Estabelecendo in Situ Circuito Fechado Perfusão de Órgãos Abdominais Inferiores e Membros Traseiros em Camundongos

Este protocolo pode ser usado para responder perguntas sobre o parto de medicamentos e interações imunológicas dentro dos órgãos incluídos em nosso circuito. Essa técnica permite a perfusão de órgãos que não são possíveis de perfusear pelos métodos tradicionais ex-vivo, evitando os principais órgãos de liberação. Antes de começar a cirurgia, coloque um banho de água circulante e todos os componentes cobertos de água, até 37 graus Celsius.

Confirme se a tubulação está limpa e use uma armadilha de bolhas dentro de uma câmara úmida como reservatório perfusado para limitar o volume perfusado. Para realizar o procedimento de cateterismo, confirme a falta de resposta ao reflexo do pedal, em uma lâmpada anestesiada masculina de oito a 10 semanas ver o rato. E coloque o rato na posição supina em uma tábua de isopor, com a cabeça às seis horas.

Imobilize os membros dos animais com fita adesiva e limpe o abdômen com álcool isopropílico. Faça uma incisão em forma de T no abdômen, usando coagulação eletro para parar qualquer sangramento ao redor da borda da incisão. Empurre o estômago, jejunum e cólon para o lado direito do abdômen, para revelar a aorta abdominal, veia cava e artérias e veias ilíacas e ilí lombar comuns.

Sob um microscópio de dissecção, localize e liga as artérias e veias ovarianas e iliolumbares com suturas de seda 4-O. Enrole duas suturas de seda 4-O sob a aorta abdominal e veia cava inferior cerca de um centímetro acima da artéria ilíaca e veia, um milímetro de distância. Em seguida, faça um aceno solto na sutura mais próxima dos vasos ilícitos.

Use um suporte de agulha para alinhar horizontalmente e esticar tanto a veia cava inferior quanto a aorta abdominal. E, mantendo os vasos esticados, use um cateter de 24 bits alado para perfurar a aorta abdominal. Assim que a agulha penetrar cerca de um milímetro no vaso, pressione o botão para retrair o núcleo da agulha, e insira o cateter cerca de cinco milímetros no vaso.

Insira um cateter cinco milímetros na veia cava inferior, da mesma forma. E amarre ambas as suturas ao redor dos vasos cateterizados. Em seguida, aplique cola instantânea para imobilizar os cateteres ao giro eretor a, e substituir os órgãos abdominais.

Para configurar o sistema de perfusão, coloque o rato em uma almofada de silicone na câmara úmida reveste reveste da água e imobilize as asas do cateter para a almofada com agulhas de calibre 19. Encha a entrada do cateter arterial, com tampão de perfusão pré-aquecido. Use fórceps hemostáticos e um conector para fixar a entrada do cateter na tubulação e imobilizar a tubulação de perfusão de entrada com fita adesiva.

Ajuste a vazão peristáltica para 0,6 mililitros por minuto, e mantenha a saída de perfusão aberta por cinco a 10 minutos, para lavar o sangue através do cateter venoso. Alguns coágulos estarão presentes no cateter de saída, expelem os coágulos com tampão perfusado e usarão um parafuso no conector para anexar à extremidade do cateter venoso à tubulação de saída para fechar o circuito. Em seguida, cubra a câmara úmida com uma tampa pré-aquecida por até duas horas de perfusão, verificando periodicamente o nível de perfusato.

Aqui, imagens confocais após a perfusão com solução ringer contendo Hoechst 33342 e DyLight-649 lectina, são mostradas. O músculo, medula óssea, testículos, bexiga, próstata e pele do pé normalmente demonstram uma eficiente coloração nuclear e vascular. A hematoxilina e a coloração de eosina desses tecidos após três horas de perfusão termica normal, revela uma descarga bem sucedida dos órgãos, sem lesão tecidual aparente.

Este modelo pode ser usado para entender caminhos de absorção de drogas, no ambiente fisiológico irrelevante. Por exemplo, para entender o papel dos componentes do soro no acúmulo de drogas. Estamos usando o sistema para entender o mecanismo de acúmulo de liposomos na pele.