O objetivo geral deste experimento é estudar as doenças causadas pela disfunção da barreira epitelial medindo a permeabilidade das células epiteliais intestinais in vitro e in vivo. Este método pode ajudar a responder a perguntas-chave no campo de função da barreira intestinal, como as relacionadas à doença inflamatória intestinal. A principal vantagem dessa técnica é que a permeabilidade das células epiteliais intestinais pode ser avaliada tanto in vitro quanto in vivo.
As implicações dessa técnica se estendem à terapia ou diagnóstico de doenças gastrointestinais, pois a disfunção da barreira epitelial intestinal contribui para essas doenças. Embora este método possa fornecer uma visão da função da barreira intestinal, ele também pode ser aplicado a outros sistemas, como estudos de toxicidade de drogas e integridade de barreiras de outros tipos de células. A demonstração visual deste método é crítica, pois alguns passos são difíceis de aprender.
Uma operação precisa deste método pode agora ser entendida pela descrição textual. Para começar, cresça células Caco-2bbe em um frasco T75 com meio. Alimente os frascos regularmente, dependendo da densidade celular.
Quando as células estiverem 80% confluentes, remova o meio e use 1-2 mililitros de PBS estéril sem cálcio para enxágüe. Adicione 1,5 mililitros de Trypsin-EDTA, e balance suavemente o frasco. Em seguida, coloque-o na incubadora Celsius de 37 graus por 20 minutos, sem balançar.
Enquanto as células estão experimentando, coloque inserções contendo membranas porosas de policarbonato em 24 placas de poço. Em seguida, adicione 1 mililitro de cultura média na câmara basal que é o espaço inferior da membrana. Adicione 5 mililitros de médio ao frasco, e pipete vigorosamente as células contra o interior do frasco de 5 a 10 vezes, para separar a cultura em células individuais soltas, ou duas a três células.
Placa 0,166 mililitros das células na câmara apical que é o espaço superior da membrana. Em seguida, incubar as placas a 37 graus Celsius por até três semanas. Alimente as células três vezes por semana, usando uma bomba de pressão para aspirar cuidadosamente o meio do compartimento basal de cada poço.
Em seguida, gotejar suavemente um mililitro de meio na câmara apical de cada inserção. Para estudos de citocina, um dia antes da resistência elétrica transepitelial ou medidas ter, substitua o meio basal por médio, contendo 10 nanogramas por mililitro de interferon gama. No dia do experimento, substitua o meio por HBSS contendo 2,5 ou 7,5 nanogramas por mililitro de TNF.
Para corrigir o medidor, insira o eletrodo de correção na porta de entrada e escolha o modo Ohm. Em seguida, use uma chave de fenda para ajustar o parafuso de ajuste R até que o medidor exiba uma leitura de 1.000 ohms. Esterilize os eletrodos em 70% de etanol por 15 a 30 minutos e deixe-os secar por 15 segundos.
Em seguida, enxágue os eletrodos em meio de cultura celular experimental. Em seguida, ligue a potência e escolha o modo Ohm. Mantendo os eletrodos verticais, coloque cuidadosamente as longas extremidades das pontes de eletrodos na câmara basal, garantindo que toquem o prato.
Em seguida, coloque as extremidades curtas na câmara apical, garantindo que fiquem abaixo da superfície do meio, mas acima das inserções da cultura tecidual. Meça a resistência da amostra e as pastilhas em branco em 0, 1, 2, 3 e 4 horas após o tratamento da citocina. Então regissão a resistência.
Para obter consistência em diferentes formatos de placa, calcule o produto da resistência e a área de membrana eficaz, como mostrado aqui. Para 24 inserções de poços, a área de membrana eficaz é de 0,33 centímetros quadrados. Para induzir colite, adicione DSS à água autoclavada a uma concentração final de 3,5% de peso por volume.
Em seguida, use a solução DSS para substituir a água potável nas gaiolas de 8 semanas de idade c57 preto seis ratos por um total de sete dias. Dê água potável regular sem DSS para controlar ratos. Após o sétimo dia, troque a água do DSS para água potável regular.
Todos os dias, pese os camundongos e avalie os escores clínicos definidos de acordo com a gravidade da doença por quatro parâmetros: prolapso retal, consistência das fezes, sangramento e atividade. Soma os escores desses parâmetros para um escore clínico final. Para analisar a condição histopatológica dos tecidos de cólon sete dias após o tratamento de DSS, após eutanásia de camundongos de acordo com o protocolo de texto, isolar o cólon e ceco, e medir o comprimento do cólon.
Corte segmentos de 0,5 centímetros do cólon distal e fixe o tecido em um tubo falcão de 15 mililitros contendo 10 mililitros de 10% de formalina durante a noite. Lave os tecidos fixos com etanol e xileno. Em seguida, incorpore os tecidos em parafina e corte seções de seis milímetros para a hematoxilina e a coloração de eosina.
Para medir a permeabilidade da barreira epitelial em camundongos induzidos pelo DSS, sete dias após o início da administração do DSS, acelere os camundongos por três horas. Autoclave uma agulha de gavage para garantir a esterilidade, em seguida, use 150 microliters de 80 mililitros por mililitro quatro kilodalton FITC dextran em água estéril para gavage os ratos, e manter o dextran FITC não utilizado para medir a curva padrão após a coleta de soro. Em seguida, peso os ratos para o cálculo de permeabilidade.
Quatro horas depois, após anestesiar os camundongos por injeção ip, confirme a anestesia adequada pela falta de reflexos e movimento do bigode. Em seguida, coloque os ratos em um bloco de calor por cinco minutos. Usando uma tesoura, corte um pedaço de um centímetro da cauda e colete 100 microliters de sangue da cauda em um tubo de coleta de soro.
Gire o sangue coletado a 10.000 vezes g e temperatura ambiente por dez minutos. Com água, dilui o soro de um a quatro. Em seguida, para fazer uma curva padrão, use água para preparar as diluições do dextran FITC não utilizado.
Adicione 100 microliters por poço do soro e as amostras de curva padrão em 96 placas de poço. Usando um leitor de placas, leia a fluorescência em uma excitação de 485 e uma emissão de 528. Calcule os valores de permeabilidade com base na curva padrão e multiplique por quatro para corrigir a diluição.
Divida a concentração do FITC dextran pelo peso para normalizar os valores. Isso ajuda a normalizar a diferença na entrega do FITC dextran se os ratos estiverem doentes e tiverem perdido peso. As células Caco-2bbe mostradas aqui foram rotuladas com núcleos e manchas de f-actin para mostrar a diferença entre células indiferenciadas e diferenciadas.
Fibras de estresse são claramente vistas em células indiferenciadas. Células diferenciadas têm um volume menor, núcleos maiores e menos fibras de estresse do que células indiferenciadas. A TNF é central para a perda de barreira intestinal através da regulação de junção apertada dependente de MLCK.
Como visto neste número, o TNF diminui significativamente o TER da monocamada Caco-2bbe de forma dependente de dose, sugerindo que o TNF aumenta a permeabilidade epitelial. Em comparação com seu peso corporal inicial, os camundongos tratados com DSS perdem uma quantidade significativa de peso. A gravidade da colite é pontuada por prolapso retal, consistência das fezes, sangramento e atividade.
Seções transversais de tecidos coloniais manchados com hematoxilina e eosina mostram danos mucosas colonicos em camundongos tratados com DSS. Além disso, o comprimento da cripta de cólon, bem como o próprio cólon, é diminuído em camundongos tratados com DSS. Finalmente, há um aumento de aproximadamente duas vezes nos níveis de coloração do FITC dextran em camundongos tratados com DSS, em comparação com ratos de controle.
Ao tentar esse procedimento, é importante lembrar para minimizar erros, padronizando procedimentos operacionais e utilizando métodos estatísticos. Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores do campo da função de barreira intestinal explorar doenças gastrointestinais tanto em organismos modelo quanto em linhas celulares. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como determinar a permeabilidade epitelial intestinal medindo o TER, gavaging FITC dextran, e observando alterações morfológicas e histoquímicas.
