Este trabajo fue apoyado por los Institutos Nacionales de Salud (R37CA228304 y R01HL146642 a Xi Chen, CA148761 a Jeffrey M. Rosen), el Departamento de Defensa de los Estados Unidos (W81XWH-19-1-0524 a Xi Chen, W81XWH-19-1-0035 a Xiangdong Lv), la Sociedad Americana del Cáncer (RSG-18-181-01-TBE a Xi Chen) y el Instituto de Prevención e Investigación del Cáncer de Texas (RR150009 CPRIT Scholar in Cancer Research Award to Xi Chen), el núcleo de xenoinjerto derivado del paciente y modelos avanzados in vivo en Baylor College of Medicine (financiamiento de RP170691 CPRIT Core Facility Award y NCI-CA125123 P30 Cancer Center Support Grant).

Todos los protocolos que utilizan animales han sido revisados y aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC). Los fragmentos tumorales, de alrededor de 1-2 mm3 de tamaño, provienen de material congelado viable obtenido del núcleo de xenoinjerto derivado del paciente y modelos avanzados in vivo en el Baylor College of Medicine.
1. Preparación de fragmentos de tumor mamario criopreservidos para trasplante
<ol><li>Transfiera el criovial con fragmentos tumorales de nitrógeno líquido a un baño de agua de 37 °C.</li>
	<li>Agitar el criovial con un movimiento suave ocasional durante la descongelación.</li>
	<li>Después de descongelar el tejido, saque el criovial del baño de agua y mezcle mediante una inversión suave.</li>
	<li>Secar el exterior del criovial y rociar con etanol al 70%. Transfiéralo a una campana de bioseguridad.</li>
	<li>Transfiera los tejidos tumorales descongelados a un tubo cónico de 15 ml lleno de 10 ml de medio Eagle modificado (DMEM) de Dulbecco frío. Mezclar bien invirtiendo el tubo. Permita que los fragmentos de tejido se asienten en la parte inferior del tubo.</li>
	<li>Aspirar el sobrenadante y resuspend en 10 mL de DMEM frío. Mezclar bien invirtiendo el tubo. Permita que los fragmentos de tejido se asienten en la parte inferior del tubo.</li>
	<li>Aspirar el sobrenadante y resuspend en 10 mL de DMEM frío. Coloque el tubo sobre hielo. NOTA: El tejido está listo para el trasplante.</li>
</ol>2. Recolección y preparación de tumor mamario fresco para trasplante
<ol><li>Eutanasia al ratón portador de tumor de mama. NOTA: El huésped PDX puede ser ratones hembra SCID / Beige, NSG o NRG, mientras que en el estudio actual se utilizan ratones balb / c hembras de 3 a 5 semanas de edad.</li>
	<li>Rocíe la región tumoral del ratón sacrificado con etanol al 70%. NOTA: Trate de evitar el vello con la muestra del tumor que podría causar la contaminación de los fragmentos tumorales para el criostoraje o el trasplante.</li>
	<li>Con pinzas dentados para pellizcar y levantar la piel que rodea el tumor, use tijeras para hacer una incisión corta.</li>
	<li>Separe el tumor de la piel con las tijeras para diseccionar todo el tumor del ratón huésped. Recorte cualquier tejido de almohadilla grasa de ratón restante de la superficie externa del tumor. Coloque el tumor en un tubo cónico de 15 ml lleno de 5 ml de DMEM frío. NOTA: Use tumores de un tamaño máximo de 1 cm de diámetro, ya que es probable que los tumores más grandes contengan núcleos necróticos.</li>
	<li>En una campana de bioseguridad, transfiera el tumor disecado a una placa de Petri estéril de 10 cm que contenga suficiente DMEM para evitar el secado.</li>
	<li>Cortar el tumor en fragmentos de 1 mm3 con bisturí o cuchilla en condiciones asépticas. NOTA: El bisturí o la cuchilla deben exponerse bajo los rayos UV en la campana de bioseguridad durante al menos 20 minutos antes de su uso.</li>
	<li>Transfiera los fragmentos del tumor a un tubo cónico de 15 ml lleno de DMEM frío. Coloque el tubo sobre hielo. NOTA: El tejido está listo para el trasplante. Los fragmentos tumorales disecados del paso 2.4 pueden ser, 1) congelados al chasquido en nitrógeno líquido para la extracción de proteínas y ARN / ADN, 2) fijados con paraformaldehído al 4% (PFA) o formalina tamponada neutra al 10% (NBF) para hematoxilina y eosina (H &E) y análisis de inmunohistoquímica (IHC), o 3) criopreservados en medio de congelación de 1,25 ml (10% de dimetilsulfóxido [DMSO], 40% de DMEM y 50% de suero bovino fetal [FBS]) mediante congelación lenta en un congelador de -80 °C durante la noche y luego transferencia a nitrógeno líquido para su almacenamiento a largo plazo.</li>
</ol>3. Preparar al animal para la cirugía
<ol><li>Para el manejo del dolor en animales, inyecte por vía subcutánea buprenorfina de liberación sostenida 60 min antes de la cirugía a una dosis de 1 mg / kg o siga la guía de la institución durante 72 h de cobertura analgésica.</li>
	<li>Configurar la sala quirúrgica de acuerdo con las pautas institucionales para cirugías asépticas.</li>
	<li>Anestesiar a una hembra de 4 semanas de edad en una cámara de inducción de la máquina de anestesia de isoflurano a una velocidad de ~ 11.25 ml / h. Transfiera el ratón al área de procedimiento, a la placa de cirugía estéril (goma de silicona), donde recibirá anestesia a través de una pequeña máscara facial. Coloque el ratón sobre su espalda y pegue las patas con cinta adhesiva en sus posiciones naturales. NOTA: SCID/Beige, NSG o NRG se utilizan para PDX y Balb/c se utiliza para los modelos de trasplante GEMM.</li>
	<li>Aplique ungüento oftálmico en los ojos para prevenir la sequedad.</li>
	<li>Confirme el nivel apropiado de sedación mediante pellizco del dedo del dedo del día. NOTA: Ninguna respuesta/movimiento del animal indica que el animal está suficientemente anestesiado y listo para la cirugía.</li>
	<li>Afeitar el ratón en la parte inferior del abdomen, especialmente la región alrededor del cuarto pezón donde se llevará a cabo la cirugía.</li>
	<li>Usando un movimiento circular y comenzando en el centro del sitio de la cirugía, trabaje hacia los bordes externos con exfoliante quirúrgico de povidona yodo, seguido de la eliminación de povidona yodada con una almohadilla de etanol isopropílico al 70%. Repita dos veces adicionales.</li>
</ol>4. Trasplante de fragmentos tumorales en la cuarta almohadilla de grasa mamaria (inguinal)
<ol><li>Use una cortina quirúrgica estéril para cubrir el cuerpo del animal, excepto el sitio de la incisión. NOTA: Confirme el nivel apropiado de sedación mediante pellizco del dedo del día antes de realizar la incisión.</li>
	<li>Usando pinzas dentados pellizque y levante la piel en el pezón # 4.</li>
	<li>Con el lado romo hacia abajo, use tijeras para hacer una incisión parasagital corta (aproximadamente 1 cm), desde el pezón # 4 hacia la cabeza.</li>
	<li>Usando un aplicador con punta de algodón, separe la piel del peritoneo en el lado medial de la incisión.</li>
	<li>Mientras sostiene el lado lateral de la incisión, despegue suavemente la almohadilla de grasa mamaria # 4 de la piel con el mismo hisopo.</li>
	<li>Una vez que la almohadilla de grasa esté separada, fije la piel con una aguja de 27 G cerca del cuerpo del animal.</li>
	<li>Si es experimentalmente necesario limpiar la almohadilla de grasa del epitelio mamario endógeno de ratón, realice los siguientes pasos.<ol>
<li>Usando los fórceps dentados, extienda suavemente la almohadilla de grasa lejos del cuerpo y ubique el ganglio linfático inguinal, que está debajo de los puntos de intersección de los vasos principales de la glándula (cerca de donde los fórceps sostendrán la glándula).</li>
		<li>Cauterice cuidadosamente los vasos mediales al ganglio linfático y la grasa uniéndose a las almohadillas de grasa cuarta y quinta que forman un área triangular. NOTA: Apague temporalmente la fuente de oxígeno para este paso.</li>
		<li>Usando tijeras de micro disección, corte cada vaso cauterizado de uno en uno (para asegurarse de que no haya sangrado después de cada corte) hasta que se extirpó la sección de la almohadilla de grasa que contiene el ganglio linfático.</li>
		<li>Deseche el tejido de la almohadilla de grasa "limpiado".</li>
	</ol></li>
	<li>Sostenga la cuarta almohadilla de grasa mamaria con forrcepciones de separación romas. Con la otra mano, inserte la punta cerrada de los fórceps finos en ángulo en el medio de la almohadilla de grasa por encima del vaso restante y cerca de la pared del peritoneo. Abra lentamente los forrórceps para hacer un pequeño bolsillo. Retire las pórceps finas en ángulo de la almohadilla de grasa.</li>
	<li>Usando las pórceps finas en ángulo, tome un pedazo de fragmento de tumor e insértelo en el bolsillo.</li>
	<li>Abra lentamente las puntas de los forróceps para liberar el fragmento del tumor en el bolsillo de la almohadilla de grasa.</li>
	<li>Retire las pórceps finos en ángulo con cuidado. NOTA: Mire el bolsillo para confirmar que el fragmento del tumor permanece en el bolsillo de la almohadilla de grasa mamaria al retirar los pórceps. Los tumores se pueden implantar en ambas almohadillas de grasa contralaterales cuando se necesita un exceso de tejido tumoral para experimentos o bancos. Los animales con trasplantes de doble cara no se recomiendan para los estudios de tratamiento debido a las interacciones conocidas entre los tumores contralaterales. Alternativamente, se puede utilizar un dispositivo trocar para el proceso de implantación.</li>
	<li>Comenzando desde la base de la incisión, recoja la piel de cada lado usando la garra y las pórceps dentados. Junte los dos lados y levante ligeramente para preparar la piel para la aplicación del clip de la herida. Descurra los bordes de la incisión con las pinzas de garra y pellizque los bordes para formar una superficie continua en la parte superior.</li>
	<li>Sosteniendo los dos lados juntos con las pórceps dentados, use el aplicador de clip de herida para colocar un clip de herida en el centro de la incisión. Si es necesario, aplique adhesivo tisular en los extremos de la incisión para mantenerlos cerrados y asegurados.</li>
	<li>Coloque al animal en una jaula limpia que esté en una superficie que se caliente. Controle el sangrado, los signos de dehiscencia y el dolor durante el período postquirúrgico. El animal debe estar despierto y en movimiento en cuestión de minutos después de la cirugía.</li>
	<li>Preste mucha atención al sitio de la incisión y a la salud general de los animales durante al menos 3 días después de la cirugía. Siga las pautas institucionales para el manejo del dolor.</li>
	<li>Limpie las herramientas quirúrgicas durante 10 s en un esterilizador de cuentas de vidrio antes de continuar con el próximo trasplante. Espere a que las herramientas se enfríen antes de usarlas.</li>
	<li>Repita los pasos 4.1-4.15 hasta que todos los ratones sean trasplantados. NOTA: Se requiere suplementación con estrógenos para los tumores ER+, que se pueden suministrar a través de agua o gránulos de liberación lenta59.</li>
</ol>5. Monitorización del crecimiento tumoral en respuesta al tratamiento farmacológico
NOTA: Los tumores palpables de PDX trasplantables establecidos y tumores p53 nulos tardan entre 2 semanas y 8 semanas en desarrollarse después de la cirugía, dependiendo de las tasas de crecimiento tumoral intrínseco.
<ol><li>Mida los tumores en dos dimensiones usando pinzas dos veces por semana. Calcule el volumen utilizando la fórmula: Volumen tumoral (mm3) = W2 x L/2 donde W es el ancho y L es la longitud del tumor.</li>
	<li>Iniciar el tratamiento farmacológico cuando el volumen tumoral alcance los 150−300 mm3. NOTA: Dependiendo de la propiedad de los medicamentos, se puede usar sonda oral o inyección intraperitoneal para administrar los medicamentos.</li>
	<li>Recolectar muestras tumorales y realizar tinción IHC60,aislamiento de proteínas y ARN/ADN y fenotipado inmune61 para diversos fines. Recolectar sangre y realizar fenotipado inmune o usarlo para estudios farmacocinéticos / farmacodinámicos.</li>
</ol>

MTL es el fundador de un socio limitado en StemMed, Ltd. y fundador y gerente de StemMed Holdings, su socio general. MTL es fundador y accionista de Tvardi Therapeutics, Inc. LED es un empleado compensado de StemMed, Ltd.

Para reducir las variaciones en el crecimiento tumoral entre los animales, es fundamental cortar el tejido tumoral en fragmentos de 1 mm3 para el trasplante. Los modelos que crecen tejidos blandos son más difíciles de trabajar y los fragmentos tumorales deben cortarse un poco más grandes (1-2 mm3). Al colocar el tejido en el bolsillo de la almohadilla de grasa mamaria, tenga cuidado de no dividir el tejido en múltiples pedazos, ya que esto dará como resultado múltiples tumores pequeños o tumo...

La mayoría de las muertes por cáncer de mama se pueden atribuyer a enfermedades recurrentes que son resistentes a las terapiasconvencionales1,2. La heterogeneidad inter e intratitumoral de los cánceres de mama contribuye a la resistencia a la terapia. Además, la heterogeneidad tumoral puede afectar el pronóstico preciso y desafiar el manejo de la enfermedad3,4. La identificación de biomarcadores predictivos de respuesta mejorará significativamente los resultados clínicos de las pacientes con cáncer de mama. A pesar de que la mayoría de los tipos de cáncer de mama son tumores inmunológicamente "fríos" que probablemente no responden a la inmunoterapia, los inhibidores del punto de control inmunitario han demostrado ser prometedores en ensayos clínicos2,5. Por ejemplo, un ensayo de fase III mostró una mejor supervivencia libre de enfermedad (SSE) y evidencia preliminar de que atezolizumab (anticuerpo monoclonal contra PD-L1) combinado con nab-paclitaxel puede proporcionar un beneficio de supervivencia general en comparación con nab-paclitaxel solo en tumores con tinción de PD-L1 del ≥1%6. El desarrollo de terapias que sensibilizan a los tumores de mama a la inmunoterapia revolucionará los regímenes de tratamiento.
Los modelos preclínicos que recapitulan fielmente la heterogeneidad del cáncer de mama humano y la respuesta farmacológica son fundamentales para estudiar la biología del tumor e identificar posibles biomarcadores para la terapia dirigida. Las líneas celulares inmortalizadas son ampliamente utilizadas para la investigación del cáncer de mama, ya que estas líneas celulares son fáciles de cultivar y modificar genéticamente para estudiar los mecanismos moleculares. Sin embargo, debido a la presión selectiva del cultivo celular a largo plazo in vitro, la deriva genética puede ocurrir con el tiempo y las líneas celulares de cáncer de mama pueden transportar alteraciones genómicas específicas de la línea celular que son distintas de las aberraciones en los tumores primarios de mama7,8,9.
Los fragmentos tumorales de xenoinjerto derivado del paciente (PDX) son capaces de recapitular la heterogeneidad de la enfermedad humana y son histológica e inmunohistoquímicamente similares al tumor de origen10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22 ,23,24,25,26,27,28,29. Es importante destacar que los modelos PDX son fenotípicamente estables en múltiples trasplantes, como lo demuestran la histología, el transcriptoma, el proteoma y el análisis genómico10,11,12, 13,14, 15,16,17,18,19,20,21,22 ,23,24,25,26,27,28,29. Los modelos PDX muestran respuestas al tratamiento comparables a las observadas clínicamente10,11, 12,13,14 , 15,16,17,18,19,20,21,22,23,24, 25,26,27,28,29. Se han establecido modelos PDX para receptores de estrógenopositivos(ER +), receptores de progesterona positivos (PR+),factor de crecimiento epidérmico 2 positivo (ERBB2+,HER2+) y cáncer de mama triple negativo (TNBC), y proporcionan una excelente plataforma para probar terapias endocrinas, químicas y dirigidas. Sin embargo, una advertencia principal de los modelos PDX en la actualidad es la falta de un sistema inmunológico funcional en el ratón.
Los modelos de ratón genéticamente modificados (GEMM), como los modelos de sobreexpresión homocigota nula Trp53, cMyc, Wnt1, PyMT o Her2, permiten el estudio de la iniciación espontánea del tumor, la progresión y la metástasis en el contexto de un sistema inmune intacto. Sin embargo, la latencia tumoral es larga, lo que dificulta la realización de ensayos preclínicos con múltiples brazos30,31. Sin embargo, GEMM puede ser trasplantado a huéspedes singénicos para generar un número suficiente de tumores que recapitulan estrechamente los tumores humanos32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42,43,44,45, 46,47,48,49,50,51,52,53,54,55. Por ejemplo, el epitelio mamario de un ratón BALB/c p53-nulo se trasplantó a las almohadillas de grasa despejadas de ratones receptores singénicos de tipo salvaje para formar tumores primarios, que pueden trasplantarse a huéspedes singénicos56,57. Los tumores p53-nulos recapitularon diferentes subtipos de tumores humanos.
La combinación de modelos PDX y GEMM trasplantable proporciona valiosas herramientas preclínicas para investigar la biología del tumor de mama, la respuesta a los medicamentos y la inmunidad antitumoral. En el protocolo actual, se describe un método de trasplante ortotópico de fragmentos tumorales PDX y GEMM en la almohadilla de grasa mamaria de ratón. Estos modelos son susceptibles de pasajes en serie y generalmente conservan un fenotipo estable. Para mitigar el riesgo de deriva genética o pérdida de heterogeneidad a través de pasajes a lo largo del tiempo, se criopreservan múltiples fragmentos de tejido en cada pasaje para su posterior trasplante en el caso de que se observen cambios biológicos o morfológicos a lo largo del tiempo29,58.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 mg/mL Buprenorphine-SR</td>
			<td>ZooPharm (via BCM veterinarians)</td>
			<td></td>
			<td>Sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>26G syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>148232E</td>
			<td>Sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Betadine Scrub</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>19-027132</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton Swabs</td>
			<td>VWR International Laboratory</td>
			<td>89031-272</td>
			<td>Sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>MT 10-013-CM</td>
			<td>Sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electric shaver</td>
			<td>Oster</td>
			<td>78005-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass beads sterilizer (Germinator)</td>
			<td>Roboz Surgical Store</td>
			<td>DS-401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lubricant ophthalmic ointment</td>
			<td>Akorn Animal Health</td>
			<td>17478-062-35</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Dissecting Forceps; Serrated, Angular (regular forceps)</td>
			<td>Roboz Surgical Store</td>
			<td>RS-5139</td>
			<td>Sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Dissecting Spring Scissors (fat pad cutter)</td>
			<td>Roboz Surgical Store</td>
			<td>RS-5658BT</td>
			<td>Sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Forceps (tissue placing forceps)</td>
			<td>Roboz Surgical Store</td>
			<td>RS-5069</td>
			<td>Sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri Dish</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>08-757- 100D</td>
			<td>Sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile drape</td>
			<td>Sai Infusion Technology</td>
			<td>PSS-SD1</td>
			<td>Sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgery scissors</td>
			<td>Roboz Surgical Store</td>
			<td>RS-5960</td>
			<td>Sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Forceps (claw forceps)</td>
			<td>Roboz Surgical Store</td>
			<td>RS-5158</td>
			<td>Sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wound clip applier</td>
			<td>BD Autoclip Wound System</td>
			<td>01-804</td>
			<td>Sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wound clip remover</td>
			<td>BD Autoclip Wound System</td>
			<td>01-804-15</td>
			<td>Sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wound clips</td>
			<td>BD Autoclip Wound System</td>
			<td>01-804-5</td>
			<td>Sterile</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

orthotopic transplantation of breast tumors as preclinical models for breast cancer

Los modelos preclínicos que recapitulan fielmente la heterogeneidad tumoral y la respuesta terapéutica son críticos para la investigación traslacional del cáncer de mama. Las líneas celulares inmortalizadas son fáciles de cultivar y modificar genéticamente para estudiar los mecanismos moleculares, sin embargo, la presión selectiva del cultivo celular a menudo conduce a alteraciones genéticas y epigenéticas con el tiempo. Los modelos de xenoinjerto derivado de pacientes (PDX) recapitulan fielmente la heterogeneidad y la respuesta farmacológica de los tumores de mama humanos. Los modelos PDX exhiben una latencia relativamente corta después del trasplante ortotópico que facilita la investigación de la biología del tumor de mama y la respuesta a los medicamentos. Los modelos de ratón genéticamente modificados trasplantables permiten el estudio de la inmunidad tumoral de mama. El protocolo actual describe el método para trasplantar ortotópicamente fragmentos de tumores de mama en la almohadilla de grasa mamaria seguido de tratamientos farmacológicos. Estos modelos preclínicos proporcionan enfoques valiosos para investigar la biología del tumor de mama, la respuesta a los medicamentos, el descubrimiento de biomarcadores y los mecanismos de resistencia a los medicamentos.

La Figura 1 muestra el equipo (Figura 1A) y los procedimientos clave ( Figura1B) del trasplante ortotópico. La Figura 2 muestra la caracterización de un tumor PDX trasplantado (MC1). Los fragmentos tumorales (1 mm3) del modelo MC1 se trasplantaron a la almohadilla de grasa # 4 de ratones SCID / Beige. Un mes después, el tam...

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Orthotopic Transplantation of Breast Tumors as Preclinical Models for Breast Cancer

Los modelos de xenoinjerto derivado del paciente (PDX) y los modelos de ratón genéticamente modificados trasplantables recapitulan fielmente la enfermedad humana y son modelos preferidos para la investigación básica y traslacional del cáncer de mama. Aquí, se describe un método para trasplantar ortotópicamente fragmentos de tumores de mama en la almohadilla de grasa mamaria para estudiar la biología del tumor y evaluar la respuesta al fármaco.

Trasplante ortotópico de tumores de mama como modelos preclínicos para el cáncer de mama

Preclinical models that faithfully recapitulate tumor heterogeneity and therapeutic response are critical for translational breast cancer research. ...

orthotopic-transplantation-breast-tumors-as-preclinical-models-for

Research

JoVE Journal

Cancer Research

5.8K vistas.  Baylor College of Medicine. Los modelos de xenoinjerto derivado del paciente (PDX) y los modelos de ratón genéticamente modificados trasplantables recapitulan fielmente la enfermedad humana y son modelos preferidos para la investigación básica y traslacional del cáncer de mama. Aquí, se describe un método para trasplantar ortotópicamente fragmentos de tumores de mama en la almohadilla de grasa mamaria para estudiar la biología del tumor y evaluar la respuesta al fármaco.

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Utilizing Functional Genomics Screening to Identify Potentially Novel Drug Targets in Cancer Cell Spheroid Cultures

The identification of functional driver events in cancer is central to furthering our understanding of cancer biology and indispensable for the discovery of the next generation of novel drug targets. It is becoming apparent that more complex models of cancer are required to fully appreciate the contributing factors that drive tumorigenesis in vivo and increase the efficacy of novel therapies that make the transition from pre-clinical models to clinical trials.
Here we present a methodology for generating uniform and reproducible tumor spheroids that can be subjected to siRNA functional screening. These spheroids display many characteristics that are found in solid tumors that are not present in traditional two-dimension culture. We show that several commonly used breast cancer cell lines are amenable to this protocol. Furthermore, we provide proof-of-principle data utilizing the breast cancer cell line BT474, confirming their dependency on amplification of the epidermal growth factor receptor HER2 and mutation of phosphatidylinositol-4,5-biphosphate 3-kinase (PIK3CA) when grown as tumor spheroids. Finally, we are able to further investigate and confirm the spatial impact of these dependencies using immunohistochemistry.

Identifying novel drug targets that transition from pre-clinical testing to human trials is a scientific priority. To that end, here we describe a functional genomics approach for examining the impact of gene depletion on cancer cell line spheroids, which more appropriately model human cancers in vivo.

La utilización de la genómica funcional de selección para identificar dianas farmacológicas potencialmente nueva en la celda cáncer culturas Esferoide

The identification of functional driver events in cancer is central to furthering our understanding of cancer biology and indispensable for the discovery ...

Investigación

Investigación sobre el cáncer

Ultrasonographic Evaluation of Breast Cancer-related Lymphedema

Lymphedema is one of the most common complications after breast cancer surgery. There are many diagnostic tools for lymphedema, but no standard method yet exists. Progressive Resistance Exercise (PRE) is expected to improve lymphedema without additional swelling. This study showed the therapeutic effects of PRE on lymphedema by using ultrasonography to measure the change in thickness of the muscle and subcutaneous tissue. The thickness of subcutaneous tissue decreased more in the PRE group than in the non-PRE group. Ultrasonography is widely used in many clinics because of its easy accessibility, safety, and inexpensiveness. Ultrasound is one of the best tools for diagnosing and determining treatment efficacy on breast cancer-related lymphedema (BCRL).

This study utilized ultrasonography for diagnosis and follow-up tests to confirm treatment efficacy of Progressive Resistance Exercise (PRE) in breast cancer-related lymphedema (BCRL). Ultrasonography can be applied effectively to ensure diagnosis and treatment of lymphedema.

La evaluación ecográfica de linfedema relacionado con el cáncer de mama

Lymphedema is one of the most common complications after breast cancer surgery. There are many diagnostic tools for lymphedema, but no standard method yet ...

Development of a Human Preclinical Model of Osteoclastogenesis from Peripheral Blood Monocytes Co-cultured with Breast Cancer Cell Lines

The crosstalk between tumor cells and bone cells in the bone microenvironment is crucial to understanding the mechanism of bone metastasis formation. We developed an in vitro fully human preclinical model of a co-culture of breast cancer cells and monocytes undergoing differentiation towards osteoclasts. We optimized a model of osteoclastogenesis starting from a sample of peripheral blood collected from healthy donors. Peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) were first separated by density gradient centrifugation, seeded at a high density and induced to differentiate by adding two growth factors (GFs): receptor activator of nuclear factor-&#954;B ligand (RANKL) and macrophage colony-stimulating factor (MCSF). The cells were left in culture for 14 days and then fixed and analyzed by downstream analysis. In osteolytic bone metastases, one of the effects of cancer cell arrival in bone is the induction of osteoclastogenesis. We thus challenged our model with co-cultures of breast cancer cells to study the differentiation power of cancer cells with respect to GFs. A straightforward way of studying cancer cell-osteoclast interaction is to perform indirect co-cultures based on the use of conditioned medium collected from breast cancer cell cultures and mixed with fresh medium. This mixture is then used to induce osteoclast differentiation. We also optimized a method of direct co-culture in which cancer cells and monocytes undergoing differentiation share the medium and exchange secreted factors. This is a significant improvement over the original indirect co-culture method as researchers can observe the reciprocal interactions of the two cell types and perform downstream analyses for both cancer cells and osteoclasts. This method enables us to study the effect of drugs on the metastatic bone microenvironment and to seed cell lines other than those derived from breast cancer. The model can also be used to study other diseases such as osteoporosis or other bone conditions.

This protocol describes development of an in vitro human preclinical model of osteoclastogenesis from peripheral blood monocytes cultured with breast cancer cell lines to mimic the cancer cell-osteoclast interaction. The model could be used to further our understanding of bone metastasis formation and improve therapeutic options.

Desarrollo de un modelo humano de preclínico de osteoclastogénesis de monocitos de sangre periférica cultivadas conjuntamente con líneas de células de cáncer de mama

The crosstalk between tumor cells and bone cells in the bone microenvironment is crucial to understanding the mechanism of bone metastasis formation. We ...

The Application of 1% Methylene Blue Dye As a Single Technique in Breast Cancer Sentinel Node Biopsy

In this study, we injected 1% methylene blue dye (MBD) into the subareolar or peritumoral space of the breast. In the case of breast conserving surgery (BCS), a separate incision in the lower axilla hairline was made to find the sentinel nodes (SNs). In mastectomy, the SNs were identified through the same mastectomy incision. The SNs were described as blue nodes or nodes with lymphatic blue channels. An anatomical landmark in the axilla was used to facilitate SNs identification. The SNs metastases were evaluated by intraoperative frozen section analysis and histopathology examination as it is a gold standard. Here, we described the MBD as the lone technique in breast cancer sentinel node biopsy (SNB) which could be useful when radioisotope tracer or patent or isosulfan blue dye (PBD) cannot be provided.

In Indonesia, sentinel node biopsy (SNB) is not routinely performed for breast cancer surgery because of the limitation to provide radioisotope tracer and isosulfan or patent blue dye (PBD). To overcome this obstacle, we applied 1% methylene blue dye (MBD) as a single agent to map the sentinel nodes (SNs).

La aplicación del 1% de tinte azul de metileno como una sola técnica en la biopsia de ganglio centinela de cáncer de mama

In this study, we injected 1% methylene blue dye (MBD) into the subareolar or peritumoral space of the breast. In the case of breast conserving surgery ...

Orthotopic Injection of Breast Cancer Cells into the Mice Mammary Fat Pad

A proper animal model is crucial for a better understanding of diseases. Animal models established by different methods (subcutaneous injections, xenografts, genetic manipulation, chemical reagents induction, etc.) have various pathological characters and play important roles in investigating certain aspects of diseases. Although no single model can totally mimic the whole human disease progression, orthotopic organs disease models with a proper stromal environment play an irreplaceable role in understanding diseases and screening for potential drugs. In this article, we describe how to implant breast cancer cells into the mammary fat pad in a simple, less invasive, and easy-to-handle way, and follow the metastasis to distant organs. With the proper features of primary tumor growth, breast and nipple pathological changes, and a high occurrence of other organs&#39; metastasis, this model maximumly mimics human breast cancer progression. Primary tumor growth in situ, long-distant metastasis, and the tumor microenvironment of breast cancer can be investigated by using this model.

Here, we present a protocol to implant breast cancer cells into the mammary fat pad in a simple, less invasive, and easy-to-handle way, and this mouse orthotopic breast cancer model with a proper mammary fat pad environment can be used to investigate various aspects of cancer.

Ortotópico inyección de las células de cáncer de mama en la almohadilla de grasa mamaria de ratones

A proper animal model is crucial for a better understanding of diseases. Animal models established by different methods (subcutaneous injections, ...

Obtaining Cancer Stem Cell Spheres from Gynecological and Breast Cancer Tumors

Cancer stem cells (CSC) are a small population with self-renewal and plasticity which are responsible for tumorigenesis, resistance to treatment and recurrent disease. This population can be identified by surface markers, enzymatic activity and a functional profile. These approaches per se are limited, due to phenotypic heterogeneity and CSC plasticity. Here, we update the sphere-forming protocol to obtain CSC spheres from breast and gynecological cancers, assessing functional properties, CSC markers and protein expression. The spheres are obtained with single-cell seeding at low density in suspension culture, using a semi-solid methylcellulose medium to avoid migration and aggregates. This profitable protocol can be used in cancer cell lines but also in primary tumors. The tridimensional non-adherent suspension culture thought to mimic the tumor microenvironment, particularly the CSC-niche, is supplemented with epidermal growth factor and basic fibroblast growth factor to ensure CSC signaling. Aiming for robust identification of CSC, we propose a complementary approach, combining functional and phenotypic evaluation. Sphere-forming capacity, self-renewal and sphere projection area establish CSC functional properties. Additionally, characterization comprises flow cytometry evaluation of the markers, represented by CD44+/CD24- and CD133, and Western blot, considering ALDH. The presented protocol was also optimized for primary tumor samples, following a sample digestion procedure, useful for translational research.

The aim of this methodology is to identify cancer stem cells (CSC) in cancer cell lines and primary human tumor samples with the sphere-forming protocol, in a robust manner, using functional assays and phenotypic characterization with flow cytometry and Western blot.

Obtención de esferas de células madre de cáncer de cáncer de tumores ginecológicos y de cáncer de mama

Cancer stem cells (CSC) are a small population with self-renewal and plasticity which are responsible for tumorigenesis, resistance to treatment and ...

Studying Triple Negative Breast Cancer Using Orthotopic Breast Cancer Model

Triple-negative breast cancer (TNBC) is an aggressive breast cancer subtype with limited therapeutic options. When compared to patients with less aggressive breast tumors, the 5-year survival rate of TNBC patients is 77% due to their characteristic drug-resistant phenotype and metastatic burden. Toward this end, murine models have been established aimed at identifying novel therapeutic strategies limiting TNBC tumor growth and metastatic spread. This work describes a practical guide for the TNBC orthotopic model where MDA-MB-231 breast cancer cells suspended in a basement membrane matrix are implanted in the fourth mammary fat pad, which closely mimics the cancer cell behavior in humans. Measurement of tumors by caliper, lung metastasis assessment via in vivo and ex vivo imaging, and molecular detection are discussed. This model provides an excellent platform to study therapeutic efficacy and is especially suitable for the study of the interaction between the primary tumor and distal metastatic sites.

This work presets an advanced protocol to accurately assess tumor loading by detection of green fluorescent protein and bioluminescence signals as well as the integration of quantitative molecular detection technique.

Estudio del triple cáncer de mama negativo con el modelo de cáncer de mama ortotópico

Triple-negative breast cancer (TNBC) is an aggressive breast cancer subtype with limited therapeutic options. When compared to patients with less ...

Generation of Orthotopic Pancreatic Tumors and Ex vivo Characterization of Tumor-Infiltrating T Cell Cytotoxicity

In vivo models of pancreatic cancer provide invaluable tools for studying disease dynamics, immune infiltration and new therapeutic strategies. The orthotopic murine model can be performed on large cohorts of immunocompetent mice simultaneously, is relatively inexpensive and preserves the cognate tissue microenvironment. The quantification of T cell infiltration and cytotoxic activity within orthotopic tumors provides a useful indicator of an antitumoral response.
This protocol describes the methodology for surgical generation of orthotopic pancreatic tumors by injection of a low number of syngeneic tumor cells resuspended in 5 &#181;L basement membrane directly into the pancreas. Mice bearing orthotopic tumors take approximately 30 days to reach endpoint, at which point tumors can be harvested and processed for characterization of tumor-infiltrating T cell activity. Rapid enzymatic digestion using collagenase and DNase allows a single-cell suspension to be extracted from tumors. The viability and cell surface markers of immune cells extracted from the tumor are preserved; therefore, it is appropriate for multiple downstream applications, including flow-assisted cell sorting of immune cells for culture or RNA extraction, flow cytometry analysis of immune cell populations. Here, we describe the ex vivo stimulation of T cell populations for intracellular cytokine quantification (IFN&#947; and TNF&#945;) and degranulation activity (CD107a) as a measure of overall cytotoxicity. Whole-tumor digests were stimulated with phorbol myristate acetate and ionomycin for 5 h, in the presence of anti-CD107a antibody in order to upregulate cytokine production and degranulation. The addition of brefeldin A and monensin for the final 4 h was performed to block extracellular transport and maximize cytokine detection. Extra- and intra-cellular staining of cells was then performed for flow cytometry analysis, where the proportion of IFN&#947;+, TNF&#945;+ and CD107a+ CD4+ and CD8+ T cells was quantified.
This method provides a starting base to perform comprehensive analysis of the tumor microenvironment.

Generation of Orthotopic Pancreatic Tumors and Ex vivo Characterization of Tumor-Infiltrating T Cell Cytotoxicity

This protocol describes the surgical generation of orthotopic pancreatic tumors and the rapid digestion of freshly isolated murine pancreatic tumors. Following digestion, viable immune cell populations can be used for further downstream analysis, including ex vivo stimulation of T cells for intracellular cytokine detection by flow cytometry.

Generación de tumores pancreáticos ortotópicos y caracterización ex vivo de la citotoxicidad de células T infiltrantes en tumores

In vivo models of pancreatic cancer provide invaluable tools for studying disease dynamics, immune infiltration and new therapeutic strategies. The ...

Modeling Breast Cancer in Human Breast Tissue using a Microphysiological System

Breast cancer (BC) remains a leading cause of death for women. Despite more than $700 million invested in BC research annually, 97% of candidate BC drugs fail clinical trials. Therefore, new models are needed to improve our understanding of the disease. The NIH Microphysiological Systems (MPS) program was developed to improve the clinical translation of basic science discoveries and promising new therapeutic strategies. Here we present a method for generating MPS for breast cancers (BC-MPS). This model adapts a previously described approach of culturing primary human white adipose tissue (WAT) by sandwiching WAT between adipose-derived stem cell sheets (ASC)s. Novel aspects of our BC-MPS include seeding BC cells into non-diseased human breast tissue (HBT) containing native extracellular matrix, mature adipocytes, resident fibroblasts, and immune cells; and sandwiching the BC-HBT admixture between HBT-derived ASC sheets. The resulting BC-MPS is stable in culture ex vivo for at least 14 days. This model system contains multiple elements of the microenvironment that influence BC including adipocytes, stromal cells, immune cells, and the extracellular matrix. Thus BC-MPS can be used to study the interactions between BC and its microenvironment. 
We demonstrate the advantages of our BC-MPS by studying two BC behaviors known to influence cancer progression and metastasis: 1) BC motility and 2) BC-HBT metabolic crosstalk. While BC motility has previously been demonstrated using intravital imaging, BC-MPS allows for high-resolution time-lapse imaging using fluorescence microscopy over several days. Furthermore, while metabolic crosstalk was previously demonstrated using BC cells and murine pre-adipocytes differentiated into immature adipocytes, our BC-MPS model is the first system to demonstrate this crosstalk between primary human mammary adipocytes and BC cells in vitro.

This protocol describes the construction of an in vitro microphysiological system for studying breast cancer using primary human breast tissue with off the shelf materials.

Modelado del cáncer de mama en el tejido mamario humano utilizando un sistema microfisiológico

Breast cancer (BC) remains a leading cause of death for women. Despite more than $700 million invested in BC research annually, 97% of candidate BC drugs ...

Modeling Brain Metastasis Via Tail-Vein Injection of Inflammatory Breast Cancer Cells

Metastatic spread to the brain is a common and devastating manifestation of many types of cancer. In the United States alone, about 200,000 patients are diagnosed with brain metastases each year. Significant progress has been made in improving survival outcomes for patients with primary breast cancer and systemic malignancies; however, the dismal prognosis for patients with clinical brain metastases highlights the urgent need to develop novel therapeutic agents and strategies against this deadly disease. The lack of suitable experimental models has been one of the major hurdles impeding advancement of our understanding of brain metastasis biology and treatment. Herein, we describe a xenograft mouse model of brain metastasis generated via tail-vein injection of an endogenously HER2-amplified cell line derived from inflammatory breast cancer (IBC), a rare and aggressive form of breast cancer. Cells were labeled with firefly luciferase and green fluorescence protein to monitor brain metastasis, and quantified metastatic burden by bioluminescence imaging, fluorescent stereomicroscopy, and histologic evaluation. Mice robustly and consistently develop brain metastases, allowing investigation of key mediators in the metastatic process and the development of preclinical testing of new treatment strategies.

We describe a xenograft mouse model of breast cancer brain metastasis generated via tail-vein injection of an endogenously HER2-amplified inflammatory breast cancer cell line.

Modelado de metástasis cerebral mediante inyección en la vena de cola de células inflamatorias de cáncer de mama

Metastatic spread to the brain is a common and devastating manifestation of many types of cancer. In the United States alone, about 200,000 patients are ...