O Ensaio ACT1-CUP1 pode identificar se uma mutação afeta o splicing de RNA pré-mensageiro e dar uma indicação de qual etapa de splicing é mais afetada. O ensaio ACT1-CUP1 liga a mutação do fator de splicing ao seu impacto no complexo processo de splicing. Ele utiliza a leitura simples do fenótipo de crescimento e tem uma ampla faixa de sensibilidade.
O uso eficiente do tempo é importante ao realizar um ensaio ACT1-CUP1. Comece com um ensaio de cinco a 10 cepas para minimizar as aberrações de crescimento induzidas pelo estresse. Demonstrando o processo estaremos eu e Isabelle Marasigan, pesquisadora de graduação do meu laboratório.
Para começar, adicione 790 miligramas de ágar e uma barra de agitação a cada garrafa. Em um copo grande, prepare o meio de crescimento de gota de leucina para todas as placas de cobre a serem derramadas. Isso inclui 265 miligramas de base de nitrogênio de levedura, 64 miligramas de mistura de gota, menos leucina e 34 mililitros de água deionizada para cada placa a ser derramada.
Mexa para dissolver Em seguida, adicione 34 mililitros da solução de meio de crescimento de gota de leucina a cada frasco de 100 mililitros preparado e cubra com papel alumínio. Em seguida, autoclave para esterilizar e dissolver o ágar, usando o ciclo líquido recomendado para a autoclave. O mais rápido possível após a autoclavagem, adicione quatro mililitros de glicose a 20% a cada frasco.
Em seguida, combine o rótulo do tubo com o rótulo da garrafa para adicionar as diluições de dois mililitros de sulfato de cobre cada uma à garrafa pretendida. Usando uma placa de agitação, misture por aproximadamente 30 segundos e despeje ou pipeta 35 mililitros na placa rotulada, evitando bolhas. Por cepa de levedura, adicione nove mililitros de meio de crescimento de gota de leucina e um mililitro de glicose a 20% a um tubo cônico estéril de 50 mililitros.
Usando uma vara estéril, ou ponta de pipeta, reúna uma pequena amostra de levedura e inocular o meio. Em seguida, agite todas as culturas durante a noite a 180 RPM e 30 graus Celsius. Em seguida, adicione 100 microlitros de cultura a uma cuvete, contendo 900 microlitros de água por cepa.
Posteriormente, medir a densidade óptica com um espectrofotómetro e calcular a diluição necessária para uma densidade óptica de 0,5 num volume final de dois mililitros. Em seguida, dilua cada cepa para a densidade óptica de 0,5 em 10% de glicerol e remeça a densidade óptica para confirmar que a densidade celular está dentro da faixa desejada. Depois de configurar um local de trabalho estéril, acenda um queimador Bunsen.
Para um replicador de 48 pinos, pipete 200 microlitros de cada cepa diluída em um poço separado de uma placa de 96 poços e preencha os espaços vazios na grade de seis por oito com 200 microlitros de 10% de glicerol. Em seguida, mergulhe o replicador em um prato raso de etanol a 95% e chamas para esterilizar. Deixe esfriar por pelo menos dois minutos após a extinção da chama para evitar o choque térmico das células.
Coloque quatro placas perto do queimador e retire as tampas. Mergulhe o replicador na placa de 96 poços e levante-o em um movimento rápido. Em seguida, coloque suavemente sobre o prato e agite levemente para frente e para trás para facilitar uma boa transferência.
Levante em um movimento rápido e coloque exatamente na mesma orientação na placa de 96 poços. Depois que uma placa tiver sido chapeada, mova-se com um movimento suave para o lado, mas ainda dentro do guarda-chuva de esterilização da chama. Deixe as placas secarem completamente antes de colocar as tampas, geralmente de três a cinco minutos.
Em seguida, incube as placas por três dias a 30 graus Celsius. Depois de remover as placas da incubadora, inspecione-as visualmente. O ensaio de crescimento demonstrou que, à medida que a concentração de cobre aumenta, cepas com menor splicing, apresentam menor confluência, até o ponto em que a concentração de cobre se torna letal.
O fundo da levedura inclui um gene ADE2 interrompido, resultando em colônias sendo diferentes tons de vermelho. E as colônias maduras eram de cor vermelha profunda. Durante o revestimento, se o replicador é levantado enquanto se move para a esquerda ou para a direita, trazido em um ângulo, ou se agitado acima da placa, é possível criar colônias que são de forma oval, ou micro colônias de pequenas gotículas de solução celular.
A levedura com o repórter A3c sobreviveu a 0,15 milimolar de cobre, enquanto as células repórteres do tipo selvagem mantiveram a viabilidade até o final da faixa de concentrações de cobre testadas. Os resultados do ensaio mostraram que as diferentes bases na posição 57 do snRNA U6 têm impactos únicos no spliceossomo em combinação com uma mutação 5 prime, ou branch site. Enquanto U57c é uma mutação aditiva, diminuindo a tolerância ao cobre, em combinação com A3c e repórteres G do local de filial.
Em contraste, U57a aumenta a tolerância ao cobre porque promove a progressão para o segundo passo. Depois que a perturbação do splicing é identificada através do ACT1-CUP1, a pesquisa pode passar para métodos mais quantitativos, como a extensão do primer e a identificação de interação molecular interrompida através de EMSAs e sondagem enzimática. ACT1-CUP1 tem sido um ensaio fundamental, construindo nossa compreensão da robustez e seletividade do spliceossomo de levedura.
E continua a expandir nossa compreensão da função spliceossomal.
