Este trabalho foi apoiado pelos Institutos Nacionais de Saúde (R37CA228304 e R01HL146642 a Xi Chen, CA148761 para Jeffrey M. Rosen), Departamento de Defesa dos EUA (W81XWH-19-1-0524 para Xi Chen, W81XWH-19-1-0035 para Xiangdong Lv), American Cancer Society (RSG-18-181-01-TBE para Xi Chen) e Instituto de Prevenção e Pesquisa do Câncer do Texas (RR150009 CPRIT Scholar in Cancer Research Award to Xi Chen), o Núcleo de Modelos Derivados do Paciente e Avançado In Vivo na Baylor College of Medicine (financiamento do RP170691 CPRIT Core Facility Award e NCI-CA125123 P30 Cancer Center Support Grant).

Todos os protocolos de uso de animais foram revisados e aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC). Os fragmentos tumorais, com cerca de1-2 mm de tamanho, são de estoque viávelmente congelado obtido do Xenoenxerto Derivado do Paciente e núcleo avançado de modelos In Vivo na Baylor College of Medicine.
1. Preparação de fragmentos de tumor mamário criopreservados para transplante
<ol><li>Transfira o criovial com fragmentos tumorais de nitrogênio líquido para um banho de água de 37 °C.</li>
	<li>Agitar o criovial com um movimento ocasionalmente suave durante o descongelamento.</li>
	<li>Depois que o tecido for descongelado, tire o criovial do banho de água e misture por inversão suave.</li>
	<li>Seque do lado de fora do criovial e pulverize com 70% de etanol. Transfira para um capuz de biossegurança.</li>
	<li>Transfira os tecidos tumorais descongelados em um tubo cônico de 15 mL preenchido com 10 mL de meio águia modificada de Dulbecco (DMEM). Misture bem invertendo o tubo. Deixe que os fragmentos de tecido se acomodem na parte inferior do tubo.</li>
	<li>Aspire o supernatante e resuspend em 10 mL de DMEM frio. Misture bem invertendo o tubo. Deixe que os fragmentos de tecido se acomodem na parte inferior do tubo.</li>
	<li>Aspire o supernatante e resuspend em 10 mL de DMEM frio. Coloque o tubo no gelo. NOTA: O tecido está pronto para transplante.</li>
</ol>2. Coleta e preparação de tumor mamário fresco para transplante
<ol><li>Eutanize o rato portador de tumor de mama. NOTA: O hospedeiro PDX pode ser camundongos fêmeas SCID/Bege, NSG ou NRG enquanto no estudo atual são utilizados camundongos balb/c fêmeas com idade entre 3 e 5 semanas.</li>
	<li>Pulverizar a região tumoral do rato eutanizado com 70% de etanol. NOTA: Tente evitar o cabelo com a amostra de tumor que possa causar contaminação de fragmentos tumorais para criostoragem ou transplante.</li>
	<li>Com fórceps serrilhados para beliscar e levantar a pele ao redor do tumor, use uma tesoura para fazer uma incisão curta.</li>
	<li>Separe o tumor da pele com a tesoura para dissecar todo o tumor do rato hospedeiro. Corte qualquer tecido restante da almofada de gordura do rato da superfície externa do tumor. Coloque o tumor em um tubo cônico de 15 mL preenchido com 5 mL de DMEM frio. NOTA: Use tumores com um tamanho máximo de 1 cm de diâmetro, uma vez que tumores maiores provavelmente contêm núcleos necroses.</li>
	<li>Em uma capa de biossegurança, transfira o tumor dissecado para uma placa de Petri estéril de 10 cm contendo DMEM suficiente para evitar a secagem.</li>
	<li>Corte o tumor em fragmentos de 1 mm3 com bisturi ou lâmina sob condições assépticas. NOTA: O bisturi ou a lâmina devem ser expostos sob UV na capa de biossegurança por pelo menos 20 minutos antes do uso.</li>
	<li>Transfira os fragmentos tumorais para um tubo cônico de 15 mL cheio de DMEM frio. Coloque o tubo no gelo. NOTA: O tecido está pronto para transplante. Os fragmentos tumorais dissecados da etapa 2.4 podem ser, 1) snap congelados em nitrogênio líquido para extração de proteína e RNA/DNA, 2) fixada com 4% de paraformaldeído (PFA) ou 10% de formalina tamponada neutra (NBF) para hematoxilina e eosina (H&E) e análise imunohistoquímica (IHC), ou 3) criopreservada em meio de congelamento de 1,25 mL (10% de sulfoxida de dimetil [DMSO], 40% DMEM e 50% soro bovino fetal [FBS], congelando lentamente em um congelador de -80 °C durante a noite e depois transferindo para nitrogênio líquido para armazenamento a longo prazo.</li>
</ol>3. Prepare o animal para a cirurgia
<ol><li>Para o manejo da dor animal, injete subcutâneamente a liberação sustentada da buprenorfina 60 min antes da cirurgia em uma dose de 1 mg/kg ou siga o guia da instituição para 72h de cobertura analgésica.</li>
	<li>Montar o conjunto cirúrgico de acordo com as diretrizes institucionais para cirurgias assépticas.</li>
	<li>Anestesia uma fêmea de 4 semanas em uma câmara de indução da máquina de anestesia isoflurane à taxa de ~11,25 mL/h. Transfira o rato para a área de procedimento, para a placa de cirurgia estéril (borracha de silicone), onde receberá anestesia através de uma pequena máscara facial. Coloque o rato de costas e grave as pernas em suas posições naturais. NOTA: SCID/Bege, NSG ou NRG são usados para PDX e Balb/c é usado para modelos de transplante GEMM.</li>
	<li>Aplique pomada oftálmica nos olhos para evitar o ressecamento.</li>
	<li>Confirme o nível apropriado de sedação por aperto de dedo do dedo. NOTA: Nenhuma resposta/movimento do animal indica que o animal está suficientemente anestesiado e pronto para cirurgia.</li>
	<li>Raspe o rato no abdômen inferior, especialmente na região em torno do quarto mamilo onde a cirurgia ocorrerá.</li>
	<li>Utilizando um movimento circular e começando no centro do local da cirurgia, trabalhe em direção às bordas externas com esfoliação cirúrgica povidone-iodo, seguido pela remoção de povidone-iodo com uma almofada de etanol isopropílico de 70%. Repita duas vezes adicionais.</li>
</ol>4. Transplante de fragmentos tumorais na quarta almofada de gordura mamária (inguinal)
<ol><li>Use uma cortina cirúrgica estéril para cobrir o corpo do animal, exceto o local da incisão. NOTA: Confirme o nível adequado de sedação por aperto de dedo do dedo antes de fazer a incisão.</li>
	<li>Usando fórceps serrilhados beliscam e levantam a pele no mamilo #4.</li>
	<li>Com o lado contundente para baixo, use a tesoura para fazer uma incisão de parasagittal curta, do mamilo #4 em direção à cabeça.</li>
	<li>Utilizando um aplicador de ponta de algodão, separe a pele do peritônio no lado medial da incisão.</li>
	<li>Enquanto segura o lado lateral da incisão, retire delicadamente a almofada de gordura mamária #4 da pele usando o mesmo cotonete.</li>
	<li>Uma vez que a almofada de gordura é separada, fixe a pele com uma agulha de 27 G perto do corpo do animal.</li>
	<li>Se for experimentalmente necessário limpar a almofada de gordura do epitélio mamário do rato endógeno, execute as seguintes etapas.<ol>
<li>Usando as fórceps serrilhadas, estenda suavemente a almofada de gordura para longe do corpo e localize o linfonodo inguinal, que fica abaixo dos pontos de intersecção dos principais vasos da glândula (perto de onde os fórceps estarão segurando a glândula).</li>
		<li>Cauterize cuidadosamente os vasos medial para o linfonodo e a gordura juntando-se ao quarto e quinto blocos de gordura que formam uma área triangular. NOTA: Desligue temporariamente a fonte de oxigênio para esta etapa.</li>
		<li>Usando uma tesoura de micro dissecação, corte cada vaso cauterizado um de cada vez (para garantir que não haja sangramento após cada corte) até que a seção da almofada de gordura que contém o linfonodo seja removida.</li>
		<li>Descarte o tecido "limpo" da almofada de gordura.</li>
	</ol></li>
	<li>Segure a quarta almofada de gordura mamária usando fórceps de separação sem cortes. Por outro lado, insira a ponta fechada dos fórceps finos angulares no meio da almofada de gordura acima do vaso restante e perto da parede do peritônio. Abra lentamente as fórceps para fazer um pequeno bolso. Remova os fórceps finos angulares da almofada de gordura.</li>
	<li>Usando as fórceps finas angulares, pegue um pedaço de fragmento do tumor e insira-o no bolso.</li>
	<li>Abra lentamente as pontas dos fórceps para liberar o fragmento do tumor no bolso da almofada de gordura.</li>
	<li>Retire cuidadosamente os fórceps finos angulares. NOTA: Olhe para o bolso para confirmar que o fragmento do tumor permanece no bolso da almofada de gordura mamária ao retirar os fórceps. Tumores podem ser implantados em ambas as almofadas de gordura contralateral quando o excesso de tecido tumoral é necessário para experimentos ou bancos. Animais com transplantes de dupla mão não são recomendados para estudos de tratamento devido a interações conhecidas entre tumores contralaterais. Alternativamente, um dispositivo trocarte pode ser usado para o processo de implantação.</li>
	<li>A partir da base da incisão, colete a pele de cada lado usando a garra e fórceps serrilhados. Recomponha os dois lados e levante ligeiramente para preparar a pele para a aplicação do clipe da ferida. Uncurl as bordas da incisão com as garras fórceps e aperte as bordas juntas para formar uma superfície contínua no topo.</li>
	<li>Segurando os dois lados junto com fórceps serrilhados, use o aplicador do clipe da ferida para colocar um clipe de ferida no centro da incisão. Se necessário, aplique o adesivo de tecido nas extremidades da incisão, a fim de mantê-los fechados e protegidos.</li>
	<li>Coloque o animal em uma gaiola limpa que está em uma superfície de aquecimento. Monitor para sangramento, sinais de deshiscência e dor durante o período pós-cirúrgico. O animal deve estar se movendo em minutos após a cirurgia.</li>
	<li>Preste muita atenção ao local da incisão e à saúde geral dos animais por pelo menos 3 dias após a cirurgia. Siga as diretrizes institucionais para o tratamento da dor.</li>
	<li>Limpe as ferramentas cirúrgicas por 10 s em um esterilizador de contas de vidro antes de continuar com o próximo transplante. Aguarde que as ferramentas esfriem antes de usar.</li>
	<li>Repita os passos 4.1-4.15 até que todos os camundongos sejam transplantados. NOTA: A suplementação de estrogênio é necessária para tumores ER+, que podem ser fornecidos através de água ou pelotas de liberação lenta59.</li>
</ol>5. Monitorando o crescimento do tumor em resposta ao tratamento medicamentoso
NOTA: Tumores palpáveis de PDXs transplantáveis estabelecidos e tumores p53-nulos levam entre 2 semanas e 8 semanas para se desenvolver após a cirurgia, dependendo das taxas intrínsecas de crescimento do tumor.
<ol><li>Meça tumores em duas dimensões usando pinças duas vezes por semana. Calcule o volume usando a fórmula: Volume do tumor (mm3) = W2 x L/2 onde W é largura e L é o comprimento do tumor.</li>
	<li>Inicie o tratamento medicamentoso quando o volume do tumor atingir 150-300 mm3. NOTA: Dependendo da propriedade dos medicamentos, pode-se usar gavage oral ou injeção intraperitoneal para o parto dos medicamentos.</li>
	<li>Coletar amostras de tumores e realizar a coloração de IHC60,isolamento de proteína e RNA/DNA e fenotipagem imunológica61 para vários propósitos. Coletar sangue e realizar fenotipagem imunológica ou usá-lo para estudos farmacocinéticos/farmacodinâmicos.</li>
</ol>

A MTL é fundadora de um parceiro limitado na StemMed, Ltd. e fundadora e gerente da StemMed Holdings, sua sócia geral. A MTL é fundadora e detentora de ações na Tvardi Therapeutics, Inc. LED é uma funcionária compensada da StemMed, Ltd.

Para reduzir as variações no crescimento do tumor entre os animais, é fundamental cortar o tecido tumoral em fragmentos de 1 mm3 para transplante. Modelos que crescem tecido mole são mais difíceis de trabalhar e os fragmentos tumorais precisam ser cortados ligeiramente maiores (1−2 mm3). Ao colocar o tecido no bolso da almofada de gordura mamária tome cuidado para não dividir o tecido em vários pedaços, pois isso resultará em múltiplos tumores pequenos ou tumores de forma estranha.
...

A maioria das mortes por câncer de mama pode ser atribuída a doenças recorrentes resistentes às terapias convencionais1,2. A heterogeneidade inter e intra-tumora dos cânceres de mama contribuem para a resistência terapêutica. Além disso, a heterogeneidade tumoral pode afetar o prognóstico preciso e desafiar o manejo da doença3,4. A identificação de biomarcadores preditivos de resposta melhorará significativamente os resultados clínicos de pacientes com câncer de mama. Embora a maioria dos tipos de câncer de mama sejam tumores imunologicamente 'frios' que provavelmente não são responder à imunoterapia, os inibidores de checkpoint imunológicos têm mostrado promessa nos ensaios clínicos2,5. Por exemplo, um estudo de fase III mostrou melhor sobrevida livre de doenças (DFS) e evidências preliminares de que o atezolizumabe (anticorpo monoclonal contra PD-L1) combinado com nab-paclitaxel pode fornecer um benefício global de sobrevivência em comparação com nab-paclitaxel sozinho em tumores com ≥1% de mancha PD-L16. O desenvolvimento de terapias que sensibilizem tumores mamários para a imunoterapia revolucionará os regimes de tratamento.
Modelos pré-clínicos que recapitulam fielmente a heterogeneidade do câncer de mama humano e a resposta a medicamentos são fundamentais para estudar a biologia tumoral e identificar potenciais biomarcadores para terapia direcionada. As linhas celulares imortalizadas são amplamente utilizadas para pesquisas sobre câncer de mama, uma vez que essas linhas celulares são fáceis de crescer e geneticamente modificadas para estudar mecanismos moleculares. No entanto, devido à pressão seletiva da cultura celular de longo prazo in vitro, a deriva genética pode ocorrer ao longo do tempo e as linhas de células cancerígenas de mama podem levar a alterações genômicas específicas da linha celular que são distintas das aberrações em tumores primários de mama7,8,9.
Os pedaços tumorais de xenoenxerto derivados do paciente (PDX) são capazes de recapitular a heterogeneidade da doença humana, e são histologicamente e imunohistoquesticamente semelhantes ao tumor de origem10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22 ,23,24,25,26,27,28,29. É importante ressaltar que os modelos PDX são fenotipicamente estáveis em múltiplos transplantes, evidenciados pela histologia, transcriptome, proteome e análise genômica10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22 ,23,24,25,26,27,28,29. Os modelos PDX mostram respostas de tratamento comparáveis às observadas clinicamente10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24, 25,26,27,28,29. Foram estabelecidos modelos PDX para os modelos PDX positivos para receptor de estrogênio (ER+),receptor de progesterona positivo (PR+),fator de crescimento epidérmico 2 positivo (ERBB2+, HER2+) e câncer de mama triplo negativo (TNBC) modelos PDX e fornecem uma excelente plataforma para testar terapias endócrinas, quimio e direcionadas. No entanto, uma das principais ressalvas dos modelos PDX no momento é a falta de um sistema imunológico funcional no mouse.
Os modelos de rato geneticamente modificados (GEMM), como trp53 homozigos nulos, cMyc, Wnt1, PyMT, ou modelos de superexpressão Her2, permitem o estudo da iniciação espontânea do tumor, progressão e metástase no contexto de um sistema imunológico intacto. No entanto, a latência tumoral é longa, o que dificulta a realização de ensaios pré-clínicos com múltiplos braços30,31. No entanto, o GEMM pode ser transplantado para hospedeiros síngênicos para gerar número suficiente de tumores que recapitulem de perto tumores humanos32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42,43,44,45, 46,47,48,49,50,51,52,53,54,55. Por exemplo, o epitélio mamário de um rato BALB/c p53-nulo foi transplantado nas almofadas de gordura limpas de camundongos receptores do tipo selvagem síndico para formar tumores primários, que podem ser transplantados ainda mais em hospedeiros síngênicos56,57. Os tumores p53-nulos recapitularam diferentes subtipos de tumores humanos.
A combinação de modelos PDX e GEMM transplantável fornece ferramentas pré-clínicos valiosas para investigar a biologia do tumor de mama, a resposta a medicamentos e a imunidade anti-tumor. No protocolo atual, é descrito um método de transplante ortotópico de fragmentos de tumor PDX e GEMM na almofada de gordura mamária do rato. Estes modelos são passíveis de passagens seriais e geralmente mantêm um fenótipo estável. Para mitigar o risco de deriva genética ou perda de heterogeneidade através de passagens ao longo do tempo, múltiplos fragmentos de tecido são criopreservados a cada passagem para transplante subsequente no caso de alterações biológicas ou morfológicas serem observadas ao longo do tempo29,58.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 mg/mL Buprenorphine-SR</td>
			<td>ZooPharm (via BCM veterinarians)</td>
			<td></td>
			<td>Sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>26G syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>148232E</td>
			<td>Sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Betadine Scrub</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>19-027132</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton Swabs</td>
			<td>VWR International Laboratory</td>
			<td>89031-272</td>
			<td>Sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>MT 10-013-CM</td>
			<td>Sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electric shaver</td>
			<td>Oster</td>
			<td>78005-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass beads sterilizer (Germinator)</td>
			<td>Roboz Surgical Store</td>
			<td>DS-401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lubricant ophthalmic ointment</td>
			<td>Akorn Animal Health</td>
			<td>17478-062-35</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Dissecting Forceps; Serrated, Angular (regular forceps)</td>
			<td>Roboz Surgical Store</td>
			<td>RS-5139</td>
			<td>Sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Dissecting Spring Scissors (fat pad cutter)</td>
			<td>Roboz Surgical Store</td>
			<td>RS-5658BT</td>
			<td>Sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Forceps (tissue placing forceps)</td>
			<td>Roboz Surgical Store</td>
			<td>RS-5069</td>
			<td>Sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri Dish</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>08-757- 100D</td>
			<td>Sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile drape</td>
			<td>Sai Infusion Technology</td>
			<td>PSS-SD1</td>
			<td>Sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgery scissors</td>
			<td>Roboz Surgical Store</td>
			<td>RS-5960</td>
			<td>Sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Forceps (claw forceps)</td>
			<td>Roboz Surgical Store</td>
			<td>RS-5158</td>
			<td>Sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wound clip applier</td>
			<td>BD Autoclip Wound System</td>
			<td>01-804</td>
			<td>Sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wound clip remover</td>
			<td>BD Autoclip Wound System</td>
			<td>01-804-15</td>
			<td>Sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wound clips</td>
			<td>BD Autoclip Wound System</td>
			<td>01-804-5</td>
			<td>Sterile</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

orthotopic transplantation of breast tumors as preclinical models for breast cancer

Modelos pré-clínicos que recapitulam fielmente a heterogeneidade tumoral e a resposta terapêutica são fundamentais para a pesquisa translacional do câncer de mama. Linhas celulares imortalizadas são fáceis de cultivar e geneticamente modificadas para estudar mecanismos moleculares, mas a pressão seletiva da cultura celular muitas vezes leva a alterações genéticas e epigenéticas ao longo do tempo. Modelos de xenoenxerto derivados da paciente (PDX) recapitulam fielmente a heterogeneidade e a resposta medicamentosa de tumores mamários humanos. Os modelos PDX exibem uma latência relativamente curta após o transplante ortotópico que facilita a investigação da biologia do tumor de mama e da resposta a medicamentos. Os modelos transplantáveis de camundongos geneticamente modificados permitem o estudo da imunidade do tumor de mama. O protocolo atual descreve o método para transplantar ortotopicamente fragmentos de tumor de mama na almofada de gordura mamária seguido de tratamentos medicamentosos. Esses modelos pré-clínicos fornecem abordagens valiosas para investigar a biologia do tumor de mama, a resposta a medicamentos, a descoberta de biomarcadores e os mecanismos de resistência a medicamentos.

A Figura 1 mostra os equipamentos (Figura 1A) e procedimentos-chave(Figura 1B) de transplante ortotópico. A Figura 2 mostra a caracterização de um tumor PDX transplantado (MC1). Fragmentos tumorais (1 mm3) do modelo MC1 foram transplantados na almofada de gordura #4 de camundongos SCID/Bege. Um mês depois, o tamanho médio...

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Orthotopic Transplantation of Breast Tumors as Preclinical Models for Breast Cancer

Modelos de xenoenxerto derivados da paciente (PDX) e modelos transplantáveis de camundongos geneticamente modificados recapitulam fielmente a doença humana e são modelos preferidos para pesquisas básicas e translacionais sobre câncer de mama. Aqui, um método é descrito para transplantar ortotopicamente fragmentos de tumor de mama na almofada de gordura mamária para estudar biologia tumoral e avaliar a resposta medicamentosa.

Transplante Ortotópico de Tumores mamários como Modelos Pré-Clínicos para o Câncer de Mama

Preclinical models that faithfully recapitulate tumor heterogeneity and therapeutic response are critical for translational breast cancer research. ...

orthotopic-transplantation-breast-tumors-as-preclinical-models-for

Research

JoVE Journal

Cancer Research

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Utilizing Functional Genomics Screening to Identify Potentially Novel Drug Targets in Cancer Cell Spheroid Cultures

The identification of functional driver events in cancer is central to furthering our understanding of cancer biology and indispensable for the discovery of the next generation of novel drug targets. It is becoming apparent that more complex models of cancer are required to fully appreciate the contributing factors that drive tumorigenesis in vivo and increase the efficacy of novel therapies that make the transition from pre-clinical models to clinical trials.
Here we present a methodology for generating uniform and reproducible tumor spheroids that can be subjected to siRNA functional screening. These spheroids display many characteristics that are found in solid tumors that are not present in traditional two-dimension culture. We show that several commonly used breast cancer cell lines are amenable to this protocol. Furthermore, we provide proof-of-principle data utilizing the breast cancer cell line BT474, confirming their dependency on amplification of the epidermal growth factor receptor HER2 and mutation of phosphatidylinositol-4,5-biphosphate 3-kinase (PIK3CA) when grown as tumor spheroids. Finally, we are able to further investigate and confirm the spatial impact of these dependencies using immunohistochemistry.

Identifying novel drug targets that transition from pre-clinical testing to human trials is a scientific priority. To that end, here we describe a functional genomics approach for examining the impact of gene depletion on cancer cell line spheroids, which more appropriately model human cancers in vivo.

Utilizando Genómica Funcional de triagem para identificar alvos de drogas potencialmente romance em Spheroid culturas de células de câncer

The identification of functional driver events in cancer is central to furthering our understanding of cancer biology and indispensable for the discovery ...

Pesquisa do câncer

Ultrasonographic Evaluation of Breast Cancer-related Lymphedema

Lymphedema is one of the most common complications after breast cancer surgery. There are many diagnostic tools for lymphedema, but no standard method yet exists. Progressive Resistance Exercise (PRE) is expected to improve lymphedema without additional swelling. This study showed the therapeutic effects of PRE on lymphedema by using ultrasonography to measure the change in thickness of the muscle and subcutaneous tissue. The thickness of subcutaneous tissue decreased more in the PRE group than in the non-PRE group. Ultrasonography is widely used in many clinics because of its easy accessibility, safety, and inexpensiveness. Ultrasound is one of the best tools for diagnosing and determining treatment efficacy on breast cancer-related lymphedema (BCRL).

This study utilized ultrasonography for diagnosis and follow-up tests to confirm treatment efficacy of Progressive Resistance Exercise (PRE) in breast cancer-related lymphedema (BCRL). Ultrasonography can be applied effectively to ensure diagnosis and treatment of lymphedema.

Ultrassonográfico Avaliação do linfedema relacionados com o cancro da mama

Lymphedema is one of the most common complications after breast cancer surgery. There are many diagnostic tools for lymphedema, but no standard method yet ...

Development of a Human Preclinical Model of Osteoclastogenesis from Peripheral Blood Monocytes Co-cultured with Breast Cancer Cell Lines

The crosstalk between tumor cells and bone cells in the bone microenvironment is crucial to understanding the mechanism of bone metastasis formation. We developed an in vitro fully human preclinical model of a co-culture of breast cancer cells and monocytes undergoing differentiation towards osteoclasts. We optimized a model of osteoclastogenesis starting from a sample of peripheral blood collected from healthy donors. Peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) were first separated by density gradient centrifugation, seeded at a high density and induced to differentiate by adding two growth factors (GFs): receptor activator of nuclear factor-&#954;B ligand (RANKL) and macrophage colony-stimulating factor (MCSF). The cells were left in culture for 14 days and then fixed and analyzed by downstream analysis. In osteolytic bone metastases, one of the effects of cancer cell arrival in bone is the induction of osteoclastogenesis. We thus challenged our model with co-cultures of breast cancer cells to study the differentiation power of cancer cells with respect to GFs. A straightforward way of studying cancer cell-osteoclast interaction is to perform indirect co-cultures based on the use of conditioned medium collected from breast cancer cell cultures and mixed with fresh medium. This mixture is then used to induce osteoclast differentiation. We also optimized a method of direct co-culture in which cancer cells and monocytes undergoing differentiation share the medium and exchange secreted factors. This is a significant improvement over the original indirect co-culture method as researchers can observe the reciprocal interactions of the two cell types and perform downstream analyses for both cancer cells and osteoclasts. This method enables us to study the effect of drugs on the metastatic bone microenvironment and to seed cell lines other than those derived from breast cancer. The model can also be used to study other diseases such as osteoporosis or other bone conditions.

This protocol describes development of an in vitro human preclinical model of osteoclastogenesis from peripheral blood monocytes cultured with breast cancer cell lines to mimic the cancer cell-osteoclast interaction. The model could be used to further our understanding of bone metastasis formation and improve therapeutic options.

Desenvolvimento de um modelo humano pré-clínicos de Osteoclastogenesis de monócitos do sangue periférico co cultivados com linhas de células de câncer de mama

The crosstalk between tumor cells and bone cells in the bone microenvironment is crucial to understanding the mechanism of bone metastasis formation. We ...

The Application of 1% Methylene Blue Dye As a Single Technique in Breast Cancer Sentinel Node Biopsy

In this study, we injected 1% methylene blue dye (MBD) into the subareolar or peritumoral space of the breast. In the case of breast conserving surgery (BCS), a separate incision in the lower axilla hairline was made to find the sentinel nodes (SNs). In mastectomy, the SNs were identified through the same mastectomy incision. The SNs were described as blue nodes or nodes with lymphatic blue channels. An anatomical landmark in the axilla was used to facilitate SNs identification. The SNs metastases were evaluated by intraoperative frozen section analysis and histopathology examination as it is a gold standard. Here, we described the MBD as the lone technique in breast cancer sentinel node biopsy (SNB) which could be useful when radioisotope tracer or patent or isosulfan blue dye (PBD) cannot be provided.

In Indonesia, sentinel node biopsy (SNB) is not routinely performed for breast cancer surgery because of the limitation to provide radioisotope tracer and isosulfan or patent blue dye (PBD). To overcome this obstacle, we applied 1% methylene blue dye (MBD) as a single agent to map the sentinel nodes (SNs).

A aplicação de 1% de corante azul de metileno como uma única técnica na biópsia do nó Sentinela do cancro da mama

In this study, we injected 1% methylene blue dye (MBD) into the subareolar or peritumoral space of the breast. In the case of breast conserving surgery ...

Orthotopic Injection of Breast Cancer Cells into the Mice Mammary Fat Pad

A proper animal model is crucial for a better understanding of diseases. Animal models established by different methods (subcutaneous injections, xenografts, genetic manipulation, chemical reagents induction, etc.) have various pathological characters and play important roles in investigating certain aspects of diseases. Although no single model can totally mimic the whole human disease progression, orthotopic organs disease models with a proper stromal environment play an irreplaceable role in understanding diseases and screening for potential drugs. In this article, we describe how to implant breast cancer cells into the mammary fat pad in a simple, less invasive, and easy-to-handle way, and follow the metastasis to distant organs. With the proper features of primary tumor growth, breast and nipple pathological changes, and a high occurrence of other organs&#39; metastasis, this model maximumly mimics human breast cancer progression. Primary tumor growth in situ, long-distant metastasis, and the tumor microenvironment of breast cancer can be investigated by using this model.

Here, we present a protocol to implant breast cancer cells into the mammary fat pad in a simple, less invasive, and easy-to-handle way, and this mouse orthotopic breast cancer model with a proper mammary fat pad environment can be used to investigate various aspects of cancer.

Ortotópico injeção de células de câncer de mama para a almofada de gordura mamária de ratos

A proper animal model is crucial for a better understanding of diseases. Animal models established by different methods (subcutaneous injections, ...

Obtaining Cancer Stem Cell Spheres from Gynecological and Breast Cancer Tumors

Cancer stem cells (CSC) are a small population with self-renewal and plasticity which are responsible for tumorigenesis, resistance to treatment and recurrent disease. This population can be identified by surface markers, enzymatic activity and a functional profile. These approaches per se are limited, due to phenotypic heterogeneity and CSC plasticity. Here, we update the sphere-forming protocol to obtain CSC spheres from breast and gynecological cancers, assessing functional properties, CSC markers and protein expression. The spheres are obtained with single-cell seeding at low density in suspension culture, using a semi-solid methylcellulose medium to avoid migration and aggregates. This profitable protocol can be used in cancer cell lines but also in primary tumors. The tridimensional non-adherent suspension culture thought to mimic the tumor microenvironment, particularly the CSC-niche, is supplemented with epidermal growth factor and basic fibroblast growth factor to ensure CSC signaling. Aiming for robust identification of CSC, we propose a complementary approach, combining functional and phenotypic evaluation. Sphere-forming capacity, self-renewal and sphere projection area establish CSC functional properties. Additionally, characterization comprises flow cytometry evaluation of the markers, represented by CD44+/CD24- and CD133, and Western blot, considering ALDH. The presented protocol was also optimized for primary tumor samples, following a sample digestion procedure, useful for translational research.

The aim of this methodology is to identify cancer stem cells (CSC) in cancer cell lines and primary human tumor samples with the sphere-forming protocol, in a robust manner, using functional assays and phenotypic characterization with flow cytometry and Western blot.

Obtenção de esferas de células-tronco cancerígenas de tumores ginecológicos e de câncer de mama

Cancer stem cells (CSC) are a small population with self-renewal and plasticity which are responsible for tumorigenesis, resistance to treatment and ...

Studying Triple Negative Breast Cancer Using Orthotopic Breast Cancer Model

Triple-negative breast cancer (TNBC) is an aggressive breast cancer subtype with limited therapeutic options. When compared to patients with less aggressive breast tumors, the 5-year survival rate of TNBC patients is 77% due to their characteristic drug-resistant phenotype and metastatic burden. Toward this end, murine models have been established aimed at identifying novel therapeutic strategies limiting TNBC tumor growth and metastatic spread. This work describes a practical guide for the TNBC orthotopic model where MDA-MB-231 breast cancer cells suspended in a basement membrane matrix are implanted in the fourth mammary fat pad, which closely mimics the cancer cell behavior in humans. Measurement of tumors by caliper, lung metastasis assessment via in vivo and ex vivo imaging, and molecular detection are discussed. This model provides an excellent platform to study therapeutic efficacy and is especially suitable for the study of the interaction between the primary tumor and distal metastatic sites.

This work presets an advanced protocol to accurately assess tumor loading by detection of green fluorescent protein and bioluminescence signals as well as the integration of quantitative molecular detection technique.

Estudando o câncer de mama triplo negativo usando modelo de câncer de mama ortotópico

Triple-negative breast cancer (TNBC) is an aggressive breast cancer subtype with limited therapeutic options. When compared to patients with less ...

Generation of Orthotopic Pancreatic Tumors and Ex vivo Characterization of Tumor-Infiltrating T Cell Cytotoxicity

In vivo models of pancreatic cancer provide invaluable tools for studying disease dynamics, immune infiltration and new therapeutic strategies. The orthotopic murine model can be performed on large cohorts of immunocompetent mice simultaneously, is relatively inexpensive and preserves the cognate tissue microenvironment. The quantification of T cell infiltration and cytotoxic activity within orthotopic tumors provides a useful indicator of an antitumoral response.
This protocol describes the methodology for surgical generation of orthotopic pancreatic tumors by injection of a low number of syngeneic tumor cells resuspended in 5 &#181;L basement membrane directly into the pancreas. Mice bearing orthotopic tumors take approximately 30 days to reach endpoint, at which point tumors can be harvested and processed for characterization of tumor-infiltrating T cell activity. Rapid enzymatic digestion using collagenase and DNase allows a single-cell suspension to be extracted from tumors. The viability and cell surface markers of immune cells extracted from the tumor are preserved; therefore, it is appropriate for multiple downstream applications, including flow-assisted cell sorting of immune cells for culture or RNA extraction, flow cytometry analysis of immune cell populations. Here, we describe the ex vivo stimulation of T cell populations for intracellular cytokine quantification (IFN&#947; and TNF&#945;) and degranulation activity (CD107a) as a measure of overall cytotoxicity. Whole-tumor digests were stimulated with phorbol myristate acetate and ionomycin for 5 h, in the presence of anti-CD107a antibody in order to upregulate cytokine production and degranulation. The addition of brefeldin A and monensin for the final 4 h was performed to block extracellular transport and maximize cytokine detection. Extra- and intra-cellular staining of cells was then performed for flow cytometry analysis, where the proportion of IFN&#947;+, TNF&#945;+ and CD107a+ CD4+ and CD8+ T cells was quantified.
This method provides a starting base to perform comprehensive analysis of the tumor microenvironment.

Generation of Orthotopic Pancreatic Tumors and Ex vivo Characterization of Tumor-Infiltrating T Cell Cytotoxicity

This protocol describes the surgical generation of orthotopic pancreatic tumors and the rapid digestion of freshly isolated murine pancreatic tumors. Following digestion, viable immune cell populations can be used for further downstream analysis, including ex vivo stimulation of T cells for intracellular cytokine detection by flow cytometry.

Geração de tumores pancreáticos ortotópicos e caracterização ex vivo da citotoxicidade de células T infiltrada tumoral

In vivo models of pancreatic cancer provide invaluable tools for studying disease dynamics, immune infiltration and new therapeutic strategies. The ...

Modeling Breast Cancer in Human Breast Tissue using a Microphysiological System

Breast cancer (BC) remains a leading cause of death for women. Despite more than $700 million invested in BC research annually, 97% of candidate BC drugs fail clinical trials. Therefore, new models are needed to improve our understanding of the disease. The NIH Microphysiological Systems (MPS) program was developed to improve the clinical translation of basic science discoveries and promising new therapeutic strategies. Here we present a method for generating MPS for breast cancers (BC-MPS). This model adapts a previously described approach of culturing primary human white adipose tissue (WAT) by sandwiching WAT between adipose-derived stem cell sheets (ASC)s. Novel aspects of our BC-MPS include seeding BC cells into non-diseased human breast tissue (HBT) containing native extracellular matrix, mature adipocytes, resident fibroblasts, and immune cells; and sandwiching the BC-HBT admixture between HBT-derived ASC sheets. The resulting BC-MPS is stable in culture ex vivo for at least 14 days. This model system contains multiple elements of the microenvironment that influence BC including adipocytes, stromal cells, immune cells, and the extracellular matrix. Thus BC-MPS can be used to study the interactions between BC and its microenvironment. 
We demonstrate the advantages of our BC-MPS by studying two BC behaviors known to influence cancer progression and metastasis: 1) BC motility and 2) BC-HBT metabolic crosstalk. While BC motility has previously been demonstrated using intravital imaging, BC-MPS allows for high-resolution time-lapse imaging using fluorescence microscopy over several days. Furthermore, while metabolic crosstalk was previously demonstrated using BC cells and murine pre-adipocytes differentiated into immature adipocytes, our BC-MPS model is the first system to demonstrate this crosstalk between primary human mammary adipocytes and BC cells in vitro.

This protocol describes the construction of an in vitro microphysiological system for studying breast cancer using primary human breast tissue with off the shelf materials.

Modelando o câncer de mama no tecido mamário humano usando um sistema microfisiológico

Breast cancer (BC) remains a leading cause of death for women. Despite more than $700 million invested in BC research annually, 97% of candidate BC drugs ...

Modeling Brain Metastasis Via Tail-Vein Injection of Inflammatory Breast Cancer Cells

Metastatic spread to the brain is a common and devastating manifestation of many types of cancer. In the United States alone, about 200,000 patients are diagnosed with brain metastases each year. Significant progress has been made in improving survival outcomes for patients with primary breast cancer and systemic malignancies; however, the dismal prognosis for patients with clinical brain metastases highlights the urgent need to develop novel therapeutic agents and strategies against this deadly disease. The lack of suitable experimental models has been one of the major hurdles impeding advancement of our understanding of brain metastasis biology and treatment. Herein, we describe a xenograft mouse model of brain metastasis generated via tail-vein injection of an endogenously HER2-amplified cell line derived from inflammatory breast cancer (IBC), a rare and aggressive form of breast cancer. Cells were labeled with firefly luciferase and green fluorescence protein to monitor brain metastasis, and quantified metastatic burden by bioluminescence imaging, fluorescent stereomicroscopy, and histologic evaluation. Mice robustly and consistently develop brain metastases, allowing investigation of key mediators in the metastatic process and the development of preclinical testing of new treatment strategies.

We describe a xenograft mouse model of breast cancer brain metastasis generated via tail-vein injection of an endogenously HER2-amplified inflammatory breast cancer cell line.

Modelando Metástase Cerebral Via Injeção Venosa Caudal de Células Inflamatórias de Câncer de Mama

Metastatic spread to the brain is a common and devastating manifestation of many types of cancer. In the United States alone, about 200,000 patients are ...