Mudanças metabólicas nas células hematopoiéticas e progenitoras permitem que elas transitem de seu estado quiescente para um estado de diferenciação para sustentar demandas de formação sanguínea. A alteração na plasticidade metabólica das células-tronco hematopoiéticas e progenitoras leva a distúrbios hematológicos. Nosso protocolo ajudará a medir a regulação metabólica e a saúde das células-tronco hematopoiéticas e progenitoras durante o desenvolvimento sanguíneo e doenças.
A análise da respiração mitocondrial e da glicolise das células-tronco hematopoiéticas e progenitoras é difícil, pois são frágeis e raras populações. Nosso protocolo otimizado permite o isolamento de uma maior quantidade de células hematopoiéticas de haste e progenitor da medula óssea murina, melhora sua viabilidade durante a incubação, facilita a análise de fluxo extracelular de HSPCs não aderentes e fornece parâmetros de injeção otimizados para a segmentação de fábulas oxidativas, bem como vias glicólticas. Para iniciar este procedimento, encha os poços da placa de utilidade e as câmaras ao redor dos poços com água estéril.
Submergir o cartucho do sensor na placa de utilidade, certificando-se de que os sensores estão completamente cobertos por água. Em seguida, coloque o cartucho submerso na placa de utilidade em uma incubadora não CO2 a 37 graus Celsius para incubar durante a noite. Em um gabinete de biossegurança classe II, adicione 40 microliters de solução 0,1%PLL disponível comercialmente para cada poço da placa de ensaio.
Cubra a placa de ensaio com a tampa fornecida no kit e incubar a placa fechada em temperatura ambiente sob o capô por uma hora. Depois disso, use um aspirador à base de vácuo estéril para remover a solução em excesso e secar a placa sob o capô. Para colher células mononucleadas de medula óssea de murina, adicione cinco mililitros de gradiente de densidade médio a um tubo cônico de 15 mililitros.
Adicione lentamente cinco mililitros da suspensão da célula de medula óssea certificando-se de que as células permaneçam como uma camada acima do meio gradiente de densidade. Centrifugar a 500 vezes g e à temperatura ambiente por 30 minutos certificando-se de que a centrífuga está na menor aceleração possível. Colher a interface média das células mononucleadas em um tubo fresco de 15 mililitros.
Em seguida, lave as células com cinco mililitros de 1X PBS contendo 2% de FBS. Centrifugar a 500 vezes g e a 4 graus Celsius por cinco minutos. Remova o supernascer e resuspenja as células em 300 microliters de 1X PBS contendo 2% de FBS.
Em seguida, alíquota de 10 microliters da suspensão celular para controle não detido ou de cor única em um tubo FACS. Para colher LSK HSPCs de células mononucleadas de medula óssea murina, adicione 15 microliters de coquetel de anticorpos biotina a 300 microliters de células mononucleadas de medula óssea. Para colher LSK HSPCs de células mononucleadas de medula óssea murina, adicione 15 microliters de coquetel de anticorpos biotina a 300 microliters de células mononucleadas de medula óssea.
Coloque os tubos em um balde de gelo posicionado sobre um shaker em uma geladeira para incubar a quatro graus Celsius com agitação por 30 minutos. Em seguida, adicione 10 mililitros de PBS 1X pré-refrigerado contendo 2% de FBS às células. Centrifugar a 500 vezes g e a 4 graus Celsius por cinco minutos.
Descarte o supernascer e resuspenque a pelota celular em 400 microliters de 1X PBS contendo 2% de FBS. Brevemente vórtice das microesferas anti-biotina antes do uso. Adicione 80 microliters das microesferas a cada amostra e misture bem.
Incubar por mais 20 minutos a quatro graus Celsius com agitação. Depois disso, adicione 10 mililitros de PBS pré-refrigerados contendo 2% de FBS às células. Centrifugar o tubo a 500 vezes g e a 4 graus Celsius por cinco minutos.
Descarte o supernatante e resuspenque a pelota celular em um mililitro de PBS contendo 2%FBS. Armazene a suspensão da célula a quatro graus Celsius durante a configuração da unidade de separação magnética. Coloque a coluna em um campo magnético para o separador de células assistidas magnéticas a quatro graus Celsius.
Prepare a coluna para a separação magnética enxaguando-a com três mililitros de 1X PBS contendo 2% de FBS sob fluxo gravitacional a quatro graus Celsius. Adicione a suspensão da célula à coluna pré-úmida a quatro graus Celsius. Deixe que todas as células passem pela coluna a quatro graus Celsius e coletem o efluente em um tubo cônico de 15 mililitros.
Em seguida, lave a coluna com três mililitros de 1X PBS e 2%FBS a quatro graus Celsius. Repita esta lavagem três vezes. Pegue o fluxo e mantenha-o a quatro graus Celsius.
Centrifugar o tubo cônico contendo o fluxo através de 500 vezes g e a quatro graus Celsius por cinco minutos. Descarte o supernascimento e resuspenque as células em 0,5 mililitros de 1X PBS com 2%FBS e transfira a suspensão para um tubo FACS. Em seguida, adicione 24 microliters do coquetel de anticorpos LSK a cada 10 milhões de células.
Cubra o tubo com papel alumínio e incubar no escuro a quatro graus Celsius com agitação por uma hora. Depois disso, adicione três mililitros de 1X PBS com 2% de FBS ao tubo FACS. Centrifugar a 500 vezes g e a 4 graus Celsius por cinco minutos.
Descarte o supernascimento e resuspenque as células rotuladas por anticorpos em um mililitro de 1X PBS contendo 2% de FBS. Pouco antes da triagem, adicione um microliter de um miligrama por iodeto de propídio mililitro à suspensão da célula e use um coador de 40 micrômetros para filtrar o conteúdo do tubo FACS. Primeiro, centrifugar as células LSK coletadas a 500 vezes g e à temperatura ambiente por cinco minutos.
Descarte o supernascer e resuspenque as células em mídia completa para uma concentração final de pelo menos 70.000 células por 40 microliters. Sementes 40 microliters desta suspensão celular nos poços de uma placa pll revestida de oito poços certificando-se de deixar todos os poços de canto vazios. Centrifugar a placa a 450 vezes g e à temperatura ambiente por um minuto.
Use um microscópio invertido para garantir que as células estejam presas à parte inferior dos poços. Depois disso, adicione 135 microliters de mídia completa às células em cada poço, trazendo o volume final de cada poço para 175 microliters. Adicione 175 microliters de mídia completa aos dois cantos da placa como espaços em branco.
Incubar as células em uma incubadora não co2 a 37 graus Celsius por duas horas. Em seguida, configure um programa para que o analisador adicione drogas a cada poço da placa conforme descrito na tabela dois e na tabela três do protocolo de texto. Para o teste de estresse mitocondrial, recupere o cartucho de sensor na placa de utilidade da incubadora de tal forma que cada poço tenha uma concentração final de duas oligomicina micromolar, 1,5 micromolar FCCP e 0,5 micromolar de rotenona e anti-mícina A conforme necessário.
Retire a tampa do cartucho do sensor e coloque-a na bandeja do instrumento. Inicie o processo de calibração que levará 20 minutos. Quando a calibração estiver completa, remova a placa de utilidade e substitua-a pela placa de ensaio contendo as células LSK.
A imprensa continua a iniciar o programa previamente definido. Quando o programa estiver concluído, recupere os dados e analise-os. Neste estudo, uma quantidade máxima de HSPCs murine lsk viável são isoladas e seu metabolismo glicólise e mitocondrial é medido com um analisador de fluxo extracelular.
Embora a análise de fluxo extracelular seja tradicionalmente usada para células aderentes, este método torna os HSPCs LSK aderentes aos poços revestidos de PLL que permitem a medição do fluxo extracelular e, portanto, a saúde metabólica dos HSPCs LSK. A fim de medir a respiração mitocondrial através da taxa de consumo de oxigênio e glicolise através da taxa de acidificação extracelular em condições basais e de estresse, drogas que interferem com a glicolise e respiração mitocondrial são injetadas sequencialmente. Como esperado, o nível basal da taxa de acidificação extracelular é maior para HSPCs LSK cultivados em mídia positiva de glicose e piruvato em comparação com aqueles cultivados em mídia negativa.
A injeção com glicose não alterou a taxa de acidificação extracelular para as células cultivadas na mídia positiva, mas aumentou a glicólise das células em mídia negativa. No entanto, o nível basal dessas células ainda permaneceu menor no grupo positivo. A injeção com oligomicina ativou a glicolise em seu nível máximo no grupo positivo, mas não afetou o grupo negativo.
A injeção com o analógico de glicose em 2-DG devolveu a taxa de acidificação extracelular a níveis não glicolíticos. Para o teste de estresse mitocondrial, a injeção de oligomicina hiperpolarizou a membrana mitocondrial impedindo mais bombeamento de prótons através dos complexos etc e, assim, reduzindo a taxa de respiração mitocondrial. A injeção de FCCP eleva a taxa de consumo de oxigênio ao máximo à medida que as células tentam recuperar o potencial da membrana mitocondrial.
A injeção com dois outros inibidores da cadeia de transporte de elétrons faz com que a respiração mitocondrial pare completamente e, assim, a taxa de consumo de oxigênio reverteu para seu nível mínimo. Evite o uso de tampão de lise celular vermelha para o isolamento da célula mononuclear. Recomendamos a separação de gradiente ficoll para evitar a formação de aglomerados e reduzir a perda de LSK.
Usando nosso método otimizado, podemos medir a respiração mitocondrial e a glicolise de células-tronco e progenitoras raras e frágeis e o estudo de sinais metabólicos regulam hematopoiese normal e maligna.
