Os métodos descritos neste protocolo fornecerão uma plataforma valiosa para avaliar a maturação funcional dos ICMs para estudos de reprogramação cardíaca. O fluxo de cálcio é observado exclusivamente em ICMs e fornece uma forma de avaliar a maturação funcional do ICM. Esta cepa de mouse simplifica os procedimentos de avaliação e aumenta a reprodutibilidade dos resultados.
Este protocolo é um novo método para avaliar a maturação funcional dos ICMs no campo de reprogramação cardíaca. Também pode ser aplicado para avaliar a diferenciação de cardiomiócitos e a função cardíaca. Comece por obter de oito a 10 filhotes, filhotes P0 a P2 para isolar 10 milhões de fibroblastos cardíacos neonatais, ou NCFs.
Anestesiar profundamente os filhotes por hipotermia. Observe os corações sob o microscópio de fluorescência para garantir que o coração com o genótipo desejado mostre fluxo de cálcio, indicado por GCaMP3 com os corações batendo. Os outros genótipos não mostrarão fluorescência.
Após o isolamento dos corações, corte-os em quatro pedaços de tal forma que eles estejam vagamente conectados. Lave-os completamente várias vezes no soro fisco tamponado de Dulbecco, ou DPBS, em uma placa de seis centímetros para limitar a poluição das células sanguíneas nas células isoladas. Digerir os corações com oito mililitros de 0,25% de trypsin-EDTA em 37 graus Celsius por 10 minutos.
Descarte o supernatante Trypsin e adicione cinco mililitros de 0,5 miligramas por mililitro quente tipo dois colagemnase na solução de sal balanceada de Hank. Vórtice a mistura completamente e incubada a 37 graus Celsius por cinco minutos. Após a incubação, novamente, vórtice da mistura completamente e deixar o tecido não digerido se acalmar pela gravidade.
Colete o supernatante em um tubo cônico de 15 mililitros com cinco mililitros de meio fibroblasto frio. Diluir as células com meio fibroblasto de tal forma que a densidade de semeadura esteja em torno de duas a 2,5 vezes 10 para as quatro células por centímetro cúbico. Em seguida, semeou as células em pratos ou pratos.
Os fibroblastos anexados devem ter uma forma oval a redonda no segundo dia após a semeadura. No dia zero, semente os NCFs para a densidade de cerca de um a dois vezes 10 para as quatro células por centímetro cúbico em meio fibroblasto. No primeiro dia, substitua o meio de cultura por um vírus contendo meio para cada um dos desejados.
No dia 2, 24 horas após a infecção pelo vírus, substitua o vírus que contém meio por um meio de ICM regular. Avalie o fluxo de íons de cálcio com um microscópio de fluorescência invertida à temperatura ambiente. Observe as células positivas GCaMP3 sob o objetivo 10X, garantindo que ela mostre células espontâneas batendo no canal brightfield.
Corações com o genótipo correto mostraram fluxo de íons de cálcio sincronizado com batida, visualizado como farinha GCaMP3. Enquanto nenhuma fluorescência foi observada em corações de controle. NCFs isolados ligados ao poço dentro de duas horas e mostraram uma forma oval a redonda um dia após a semeadura.
A oscilação da íon cálcio mostrou a variação da fluorescência GCaMP3 entre o máximo e o mínimo e a oscilação de íons de cálcio dessas células mudou periodicamente. Após a introdução do IMAP, o número de clusters de espancamento foi significativamente maior do que no grupo controlado, pois o número de células positivas GCaMP3 com fluxo de íons de cálcio para um campo de alta potência foi aumentado no grupo médio tratado do IMAP. Os NCFs devem ser recém-preparados e saudáveis após o isolamento.
Um procedimento rápido de isolamento cardíaco, corte e tempo adequado de digestão pode ajudar a evitar a redução da viabilidade e condição celular. Este método fornece uma maneira de identificar ICMs amadurecidos funcionais para pesquisadores de reprogramação cardíaca. Com vários métodos de avaliação adicionais, pode-se obter uma compreensão mais concisa sobre ICMs funcionais maturados.
