a stage-specific injection strategy to deliver morpholino oligonucleotides (MO) exclusively to DFCs and knockdown the function of a targeted gene in these cells12. This technique creates chimeric embryos in which gene function is knocked down in the DFC/KV lineage developing in the context of a wild-type embryo. To analyze asymmetric fluid flow in KV, we inject fluorescent microbeads into the KV lumen and record bead movement using videomicroscopy2. Fluid flow is easily visualized and can be quantified by tracking bead displacement over time.
Here, using the stage-specific DFC-targeted gene knockdown technique and injection of fluorescent microbeads into KV to visualize flow, we present a protocol that provides an effective approach to characterize the role of a particular gene during KV development and function.

Cilia-generated fluid flow in Kupffer&#x2019;s Vesicle (KV) controls left-right patterning of the zebrafish embryo. Here, we describe a technique to modulate gene function specifically in KV cells. In addition, we show how to deliver fluorescent beads into KV to visualize fluid flow.

Análise da função do gene e Visualização de Cilia-Generated fluxo de fluidos em vesículas de Kupffer

Internal organs such as the  heart, brain, and gut develop left-right (LR) asymmetries that are critical for  their normal functions1. Motile cilia are ...

Prostaglandin Extraction and Analysis in Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans is emerging as a powerful animal model to study the biology of lipids1-9. Prostaglandins are an important class of eicosanoids, which are lipid signals derived from polyunsaturated fatty acids (PUFAs)10-14. These signalling molecules are difficult to study because of their low abundance and reactive nature. The characteristic feature of prostaglandins is a cyclopentane ring structure located within the fatty acid backbone. In mammals, prostaglandins can be formed through cyclooxygenase enzyme-dependent and -independent pathways10,15. C. elegans synthesizes a wide array of prostaglandins independent of cyclooxygenases6,16,17. A large class of F-series prostaglandins has been identified, but the study of eicosanoids is at an early stage with ample room for new discoveries. Here we describe a procedure for extracting and analyzing prostaglandins and other eicosanoids. Charged lipids are extracted from mass worm cultures using a liquid-liquid extraction technique and analyzed by liquid chromatography coupled to electrospray ionization tandem mass spectrometry (LC-ESI-MS/MS). The inclusion of deuterated analogs of prostaglandins, such as PGF2 &alpha;-d4 as an internal standard is recommended for quantitative analysis. Multiple reaction monitoring or MRM can be used to quantify and compare specific prostaglandin types between wild-type and mutant animals. Collision-induced decomposition or MS/MS can be used to obtain information on important structural features. Liquid chromatography mass spectrometry (LC-MS) survey scans of a selected mass range, such as m/z 315-360 can be used to evaluate global changes in prostaglandin levels. We provide examples of all three analyses. These methods will provide researchers with a toolset for discovering novel eicosanoids and delineating their metabolic pathways.

Prostaglandin Extraction and Analysis in Caenorhabditis elegans

In this paper, we describe an optimized procedure for extracting and analyzing prostaglandins and other eicosanoids from C. elegans using LC-MS/MS.

Extração de prostaglandina e Análise em<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Caenorhabditis elegans is emerging as a powerful animal model to study the biology of lipids1-9. Prostaglandins are an important class of eicosanoids, ...

Extraction of Venom and Venom Gland Microdissections from Spiders for Proteomic and Transcriptomic Analyses

Venoms are chemically complex secretions typically comprising numerous proteins and peptides with varied physiological activities. Functional characterization of venom proteins has important biomedical applications, including the identification of drug leads or probes for cellular receptors. Spiders are the most species rich clade of venomous organisms, but the venoms of only a few species are well-understood, in part due to the difficulty associated with collecting minute quantities of venom from small animals. This paper presents a protocol for the collection of venom from spiders using electrical stimulation, demonstrating the procedure on the Western black widow (Latrodectus hesperus). The collected venom is useful for varied downstream analyses including direct protein identification via mass spectrometry, functional assays, and stimulation of venom gene expression for transcriptomic studies. This technique has the advantage over protocols that isolate venom from whole gland homogenates, which do not separate genuine venom components from cellular proteins that are not secreted as part of the venom. Representative results demonstrate the detection of known venom peptides from the collected sample using mass spectrometry. The venom collection procedure is followed by a protocol for dissecting spider venom glands, with results demonstrating that this leads to the characterization of venom-expressed proteins and peptides at the sequence level.

This article provides a protocol for the extraction of venom from spiders using electrical stimulation in order to 1) conduct proteomic characterization, 2) stimulate venom gland gene expression, and 3) perform functional studies of venoms. This is followed by a description of venom gland microdissections for gene expression studies.

Extração de Venom e Venom Gland microdissecações de Aranhas para proteômica e análise do transcriptoma

Venoms are chemically complex secretions typically comprising numerous proteins and peptides with varied physiological activities. Functional ...

A New Technique for Quantitative Analysis of Hair Loss in Mice Using Grayscale Analysis

Alopecia is a common form of hair loss which can occur in many different conditions, including male-pattern hair loss, polycystic ovarian syndrome, and alopecia areata. Alopecia can also occur as a side effect of chemotherapy in cancer patients. In this study, our goal was to develop a consistent and reliable method to quantify hair loss in mice, which will allow investigators to accurately assess and compare new therapeutic approaches for these various forms of alopecia. The method utilizes a standard gel imager to obtain and process images of mice, measuring the light absorption, which occurs in rough proportion to the amount of black (or gray) hair on the mouse. Data that has been quantified in this fashion can then be analyzed using standard statistical techniques (i.e., ANOVA, T-test). This methodology was tested in mouse models of chemotherapy-induced alopecia, alopecia areata and alopecia from waxing. In this report, the detailed protocol is presented for performing these measurements, including validation data from C57BL/6 and C3H/HeJ strains of mice. This new technique offers a number of advantages, including relative simplicity of application, reliance on equipment which is readily available in most research laboratories, and applying an objective, quantitative assessment which is more robust than subjective evaluations. Improvements in quantification of hair growth in mice will improve study of alopecia models and facilitate evaluation of promising new therapies in preclinical studies.

Alopecia is a common form of hair loss which can occur in many different conditions, including as a side-effect of chemotherapy. We have developed a method to quantify hair loss in mice, utilizing a standard gel imager to perform a grayscale analysis, to facilitate study of promising new alopecia therapies.

Uma nova técnica de Análise Quantitativa de perda de cabelo em ratos usando Análise Tons de Cinza

Alopecia is a common form of hair loss which can occur in many different conditions, including male-pattern hair loss, polycystic ovarian syndrome, and ...

Complete Workflow for Analysis of Histone Post-translational Modifications Using Bottom-up Mass Spectrometry: From Histone Extraction to Data Analysis

Nucleosomes are the smallest structural unit of chromatin, composed of 147 base pairs of DNA wrapped around an octamer of histone proteins. Histone function is mediated by extensive post-translational modification by a myriad of nuclear proteins. These modifications are critical for nuclear integrity as they regulate chromatin structure and recruit enzymes involved in gene regulation, DNA repair and chromosome condensation. Even though a large part of the scientific community adopts antibody-based techniques to characterize histone PTM abundance, these approaches are low throughput and biased against hypermodified proteins, as the epitope might be obstructed by nearby modifications. This protocol describes the use of nano liquid chromatography (nLC) and mass spectrometry (MS) for accurate quantification of histone modifications. This method is designed to characterize a large variety of histone PTMs and the relative abundance of several histone variants within single analyses. In this protocol, histones are derivatized with propionic anhydride followed by digestion with trypsin to generate peptides of 5 - 20 aa in length. After digestion, the newly exposed N-termini of the histone peptides are derivatized to improve chromatographic retention during nLC-MS. This method allows for the relative quantification of histone PTMs spanning four orders of magnitude.

This protocol outlines a fully integrated workflow for characterizing histone post-translational modifications using mass spectrometry (MS). The workflow includes histone purification from cell cultures or tissues, histone derivatization and digestion, MS analysis using nano-flow liquid chromatography and instructions for data analysis. The protocol is designed for completion within 2 - 3 days.

Fluxo de trabalho completo para Análise de histona modificações pós-traducionais Usando Bottom-up Espectrometria de Massa: De histona Extração de Análise de Dados

Nucleosomes are the smallest structural unit of chromatin, composed of 147 base pairs of DNA wrapped around an octamer of histone proteins. Histone ...