Questo lavoro è stato sostenuto dal National Institutes of Health (R37CA228304 e R01HL146642 a Xi Chen, CA148761 a Jeffrey M. Rosen), dal Dipartimento della Difesa degli Stati Uniti (W81XWH-19-1-0524 a Xi Chen, W81XWH-19-1-0035 a Xiangdong Lv), dall'American Cancer Society (RSG-18-181-01-TBE a Xi Chen) e dal Cancer Prevention and Research Institute of Texas (RR150009 CPRIT Scholar in Cancer Research Award a Xi Chen), il Patient-Derived Xenograft e Advanced In Vivo Models Core presso il Baylor College of Medicine (finanziamento da RP170691 CPRIT Core Facility Award e NCI-CA125123 P30 Cancer Center Support Grant).

Tutti i protocolli che utilizzano animali sono stati rivisti e approvati dall'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC). I frammenti tumorali, di circa 1-2 mm3, provengono da stock validamente congelati ottenuti dallo xenotrapianto derivato dal paziente e dal nucleo dei modelli avanzati in vivo presso il Baylor College of Medicine.
1. Preparazione di frammenti di tumore mammario crioconservati per il trapianto
<ol><li>Trasferire la crioviale con frammenti tumorali dall'azoto liquido a un bagno d'acqua a 37 °C.</li>
	<li>Agitare il crioviale con un occasionale tocco delicato durante lo scongelamento.</li>
	<li>Dopo che il tessuto è stato scongelato, togliere il crioviale dal bagno d'acqua e mescolare con una delicata inversione.</li>
	<li>Asciugare l'esterno della crioviale e spruzzare con etanolo al 70%. Trasferiscilo su una cappa di biosicurezza.</li>
	<li>Trasferire i tessuti tumorali scongelati in un tubo conico da 15 ml riempito con 10 ml di mezzo Eagle modificato (DMEM) di Dulbecco freddo. Mescolare bene invertendo il tubo. Lasciare che i frammenti di tessuto si depositino sul fondo del tubo.</li>
	<li>Aspirare il surnatante e ricandidare in 10 ml di DMEM freddo. Mescolare bene invertendo il tubo. Lasciare che i frammenti di tessuto si depositino sul fondo del tubo.</li>
	<li>Aspirare il surnatante e ricandidare in 10 ml di DMEM freddo. Posizionare il tubo sul ghiaccio. NOTA: Il tessuto è pronto per il trapianto.</li>
</ol>2. Raccolta e preparazione del tumore mammario fresco per il trapianto
<ol><li>Eutanasia del topo portatore di tumore al seno. NOTA: l'ospite PDX può essere scid / beige, NSG o NRG topi femmina mentre nello studio attuale vengono utilizzati topi Balb / c di età compresa tra 3 e 5 settimane.</li>
	<li>Spruzzare la regione tumorale del topo eutanasizzato con il 70% di etanolo. NOTA: Cercare di evitare i capelli con il campione tumorale che potrebbe causare la contaminazione di frammenti tumorali per crioconservazione o trapianto.</li>
	<li>Con una pinza seghettata per pizzicare e sollevare la pelle che circonda il tumore, utilizzare le forbici per fare una breve incisione.</li>
	<li>Separare il tumore dalla pelle con le forbici per sezionare l'intero tumore dal topo ospite. Tagliare qualsiasi tessuto di grasso di topo rimanente dalla superficie esterna del tumore. Posizionare il tumore in un tubo conico da 15 ml riempito con 5 ml di DMEM freddo. NOTA: Utilizzare tumori ad una dimensione massima di 1 cm di diametro poiché è probabile che i tumori più grandi contengano nuclei necrotici.</li>
	<li>In una cappa di biosicurezza, trasferire il tumore sezionato in una capsula di Petri sterile di 10 cm contenente abbastanza DMEM per prevenire l'essiccazione.</li>
	<li>Tagliare il tumore in 1 mm3 frammenti con bisturi o lama in condizioni asettiche. NOTA: Il bisturi o la lama devono essere esposti sotto i raggi UV nella cappa di biosicurezza per almeno 20 minuti prima dell'uso.</li>
	<li>Trasferire i frammenti tumorali in un tubo conico da 15 ml riempito con DMEM freddo. Posizionare il tubo sul ghiaccio. NOTA: Il tessuto è pronto per il trapianto. I frammenti tumorali sezionati dallo step 2.4 possono essere, 1) congelati in azoto liquido per l'estrazione di proteine e RNA/DNA, 2) fissati con analisi paraformaldeide (PFA) al 4% o formalina tamponata neutra al 10% (NBF) per ematossilina ed eosina (H&E) e immunoistochimica (IHC), oppure 3) crioconservati in mezzo di congelamento da 1,25 mL (10% dimetilsolfossido [DMSO], 40% DMEM e 50% siero bovino fetale [FBS]) mediante congelamento lento in un congelatore a -80 °C durante la notte e quindi trasferimento in azoto liquido per la conservazione a lungo termine.</li>
</ol>3. Preparare l'animale per la chirurgia
<ol><li>Per la gestione del dolore animale, iniettare per via sottocutanea buprenorfina a rilascio prolungato 60 minuti prima dell'intervento chirurgico alla dose di 1 mg / kg o seguire la guida dell'istituzione per 72 ore di copertura analgesica.</li>
	<li>Impostare la suite chirurgica secondo le linee guida istituzionali per gli interventi chirurgici asettici.</li>
	<li>Anestetizzare una femmina di 4 settimane in una camera di induzione della macchina per anestesia isoflurano alla velocità di ~ 11,25 ml / h. Trasferire il mouse nell'area della procedura, sulla scheda chirurgica sterile (gomma siliconica), dove riceverà l'anestesia attraverso una piccola maschera facciale. Metti il mouse sulla schiena e attacca le gambe nelle loro posizioni naturali. NOTA: SCID / Beige, NSG o NRG sono utilizzati per PDX e Balb / c viene utilizzato per i modelli di trapianto GEMM.</li>
	<li>Applicare unguento oftalmico agli occhi per prevenire la secchezza.</li>
	<li>Confermare il livello appropriato di sedazione con il pizzico della dita dei dita. NOTA: Nessuna risposta/movimento dell'animale indica che l'animale è sufficientemente anestetizzato e pronto per l'intervento chirurgico.</li>
	<li>Rasare il topo sull'addome inferiore, in particolare la regione intorno al quarto capezzolo dove avrà luogo l'intervento chirurgico.</li>
	<li>Utilizzando un movimento circolare e iniziando al centro del sito chirurgico, lavorare verso i bordi esterni con scrub chirurgico povidone-iodio, seguito dalla rimozione di povidone-iodio con un tampone di etanolo isopropilico al 70%. Ripeti altre due volte.</li>
</ol>4. Trapianto di frammenti tumorali nel quarto cuscinetto di grasso mammario (inguinale)
<ol><li>Utilizzare un drappo chirurgico sterile per coprire il corpo dell'animale tranne il sito di incisione. NOTA: Confermare il livello appropriato di sedazione con il pizzico della dita prima di effettuare l'incisione.</li>
	<li>Usando una pinza seghettata pizzicare e sollevare la pelle al capezzolo #4.</li>
	<li>Con il lato smussato verso il basso, usa le forbici per fare un'incisione parasagittale corta (circa 1 cm), dal capezzolo #4 verso la testa.</li>
	<li>Utilizzando un applicatore con punta di cotone, separare la pelle dal peritoneo sul lato mediale dell'incisione.</li>
	<li>Mentre si tiene premuto il lato laterale dell'incisione, sbucciare delicatamente il cuscinetto di grasso mammario #4 dalla pelle usando lo stesso tampone.</li>
	<li>Una volta separato il cuscinetto di grasso, fissare la pelle con un ago da 27 G vicino al corpo dell'animale.</li>
	<li>Se è sperimentalmente necessario eliminare il cuscinetto adiposo dell'epitelio mammario endogeno del topo, eseguire i seguenti passaggi.<ol>
<li>Usando la pinna seghettata, estendere delicatamente il cuscinetto di grasso lontano dal corpo e localizzare il linfonodo inguinale, che si trova sotto i punti di intersezione dei vasi principali nella ghiandola (vicino a dove la pinna terrà la ghiandola).</li>
		<li>Cauterizzare con cura i vasi mediali al linfonodo e il grasso che unisce il quarto e il quinto cuscinetto di grasso che forma un'area triangolare. NOTA: spegnere temporaneamente la sorgente di ossigeno per questo passaggio.</li>
		<li>Usando le forbici da microssazione, tagliare ogni vaso cauterizzato uno alla volta (per garantire che non ci sia sanguinamento dopo ogni taglio) fino a quando la sezione del cuscinetto di grasso che contiene il linfonodo non viene rimossa.</li>
		<li>Scartare il tessuto del cuscinetto adiposo "cancellato".</li>
	</ol></li>
	<li>Tenere il quarto cuscinetto di grasso mammario usando una pinffa di separazione smussata. Con l'altra mano, inserire la punta chiusa della pinna fine angolata nel mezzo del cuscinetto di grasso sopra il vaso rimanente e vicino alla parete del peritoneo. Apri lentamente la pinp per creare una piccola tasca. Rimuovere la pinffa fine angolata dal cuscinetto grasso.</li>
	<li>Usando la pinciglia fine angolata, prendi un pezzo di frammento di tumore e inseriscilo nella tasca.</li>
	<li>Aprire lentamente le punte della pince per rilasciare il frammento tumorale nella tasca del cuscinetto di grasso.</li>
	<li>Prelevare con attenzione la pinciglia fine angolata. NOTA: Guarda la tasca per confermare che il frammento tumorale rimane nella tasca del cuscinetto di grasso mammario quando ritiri la pinci. I tumori possono essere impiantati in entrambi i cuscinetti di grasso controlaterale quando è necessario un eccesso di tessuto tumorale per esperimenti o banche. Gli animali con trapianti a doppia faccia non sono raccomandati per gli studi di trattamento a causa di interazioni note tra tumori controlaterali. In alternativa, un dispositivo trocar potrebbe essere utilizzato per il processo di impianto.</li>
	<li>Partendo dalla base dell'incisione, raccogliere la pelle su ciascun lato utilizzando l'artiglio e la pinze seghettate. Unire i due lati e sollevare leggermente per preparare la pelle per l'applicazione della clip per ferite. Srotolare i bordi dell'incisione con la pinza ad artiglio e pizzicare i bordi insieme per formare una superficie continua nella parte superiore.</li>
	<li>Tenendo i due lati insieme con una pinica seghettata, utilizzare l'applicatore di clip per ferite per posizionare una clip per ferita al centro dell'incisione. Se necessario, applicare l'adesivo tissutale alle estremità dell'incisione per tenerle chiuse e fissate.</li>
	<li>Metti l'animale in una gabbia pulita che si trova su una superficie riscaldante. Monitorare il sanguinamento, i segni di deiscenza e il dolore durante il periodo post-chirurgico. L'animale dovrebbe alzarsi e muoversi in pochi minuti dopo l'intervento chirurgico.</li>
	<li>Prestare molta attenzione al sito di incisione e alla salute generale degli animali per almeno 3 giorni dopo l'intervento chirurgico. Seguire le linee guida istituzionali per la gestione del dolore.</li>
	<li>Pulire gli strumenti chirurgici per 10 s in uno sterilizzatore di perle di vetro prima di continuare con il successivo trapianto. Attendere che gli strumenti si raffreddino prima dell'uso.</li>
	<li>Ripetere i passaggi 4.1-4.15 fino a quando tutti i topi sono trapiantati. NOTA: L'integrazione di estrogeni è necessaria per i tumori ER+, che possono essere forniti attraverso acqua o pellet a rilascio lento59.</li>
</ol>5. Monitoraggio della crescita tumorale in risposta al trattamento farmacologico
NOTA: i tumori palpabili dei PDX trapiantabili stabiliti e dei tumori p53-null richiedono tra 2 settimane e 8 settimane per svilupparsi dopo l'intervento chirurgico, a seconda dei tassi di crescita intrinseca del tumore.
<ol><li>Misurare i tumori in due dimensioni usando le pinze due volte a settimana. Calcola il volume usando la formula: Volume del tumore (mm3) = L2 x L/2 dove W è la larghezza e L è la lunghezza del tumore.</li>
	<li>Iniziare il trattamento farmacologico quando il volume del tumore raggiunge 150-300 mm3. NOTA: A seconda delle proprietà dei farmaci, il gavage orale o l'iniezione intraperitoneale possono essere utilizzati per portare i farmaci.</li>
	<li>Raccogliere campioni di tumore ed eseguire la colorazione IHC60,l'isolamento di proteine e RNA / DNA e la fenotipizzazione immunitaria61 per vari scopi. Raccogliere il sangue ed eseguire la fenotipizzazione immunitaria o utilizzarlo per studi farmacocinetici/farmacodinamici.</li>
</ol>

MTL è il fondatore di un socio accomandato in StemMed, Ltd. e fondatore e manager in StemMed Holdings, il suo socio accomandatario. MTL è fondatore e azionista di Tvardi Therapeutics, Inc. LED è un dipendente retribuito di StemMed, Ltd.

Per ridurre le variazioni nella crescita del tumore tra gli animali, è fondamentale tagliare il tessuto tumorale in 1 mm3 frammenti per il trapianto. I modelli che crescono i tessuti molli sono più difficili da lavorare e i frammenti tumorali devono essere tagliati leggermente più grandi (1-2 mm3). Quando si posiziona il tessuto nella tasca del cuscinetto di grasso mammario, fare attenzione a non dividere il tessuto in più pezzi in quanto ciò si tradurrà in più piccoli tumori o tumori di form...

La maggior parte dei decessi per cancro al seno può essere attribuita a malattie ricorrenti resistenti alle terapie convenzionali1,2. L'eterogeneità inter- e intra-tumorale dei tumori al seno contribuisce alla resistenza alla terapia. Inoltre, l'eterogeneità del tumore può compromettere una prognosi accurata e sfidare la gestione della malattia3,4. L'identificazione di biomarcatori predittivi di risposta migliorerà significativamente gli esiti clinici delle pazienti con cancro al seno. Anche se la maggior parte dei tipi di cancro al seno sono tumori immunologicamente "freddi" che probabilmente non rispondono all'immunoterapia, gli inibitori del checkpoint immunitario hanno mostrato risultati promettenti negli studi clinici2,5. Ad esempio, uno studio di fase III ha mostrato un miglioramento della sopravvivenza libera da malattia (DFS) e prove preliminari che atezolizumab (anticorpo monoclonale contro PD-L1) combinato con nab-paclitaxel può fornire un beneficio di sopravvivenza globale rispetto a nab-paclitaxel da solo nei tumori con colorazione PD-L1 ≥1%6. Lo sviluppo di terapie che sensibilizzano i tumori al seno all'immunoterapia rivoluzionerà i regimi di trattamento.
I modelli preclinici che ricapitolano fedelmente l'eterogeneità del cancro al seno umano e la risposta ai farmaci sono fondamentali per studiare la biologia del tumore e identificare potenziali biomarcatori per la terapia mirata. Le linee cellulari immortalizzate sono ampiamente utilizzate per la ricerca sul cancro al seno poiché queste linee cellulari sono facili da coltivare e modificano geneticamente per studiare i meccanismi molecolari. Tuttavia, a causa della pressione selettiva della coltura cellulare a lungo termine in vitro, la deriva genetica può verificarsi nel tempo e le linee cellulari del cancro al seno possono portare alterazioni genomiche specifiche della linea cellulare che sono distinte dalle aberrazioni nei tumori mammari primari7,8,9.
I blocchi tumorali derivati dallo xenotrapianto derivato dal paziente (PDX) sono in grado di ricapitolare l'eterogeneità della malattia umana e sono istologicamente e immunoistochimicamente simili al tumore di origine10,11, 12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22 ,23,24,25,26,27,28,29. È importante sottolineare che i modelli PDX sono fenotipicamente stabili in più trapianti, come evidenziato dall'istologia, dal trascrittoma, dal proteoma e dall'analisi genomica10,11, 12,13, 14,15,16,17,18,19,20,21,22 ,23,24,25,26,27,28,29. I modelli PDX mostrano risposte al trattamento paragonabili a quelle osservate clinicamente10,11, 12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24, 25,26,27,28,29. Sono stati stabiliti modelli PDXper il recettore degli estrogeni positivo (ER +), il recettore del progesterone positivo (PR+),il fattore di crescita epidermico2positivo (ERBB2 +, HER2+)e il carcinoma mammario triplo negativo (TNBC) I modelli PDX e forniscono un'eccellente piattaforma per testare terapie endocrine, chemio e mirate. Tuttavia, un avvertimento principale dei modelli PDX al momento è la mancanza di un sistema immunitario funzionale nel topo.
I modelli murini geneticamente modificati (GEMM), come i modelli di sovraespressione Omozigoti Trp53 null, cMyc, Wnt1, PyMT o Her2, consentono lo studio dell'inizio spontaneo del tumore, della progressione e delle metastasi nel contesto di un sistema immunitario intatto. Tuttavia, la latenza tumorale è lunga, il che rende difficile condurre studi preclinici con più bracci30,31. Tuttavia, GEMM può essere trapiantato in ospiti singenici per generare un numero sufficiente di tumori che ricapitolano strettamente i tumori umani32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42,43,44,45, 46,47,48,49,50,51,52,53,54,55. Ad esempio, l'epitelio mammario di un topo BALB/c p53-null è stato trapiantato nei cuscinetti adiposi eliminati di topi riceventi wild-type singenici per formare tumori primari, che possono essere ulteriormente trapiantati in ospiti singenici56,57. I tumori p53-null ricapitolati diversi sottotipi di tumori umani.
La combinazione di modelli PDX e GEMM trapiantabile fornisce preziosi strumenti preclinici per studiare la biologia del tumore al seno, la risposta ai farmaci e l'immunità antitumorale. Nel protocollo attuale, viene descritto un metodo di trapianto ortotopico di frammenti tumorali PDX e GEMM nel cuscinetto di grasso mammario del topo. Questi modelli sono suscettibili di passaggi seriali e di solito mantengono un fenotipo stabile. Per mitigare il rischio di deriva genetica o perdita di eterogeneità tra i passaggi nel tempo, più frammenti di tessuto vengono crioconservati ad ogni passaggio per il successivo trapianto nel caso in cui si osservino cambiamenti biologici o morfologici nel tempo29,58.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 mg/mL Buprenorphine-SR</td>
			<td>ZooPharm (via BCM veterinarians)</td>
			<td></td>
			<td>Sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>26G syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>148232E</td>
			<td>Sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Betadine Scrub</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>19-027132</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton Swabs</td>
			<td>VWR International Laboratory</td>
			<td>89031-272</td>
			<td>Sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>MT 10-013-CM</td>
			<td>Sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electric shaver</td>
			<td>Oster</td>
			<td>78005-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass beads sterilizer (Germinator)</td>
			<td>Roboz Surgical Store</td>
			<td>DS-401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lubricant ophthalmic ointment</td>
			<td>Akorn Animal Health</td>
			<td>17478-062-35</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Dissecting Forceps; Serrated, Angular (regular forceps)</td>
			<td>Roboz Surgical Store</td>
			<td>RS-5139</td>
			<td>Sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Dissecting Spring Scissors (fat pad cutter)</td>
			<td>Roboz Surgical Store</td>
			<td>RS-5658BT</td>
			<td>Sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Forceps (tissue placing forceps)</td>
			<td>Roboz Surgical Store</td>
			<td>RS-5069</td>
			<td>Sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri Dish</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>08-757- 100D</td>
			<td>Sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile drape</td>
			<td>Sai Infusion Technology</td>
			<td>PSS-SD1</td>
			<td>Sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgery scissors</td>
			<td>Roboz Surgical Store</td>
			<td>RS-5960</td>
			<td>Sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Forceps (claw forceps)</td>
			<td>Roboz Surgical Store</td>
			<td>RS-5158</td>
			<td>Sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wound clip applier</td>
			<td>BD Autoclip Wound System</td>
			<td>01-804</td>
			<td>Sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wound clip remover</td>
			<td>BD Autoclip Wound System</td>
			<td>01-804-15</td>
			<td>Sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wound clips</td>
			<td>BD Autoclip Wound System</td>
			<td>01-804-5</td>
			<td>Sterile</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

orthotopic transplantation of breast tumors as preclinical models for breast cancer

I modelli preclinici che ricapitolano fedelmente l'eterogeneità del tumore e la risposta terapeutica sono fondamentali per la ricerca traslazionale sul cancro al seno. Le linee cellulari immortalizzate sono facili da coltivare e modificare geneticamente per studiare i meccanismi molecolari, ma la pressione selettiva della coltura cellulare spesso porta ad alterazioni genetiche ed epigenetiche nel tempo. I modelli di xenotrapianto derivato dal paziente (PDX) ricapitolano fedelmente l'eterogeneità e la risposta al farmaco dei tumori al seno umani. I modelli PDX mostrano una latenza relativamente breve dopo il trapianto ortotopico che facilita lo studio della biologia del tumore al seno e della risposta ai farmaci. I modelli murini geneticamente modificati trapiantabili consentono lo studio dell'immunità del tumore al seno. L'attuale protocollo descrive il metodo per trapiantare ortotopicamente frammenti di tumore al seno nel cuscinetto di grasso mammario seguito da trattamenti farmacologici. Questi modelli preclinici forniscono approcci preziosi per studiare la biologia del tumore al seno, la risposta ai farmaci, la scoperta di biomarcatori e i meccanismi di resistenza ai farmaci.

La Figura 1 mostra l'attrezzatura (Figura 1A) e le procedure chiave ( Figura1B) del trapianto ortotopico. La Figura 2 mostra la caratterizzazione di un tumore PDX trapiantato (MC1). Frammenti tumorali (1 mm3)del modello MC1 sono stati trapiantati nel cuscinetto di grasso n. 4 dei topi SCID / Beige. Un mese dopo, la dimensione ...

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Orthotopic Transplantation of Breast Tumors as Preclinical Models for Breast Cancer

I modelli di xenotrapianto derivato dal paziente (PDX) e i modelli murini trapiantabili geneticamente modificati ricapitolano fedelmente la malattia umana e sono modelli preferiti per la ricerca di base e traslazionale sul cancro al seno. Qui, viene descritto un metodo per trapiantare ortotopicamente frammenti di tumore al seno nel cuscinetto di grasso mammario per studiare la biologia del tumore e valutare la risposta al farmaco.

Trapianto ortotopico di tumori al seno come modelli preclinici per il cancro al seno

Preclinical models that faithfully recapitulate tumor heterogeneity and therapeutic response are critical for translational breast cancer research. ...

orthotopic-transplantation-breast-tumors-as-preclinical-models-for

Research

JoVE Journal

Cancer Research

5.8K Views.  Baylor College of Medicine. I modelli di xenotrapianto derivato dal paziente (PDX) e i modelli murini trapiantabili geneticamente modificati ricapitolano fedelmente la malattia umana e sono modelli preferiti per la ricerca di base e traslazionale sul cancro al seno. Qui, viene descritto un metodo per trapiantare ortotopicamente frammenti di tumore al seno nel cuscinetto di grasso mammario per studiare la biologia del tumore e valutare la risposta al farmaco.

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Utilizing Functional Genomics Screening to Identify Potentially Novel Drug Targets in Cancer Cell Spheroid Cultures

The identification of functional driver events in cancer is central to furthering our understanding of cancer biology and indispensable for the discovery of the next generation of novel drug targets. It is becoming apparent that more complex models of cancer are required to fully appreciate the contributing factors that drive tumorigenesis in vivo and increase the efficacy of novel therapies that make the transition from pre-clinical models to clinical trials.
Here we present a methodology for generating uniform and reproducible tumor spheroids that can be subjected to siRNA functional screening. These spheroids display many characteristics that are found in solid tumors that are not present in traditional two-dimension culture. We show that several commonly used breast cancer cell lines are amenable to this protocol. Furthermore, we provide proof-of-principle data utilizing the breast cancer cell line BT474, confirming their dependency on amplification of the epidermal growth factor receptor HER2 and mutation of phosphatidylinositol-4,5-biphosphate 3-kinase (PIK3CA) when grown as tumor spheroids. Finally, we are able to further investigate and confirm the spatial impact of these dependencies using immunohistochemistry.

Identifying novel drug targets that transition from pre-clinical testing to human trials is a scientific priority. To that end, here we describe a functional genomics approach for examining the impact of gene depletion on cancer cell line spheroids, which more appropriately model human cancers in vivo.

Utilizzando Genomica Funzionale screening per identificare gli obiettivi farmaco potenzialmente romanzo in Cancer Cell Culture Spheroid

The identification of functional driver events in cancer is central to furthering our understanding of cancer biology and indispensable for the discovery ...

Ricerca

Ricerca sul cancro

Ultrasonographic Evaluation of Breast Cancer-related Lymphedema

Lymphedema is one of the most common complications after breast cancer surgery. There are many diagnostic tools for lymphedema, but no standard method yet exists. Progressive Resistance Exercise (PRE) is expected to improve lymphedema without additional swelling. This study showed the therapeutic effects of PRE on lymphedema by using ultrasonography to measure the change in thickness of the muscle and subcutaneous tissue. The thickness of subcutaneous tissue decreased more in the PRE group than in the non-PRE group. Ultrasonography is widely used in many clinics because of its easy accessibility, safety, and inexpensiveness. Ultrasound is one of the best tools for diagnosing and determining treatment efficacy on breast cancer-related lymphedema (BCRL).

This study utilized ultrasonography for diagnosis and follow-up tests to confirm treatment efficacy of Progressive Resistance Exercise (PRE) in breast cancer-related lymphedema (BCRL). Ultrasonography can be applied effectively to ensure diagnosis and treatment of lymphedema.

Ecografica Valutazione del seno Linfedema correlati al cancro

Lymphedema is one of the most common complications after breast cancer surgery. There are many diagnostic tools for lymphedema, but no standard method yet ...

Development of a Human Preclinical Model of Osteoclastogenesis from Peripheral Blood Monocytes Co-cultured with Breast Cancer Cell Lines

The crosstalk between tumor cells and bone cells in the bone microenvironment is crucial to understanding the mechanism of bone metastasis formation. We developed an in vitro fully human preclinical model of a co-culture of breast cancer cells and monocytes undergoing differentiation towards osteoclasts. We optimized a model of osteoclastogenesis starting from a sample of peripheral blood collected from healthy donors. Peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) were first separated by density gradient centrifugation, seeded at a high density and induced to differentiate by adding two growth factors (GFs): receptor activator of nuclear factor-&#954;B ligand (RANKL) and macrophage colony-stimulating factor (MCSF). The cells were left in culture for 14 days and then fixed and analyzed by downstream analysis. In osteolytic bone metastases, one of the effects of cancer cell arrival in bone is the induction of osteoclastogenesis. We thus challenged our model with co-cultures of breast cancer cells to study the differentiation power of cancer cells with respect to GFs. A straightforward way of studying cancer cell-osteoclast interaction is to perform indirect co-cultures based on the use of conditioned medium collected from breast cancer cell cultures and mixed with fresh medium. This mixture is then used to induce osteoclast differentiation. We also optimized a method of direct co-culture in which cancer cells and monocytes undergoing differentiation share the medium and exchange secreted factors. This is a significant improvement over the original indirect co-culture method as researchers can observe the reciprocal interactions of the two cell types and perform downstream analyses for both cancer cells and osteoclasts. This method enables us to study the effect of drugs on the metastatic bone microenvironment and to seed cell lines other than those derived from breast cancer. The model can also be used to study other diseases such as osteoporosis or other bone conditions.

This protocol describes development of an in vitro human preclinical model of osteoclastogenesis from peripheral blood monocytes cultured with breast cancer cell lines to mimic the cancer cell-osteoclast interaction. The model could be used to further our understanding of bone metastasis formation and improve therapeutic options.

Sviluppo di un modello preclinico umano di osteoclastogenesi dai monociti del sangue periferico co-coltivati con linee cellulari di cancro al seno

The crosstalk between tumor cells and bone cells in the bone microenvironment is crucial to understanding the mechanism of bone metastasis formation. We ...

The Application of 1% Methylene Blue Dye As a Single Technique in Breast Cancer Sentinel Node Biopsy

In this study, we injected 1% methylene blue dye (MBD) into the subareolar or peritumoral space of the breast. In the case of breast conserving surgery (BCS), a separate incision in the lower axilla hairline was made to find the sentinel nodes (SNs). In mastectomy, the SNs were identified through the same mastectomy incision. The SNs were described as blue nodes or nodes with lymphatic blue channels. An anatomical landmark in the axilla was used to facilitate SNs identification. The SNs metastases were evaluated by intraoperative frozen section analysis and histopathology examination as it is a gold standard. Here, we described the MBD as the lone technique in breast cancer sentinel node biopsy (SNB) which could be useful when radioisotope tracer or patent or isosulfan blue dye (PBD) cannot be provided.

In Indonesia, sentinel node biopsy (SNB) is not routinely performed for breast cancer surgery because of the limitation to provide radioisotope tracer and isosulfan or patent blue dye (PBD). To overcome this obstacle, we applied 1% methylene blue dye (MBD) as a single agent to map the sentinel nodes (SNs).

L'applicazione dell'1% di colorazione blu di metilene come singola tecnica nel cancro al seno Sentinel Node Biopsy

In this study, we injected 1% methylene blue dye (MBD) into the subareolar or peritumoral space of the breast. In the case of breast conserving surgery ...

Orthotopic Injection of Breast Cancer Cells into the Mice Mammary Fat Pad

A proper animal model is crucial for a better understanding of diseases. Animal models established by different methods (subcutaneous injections, xenografts, genetic manipulation, chemical reagents induction, etc.) have various pathological characters and play important roles in investigating certain aspects of diseases. Although no single model can totally mimic the whole human disease progression, orthotopic organs disease models with a proper stromal environment play an irreplaceable role in understanding diseases and screening for potential drugs. In this article, we describe how to implant breast cancer cells into the mammary fat pad in a simple, less invasive, and easy-to-handle way, and follow the metastasis to distant organs. With the proper features of primary tumor growth, breast and nipple pathological changes, and a high occurrence of other organs&#39; metastasis, this model maximumly mimics human breast cancer progression. Primary tumor growth in situ, long-distant metastasis, and the tumor microenvironment of breast cancer can be investigated by using this model.

Here, we present a protocol to implant breast cancer cells into the mammary fat pad in a simple, less invasive, and easy-to-handle way, and this mouse orthotopic breast cancer model with a proper mammary fat pad environment can be used to investigate various aspects of cancer.

Orthotopic iniezione delle cellule di cancro al seno in topi cuscinetto grasso mammario

A proper animal model is crucial for a better understanding of diseases. Animal models established by different methods (subcutaneous injections, ...

Obtaining Cancer Stem Cell Spheres from Gynecological and Breast Cancer Tumors

Cancer stem cells (CSC) are a small population with self-renewal and plasticity which are responsible for tumorigenesis, resistance to treatment and recurrent disease. This population can be identified by surface markers, enzymatic activity and a functional profile. These approaches per se are limited, due to phenotypic heterogeneity and CSC plasticity. Here, we update the sphere-forming protocol to obtain CSC spheres from breast and gynecological cancers, assessing functional properties, CSC markers and protein expression. The spheres are obtained with single-cell seeding at low density in suspension culture, using a semi-solid methylcellulose medium to avoid migration and aggregates. This profitable protocol can be used in cancer cell lines but also in primary tumors. The tridimensional non-adherent suspension culture thought to mimic the tumor microenvironment, particularly the CSC-niche, is supplemented with epidermal growth factor and basic fibroblast growth factor to ensure CSC signaling. Aiming for robust identification of CSC, we propose a complementary approach, combining functional and phenotypic evaluation. Sphere-forming capacity, self-renewal and sphere projection area establish CSC functional properties. Additionally, characterization comprises flow cytometry evaluation of the markers, represented by CD44+/CD24- and CD133, and Western blot, considering ALDH. The presented protocol was also optimized for primary tumor samples, following a sample digestion procedure, useful for translational research.

The aim of this methodology is to identify cancer stem cells (CSC) in cancer cell lines and primary human tumor samples with the sphere-forming protocol, in a robust manner, using functional assays and phenotypic characterization with flow cytometry and Western blot.

Ottenere le sfere delle cellule staminali tumorali da tumori ginecologici e tumori del cancro

Cancer stem cells (CSC) are a small population with self-renewal and plasticity which are responsible for tumorigenesis, resistance to treatment and ...

Studying Triple Negative Breast Cancer Using Orthotopic Breast Cancer Model

Triple-negative breast cancer (TNBC) is an aggressive breast cancer subtype with limited therapeutic options. When compared to patients with less aggressive breast tumors, the 5-year survival rate of TNBC patients is 77% due to their characteristic drug-resistant phenotype and metastatic burden. Toward this end, murine models have been established aimed at identifying novel therapeutic strategies limiting TNBC tumor growth and metastatic spread. This work describes a practical guide for the TNBC orthotopic model where MDA-MB-231 breast cancer cells suspended in a basement membrane matrix are implanted in the fourth mammary fat pad, which closely mimics the cancer cell behavior in humans. Measurement of tumors by caliper, lung metastasis assessment via in vivo and ex vivo imaging, and molecular detection are discussed. This model provides an excellent platform to study therapeutic efficacy and is especially suitable for the study of the interaction between the primary tumor and distal metastatic sites.

This work presets an advanced protocol to accurately assess tumor loading by detection of green fluorescent protein and bioluminescence signals as well as the integration of quantitative molecular detection technique.

Studiare il cancro al seno triplo negativo utilizzando il modello di cancro al seno ortotopico

Triple-negative breast cancer (TNBC) is an aggressive breast cancer subtype with limited therapeutic options. When compared to patients with less ...

Generation of Orthotopic Pancreatic Tumors and Ex vivo Characterization of Tumor-Infiltrating T Cell Cytotoxicity

In vivo models of pancreatic cancer provide invaluable tools for studying disease dynamics, immune infiltration and new therapeutic strategies. The orthotopic murine model can be performed on large cohorts of immunocompetent mice simultaneously, is relatively inexpensive and preserves the cognate tissue microenvironment. The quantification of T cell infiltration and cytotoxic activity within orthotopic tumors provides a useful indicator of an antitumoral response.
This protocol describes the methodology for surgical generation of orthotopic pancreatic tumors by injection of a low number of syngeneic tumor cells resuspended in 5 &#181;L basement membrane directly into the pancreas. Mice bearing orthotopic tumors take approximately 30 days to reach endpoint, at which point tumors can be harvested and processed for characterization of tumor-infiltrating T cell activity. Rapid enzymatic digestion using collagenase and DNase allows a single-cell suspension to be extracted from tumors. The viability and cell surface markers of immune cells extracted from the tumor are preserved; therefore, it is appropriate for multiple downstream applications, including flow-assisted cell sorting of immune cells for culture or RNA extraction, flow cytometry analysis of immune cell populations. Here, we describe the ex vivo stimulation of T cell populations for intracellular cytokine quantification (IFN&#947; and TNF&#945;) and degranulation activity (CD107a) as a measure of overall cytotoxicity. Whole-tumor digests were stimulated with phorbol myristate acetate and ionomycin for 5 h, in the presence of anti-CD107a antibody in order to upregulate cytokine production and degranulation. The addition of brefeldin A and monensin for the final 4 h was performed to block extracellular transport and maximize cytokine detection. Extra- and intra-cellular staining of cells was then performed for flow cytometry analysis, where the proportion of IFN&#947;+, TNF&#945;+ and CD107a+ CD4+ and CD8+ T cells was quantified.
This method provides a starting base to perform comprehensive analysis of the tumor microenvironment.

Generation of Orthotopic Pancreatic Tumors and Ex vivo Characterization of Tumor-Infiltrating T Cell Cytotoxicity

This protocol describes the surgical generation of orthotopic pancreatic tumors and the rapid digestion of freshly isolated murine pancreatic tumors. Following digestion, viable immune cell populations can be used for further downstream analysis, including ex vivo stimulation of T cells for intracellular cytokine detection by flow cytometry.

Generazione di tumori pancreatici ortotopici e caratterizzazione ex vivo della citotossicità delle cellule T infiltranti di tumore

In vivo models of pancreatic cancer provide invaluable tools for studying disease dynamics, immune infiltration and new therapeutic strategies. The ...

Modeling Breast Cancer in Human Breast Tissue using a Microphysiological System

Breast cancer (BC) remains a leading cause of death for women. Despite more than $700 million invested in BC research annually, 97% of candidate BC drugs fail clinical trials. Therefore, new models are needed to improve our understanding of the disease. The NIH Microphysiological Systems (MPS) program was developed to improve the clinical translation of basic science discoveries and promising new therapeutic strategies. Here we present a method for generating MPS for breast cancers (BC-MPS). This model adapts a previously described approach of culturing primary human white adipose tissue (WAT) by sandwiching WAT between adipose-derived stem cell sheets (ASC)s. Novel aspects of our BC-MPS include seeding BC cells into non-diseased human breast tissue (HBT) containing native extracellular matrix, mature adipocytes, resident fibroblasts, and immune cells; and sandwiching the BC-HBT admixture between HBT-derived ASC sheets. The resulting BC-MPS is stable in culture ex vivo for at least 14 days. This model system contains multiple elements of the microenvironment that influence BC including adipocytes, stromal cells, immune cells, and the extracellular matrix. Thus BC-MPS can be used to study the interactions between BC and its microenvironment. 
We demonstrate the advantages of our BC-MPS by studying two BC behaviors known to influence cancer progression and metastasis: 1) BC motility and 2) BC-HBT metabolic crosstalk. While BC motility has previously been demonstrated using intravital imaging, BC-MPS allows for high-resolution time-lapse imaging using fluorescence microscopy over several days. Furthermore, while metabolic crosstalk was previously demonstrated using BC cells and murine pre-adipocytes differentiated into immature adipocytes, our BC-MPS model is the first system to demonstrate this crosstalk between primary human mammary adipocytes and BC cells in vitro.

This protocol describes the construction of an in vitro microphysiological system for studying breast cancer using primary human breast tissue with off the shelf materials.

Modellazione del cancro al seno nel tessuto mammario umano utilizzando un sistema microfisiologico

Breast cancer (BC) remains a leading cause of death for women. Despite more than $700 million invested in BC research annually, 97% of candidate BC drugs ...

Modeling Brain Metastasis Via Tail-Vein Injection of Inflammatory Breast Cancer Cells

Metastatic spread to the brain is a common and devastating manifestation of many types of cancer. In the United States alone, about 200,000 patients are diagnosed with brain metastases each year. Significant progress has been made in improving survival outcomes for patients with primary breast cancer and systemic malignancies; however, the dismal prognosis for patients with clinical brain metastases highlights the urgent need to develop novel therapeutic agents and strategies against this deadly disease. The lack of suitable experimental models has been one of the major hurdles impeding advancement of our understanding of brain metastasis biology and treatment. Herein, we describe a xenograft mouse model of brain metastasis generated via tail-vein injection of an endogenously HER2-amplified cell line derived from inflammatory breast cancer (IBC), a rare and aggressive form of breast cancer. Cells were labeled with firefly luciferase and green fluorescence protein to monitor brain metastasis, and quantified metastatic burden by bioluminescence imaging, fluorescent stereomicroscopy, and histologic evaluation. Mice robustly and consistently develop brain metastases, allowing investigation of key mediators in the metastatic process and the development of preclinical testing of new treatment strategies.

We describe a xenograft mouse model of breast cancer brain metastasis generated via tail-vein injection of an endogenously HER2-amplified inflammatory breast cancer cell line.

Modellazione delle metastasi cerebrali tramite iniezione di vena della coda di cellule infiammatorie del cancro al seno

Metastatic spread to the brain is a common and devastating manifestation of many types of cancer. In the United States alone, about 200,000 patients are ...