Como este método determina células ligadas a anticorpos de bloqueio PD-1 usando sangue periférico de pacientes, o subconjunto específico responsável por efeitos antitumorais e eventos adversos relacionados à imunidade pode ser identificado. Este método precisa apenas de uma pequena quantidade de amostra de sangue e o processo de análise é bastante simples e rápido. Só precisa de uma máquina de citometria de fluxo.
Para começar, colete amostras de sangue inteiros em tubos de coleta de sangue contendo EDTA. Trate cada tubo de citometria de fluxo de poliestireno de fundo redondo de cinco mililitros com um mililitro de soro bovino fetal de 2% em PBS. Vórtice por 10 segundos.
Em seguida, transfira 20 microliters de amostras de sangue inteiros para os tubos de fundo redondos de cinco mililitros tratados. Adicione 20 microliters de 2% FBS em PBS e 10 microliters de reagente de bloqueio de receptor FC específico humano. Misture bem e incubar por 15 minutos em temperatura ambiente.
Em seguida, adicione 500 microliters de tampão de lise de glóbulos vermelhos. Misture bem e incubar por 10 minutos em temperatura ambiente. Adicione quatro mililitros de 2%FBS em PBS e gire células a 400 vezes g por cinco minutos a quatro graus Celsius.
Remova o supernatante por aspiração. Repita o processo de lavagem e aspiração. Resuspend as células em 100 microliters de 2%FBS em PBS e divida em dois tubos de 50 microliters cada.
Adicione anticorpos marcadores de superfície. Misture bem e incubar por 20 minutos à temperatura ambiente no escuro. Lave as amostras duas vezes em 2% FBS em PBS como anteriormente.
Resuspensar as células em 200 microlitres de 2%FBS em PBS. Insira os tubos no citômetro de fluxo e adquira células seguindo o protocolo recomendado. Registo 10.000 eventos como o portão de linfócitos e os dados de fluxo de exportação como arquivos FCS para análise.
Abra arquivos no software de análise e clique no arquivo de controle isótipo para visualizar as células em uma dispersão para a frente versus plot de dispersão lateral e linfócitos de portão. Selecione células únicas usando FSCH versus FSCW e SSCH versus SSCW e exiba-as em um plot CD3 versus CD8 ou CD3 versus CD4. Gate as células T CD8 e CD4 T-cells, respectivamente.
Selecione as células fechadas e exiba-as em um plot PD-1 versus IgG4 humano. E, em seguida, com base no controle do isótipo, selecione o Q3 para identificar células CD8 e CD4 T ligadas a anticorpos pc8 e CD4. Neste estudo, a estratégia de gating e a análise da citometria de fluxo detectaram anticorpos de bloqueio PD-1 ligados às células T obtidas a partir de uma gota de sangue periférico do paciente.
A trama PD-1 versus IgG4 humana mostra o status de ligação de anticorpos de bloqueio PD-1 em células T. Pontos laranjas e pontos pretos indicam anticorpos anti-IgG4 e manchas de controle de isótipo, respectivamente. Antes da administração do anticorpo de bloqueio PD-1, não havia células T de CD8 ou CD4 t positivas IgG4 ou CD4 e a expressão PD-1 foi confirmada por um anticorpo detectante PD-1.
Após a administração nivolumab ou pembrolizumabe, o IgG4 pode ser detectado em células T por anticorpo anti-IgG4, enquanto o PD-1 detectando anticorpos EH12.1 não reconhece nenhum PD-1 em células T. Os portões vermelho, azul e verde indicam total vinculação, vinculação parcial e perda de ligação, respectivamente. Depois que os pacientes descontinuaram nivolumab e pembrolizumabe, o status de anticorpos de bloqueio PD-1 ligados às células T CD8 diminuiu.
Houve parcial vinculação e, finalmente, perda total de vinculação. Por favor, certifique-se de misturar a amostra de sangue com lise RBC também. Além disso, misturar a lise RBC antes da coloração do marcador de superfície é o passo chave neste método.
Se o pesquisador tiver acesso a uma máquina avançada de citometria de fluxo, as células T ligadas a anticorpos PD-1 podem ser avaliadas com mais e mais marcadores relacionados a essa estratégia podem ser aplicados para traçar fenótipos de células T responsáveis por eventos adversos causados por anticorpos bloqueadores de PD-1. A amostragem de pacientes com eventos adversos desenvolvidos é importante para avaliar a utilidade dessa estratégia.
