Name: orthotopic transplantation of breast tumors as preclinical models for breast cancer
Uploaded: 2020-05-18T14:45:00.000+00:00
Duration: 7 min 45 s
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この研究は、国立衛生研究所(R37CA228304とR01HL146642からXi Chen、CA148761からジェフリーM)によってサポートされました。 ローゼン、米国国防総省(W81XWH-19-1-0524から西陳へ、W81XWH-19-1-0035からXiangdong Lv)、アメリカ癌学会(RSG-18-181-01-TBEからXi Chen)、癌予防研究所(RR150009 CPRIT研究学者)、チ・シー賞を受賞 ベイラー医科大学の患者由来ゼノグラフトおよびアドバンストインビボモデルコア(RP170691 CPRITコア施設賞とNCI-CA125123 P30がんセンターサポートグラントからの資金提供)。

動物を使用するすべてのプロトコルは、制度的動物管理使用委員会(IACUC)によって審査され、承認されています。腫瘍断片は、約1〜2mm3の大きさで、ベイラー医科大学の患者由来ゼノグラフトおよびアドバンスト・イン・ビボ・モデルズ・コアから得られた凍結ストックから得られた。
1. 凍結保存乳腺腫瘍の移植のための調製
<ol><li>液体窒素から37°Cの水浴に腫瘍断片を含むcryovialを移します。</li>
	<li>解凍中に時折穏やかなフリックでクライボシャルを攪拌します。</li>
	<li>ティッシュが解凍されたら、水浴から凍結を取り出し、穏やかな反転によって混ぜます。</li>
	<li>除く除物の外側を乾燥させ、70%エタノールでスプレーします。バイオセーフティフードに移します。</li>
	<li>解凍した腫瘍組織を、10 mLの冷たいダルベッコの修飾イーグル培地(DMEM)で満たされた15 mLの円錐形の管に移す。チューブを反転させることでよく混ぜます。組織断片をチューブの底に落ち着かせる。</li>
	<li>上清を吸引し、冷たいDMEMの10 mLで再懸濁します。チューブを反転させることでよく混ぜます。組織断片をチューブの底に落ち着かせる。</li>
	<li>上清を吸引し、冷たいDMEMの10 mLで再懸濁します。チューブを氷の上に置きます。 注:組織は移植の準備ができています。</li>
</ol>2. 移植のための新鮮な乳腺腫瘍の採取と調製
<ol><li>乳房腫瘍を持つマウスを安楽死させる。 注:PDXホストは、現在の研究では3〜5週齢の雌Balb/cマウスが使用されている間、SCID /ベージュ、NSGまたはNRG雌マウスであってもよい。</li>
	<li>安楽死させたマウスの腫瘍領域を70%エタノールでスプレーする。 注意:凍結保存や移植のために腫瘍断片の汚染を引き起こす可能性のある腫瘍サンプルで毛髪を避けるようにしてください。</li>
	<li>鋸歯状鉗子を使って腫瘍を取り巻く皮膚をつまんで持ち上げ、はさみを使って短い切開を行う。</li>
	<li>はさみで皮膚から腫瘍を分離し、宿主マウスから腫瘍全体を解剖する。腫瘍の外面から残っているマウス脂肪パッド組織を切り取る。5 mLの冷たいDMEMで満たされた15 mL円錐状のチューブに腫瘍を入れる。 注:大きな腫瘍は壊死性のコアを含む可能性が高いので、直径1cmの最大サイズで腫瘍を使用してください。</li>
	<li>バイオセーフティフードでは、乾燥を防ぐために十分なDMEMを含む滅菌10cmペトリ皿に解剖された腫瘍を移す。</li>
	<li>無菌状態でメスまたはブレードで1mm3 断片に腫瘍を切断します。 注:メスやブレードは、使用前に少なくとも20分間、バイオセーフティフードのUVの下で露出する必要があります。</li>
	<li>腫瘍断片を、冷たいDMEMで満たされた15 mL円錐状のチューブに移す。チューブを氷の上に置きます。 注:組織は移植の準備ができています。ステップ2.4から解剖された腫瘍断片を、 1)タンパク質およびRNA/DNA抽出のために液体窒素中で凍結し、2)4%パラホルムアルデヒド(PFA)または10%中性緩衝ホルマリン(NBF)で固定ヘマトキシおよびエオシン(H&E)および免疫組織化学(IHC)分析、または3)凍結保存中1.25 mL凍結培地(10%ジメチルスルホキシドキシド)[DMSO、2] 40%DMEMおよび50%のウシ血清[FBS])は、一晩で-80°Cの冷凍庫で凍結を遅くし、その後、長期保存のために液体窒素に移すことによって。</li>
</ol>3. 手術のための動物を準備します。
<ol><li>動物の痛みの管理のために, 皮下にブプレノルフィン持続放出 60 1 mg/kg の用量で手術の前に、または鎮痛のカバレッジの 72 時間のための機関のガイドに従ってください。.</li>
	<li>無菌手術のための制度的ガイドラインに従って外科スイートを設定します。</li>
	<li>イゾフルラン麻酔装置の誘導室で4週齢の女性を約11.25 mL/hの割合で麻酔します。マウスを手順領域に移し、滅菌(シリコーンゴム)手術板に移し、そこで小さなフェイスマスクを通して麻酔を受けます。背中にマウスを置き、自然な位置に足をテープダウンします。 注意: SCID/ベージュ、NSGまたはNRGはPDXに使用され、BALB / cはGEMM移植モデルに使用されます。</li>
	<li>目の乾燥を防ぐために眼科軟膏を適用します。</li>
	<li>つまみつまみによって適切なレベルのセドを確認します。 注:動物の応答/動きは、動物が十分に麻酔され、手術の準備ができていることを示しています。</li>
	<li>下腹部、特に手術が行われる4番目の乳首の周りの領域にマウスを剃ります。</li>
	<li>円形運動を使用し、手術部位の中心から始めて、ポビドネヨウ素外科スクラブで外縁に向かって作業し、続いて70%イソプロピルエタノールパッドを使用してポビドネヨウ素を除去する。さらに 2 回繰り返します。</li>
</ol>4. 腫瘍断片の第4(インジュネータル)乳腺脂肪パッドへの移植
<ol><li>切開部位を除く動物の体を覆うために無菌外科用ドレープを使用してください。 注:切開を行う前につまみつまみによって適切なレベルの沈下を確認してください。</li>
	<li>鋸歯状鉗子を使用してピンチし、#4乳首で皮膚を持ち上げます。</li>
	<li>鈍い側面を下にして、頭に向かって#4乳首から短い(約1cm)、パラサジタル切開を作るためにはさみを使用してください。</li>
	<li>綿の先端のアプリケーターを使用して、切開の内側側の腹側から皮膚を分離する。</li>
	<li>切開の側側を保持しながら、同じ綿棒を使用して皮膚から#4乳脂肪パッドを静かに剥がします。</li>
	<li>脂肪パッドが分離されたら、動物の体の近くに27 Gの針で皮膚をピン留めします。</li>
	<li>内在性マウス乳腺上皮の脂肪パッドをクリアすることが実験的に必要である場合は、以下の手順を行う。<ol>
<li>鋸歯状鉗子を使用して、脂肪パッドを身体から離して静かに伸ばし、腺の主要血管の交点の下にあるインギナルリンパ節を見つける(鉗子が腺を保持する場所の近く)。</li>
		<li>慎重にリンパ節に血管を媒介し、脂肪は三角形の領域を形成する第4および第5の脂肪パッドを結合する。 メモ:このステップでは、酸素源を一時的にオフにします。</li>
		<li>マイクロ解剖ハサミを使用して、リンパ節を含む脂肪パッドのセクションが取り除かれるまで、各焼灼された容器を一度に1つずつ切断する(各切り取り後に出血がないことを確認する)。</li>
		<li>「クリアされた」脂肪パッド組織を捨てます。</li>
	</ol></li>
	<li>鈍い分離鉗子を使用して、第4の乳腺脂肪パッドを保持します。一方、角度を付けた細い鉗子の閉じた先端を残りの容器の上の脂肪パッドの中央に挿入し、腹壁に近い。ゆっくりと小さなポケットを作るために鉗子を開きます。脂肪パッドから斜めの細かい鉗子を取り除きます。</li>
	<li>角度付きの細い鉗子を使用して、腫瘍の断片を取り、ポケットに挿入します。</li>
	<li>ゆっくりと鉗子の先端を開き、脂肪パッドポケットに腫瘍片を放出する。</li>
	<li>角度を付けた細かい鉗子を慎重に引き出します。 メモ:ポケットを見て、鉗子を引き出すときに腫瘍片が乳腺脂肪パッドのポケットに残っていることを確認します。実験や銀行業務に過剰な腫瘍組織が必要な場合、腫瘍は両方の対側脂肪パッドに移植され得る。両側移植を行った動物は、対側腫瘍間の相互作用が知られているため、治療研究には推奨されません。あるいは、トロカール装置が移植プロセスに使用される場合があります。</li>
	<li>切開部の基部から始めて、爪と鋸歯状鉗子を用いて両側の皮膚を採取する。両側を一緒に持ち上げ、わずかに持ち上げて、創傷クリップの塗布のために皮膚を準備します。爪の鉗子で切開のエッジをアンカールし、上部に連続した表面を形成するためにエッジを一緒につまみます。</li>
	<li>鋸歯状鉗子と一緒に両側を保持し、切開部の中央に創傷クリップを配置するために創傷クリップアプリケーターを使用します。必要に応じて、切開の端部に組織接着剤を塗布し、密閉して固定します。</li>
	<li>動物を、暖かい表面にあるきれいなケージに入れます。術後の期間に出血、脱ヒスジェンスの徴候、および痛みを監視します。動物は手術後数分以内に立ち上がって動いているはずです。</li>
	<li>手術後少なくとも3日間は、切開部位と動物の全体的な健康状態に細心の注意を払ってください。疼痛管理のための制度ガイドラインに従ってください。</li>
	<li>次の移植を続行する前に、ガラスビーズの滅菌器で10 sの外科用具を洗浄してください。使用する前に、ツールが冷却されるまで待ちます。</li>
	<li>すべてのマウスが移植されるまで、ステップ 4.1~4.15 を繰り返します。 注:エストロゲン補充は、水または遅い放出ペレット59を介して供給することができるER+腫瘍のために必要とされます。</li>
</ol>5. 薬物治療に応答した腫瘍の成長をモニタリングする
注:確立された移植可能なPDXおよびp53-ヌル腫瘍の可知性腫瘍は、内在性腫瘍増殖率に応じて、手術後に発症するのに2週間から8週間かかる。
<ol><li>週2回、カリパーを用いて2次元で腫瘍を測定する。次の式を使用して、体積を計算します。 腫瘍容積(mm3)=W2 x L/2 ここでWは幅、Lは腫瘍の長さである。</li>
	<li>腫瘍容積が150-300 mm3に達すると、薬物治療を開始する。 注:薬物の性質に応じて、経口ギャビンまたは腹腔内注射を使用して薬物を送達してもよい。</li>
	<li>腫瘍サンプルを収集し、IHC染色60、タンパク質およびRNA/DNA単離および免疫フェノタイピング61 を様々な目的のために行う。血液を収集し、免疫のフェノタイピングを実行したり、薬物動態/薬力学研究のためにそれを使用します。.</li>
</ol>

MTLは、StemMed株式会社の限定パートナーの創設者であり、ゼネラルパートナーであるStemMedホールディングスの創設者兼マネージャーです。MTLは、トバルディ・セラピューティクス社の創設者であり、株式会社ステムメドの補償を受けた従業員です。

動物間の腫瘍増殖の変動を減らすためには、移植のために腫瘍組織を1mm3 断片に切断することが重要である。軟組織を成長させるモデルは作業が難しく、腫瘍断片を少し大きく切る必要がある(1-2 mm3)。乳脂肪パッドポケットに組織を配置する場合は、これは複数の小さな腫瘍または奇妙な形の腫瘍をもたらすので、複数の部分に組織を分割しないように注意してください。
また、薬物治療研究に使用される動物の移植には新鮮な腫瘍を使用してください。凍結保存から組織を移植すると、より可変的なテイク速度とわずかに遅い成長運動が生じる。凍結保存物質から腫瘍が成長すると、第2の移植生成物は、そのモデルの典型的なテイク速度と成長速度を生み出す。また、移植のために、無い、または軽度の壊死を伴う腫瘍を使用するようにしてください。ほとんどのモデルでは、これは400-600 mm3のサイズ範囲になります。明らかな壊死性コアが観察された場合、移植のために腫瘍の外層からの組織を使用し、壊死領域を使用しない。腫瘍組織を氷の上に置いて、乾燥から保護することが重要です。
異なる微小環境を有する周辺または腫瘍コアに由来した可能性のあるGEMMからの腫瘍塊の変動を減らすために、代替方法は、腫瘍モデルに応じて約5,000〜30,000個の細胞を乳腺脂肪パッドに移植する一次細胞懸濁液を調製することである。限定コラゲレーターーゼの消化は、DMEM/F12で1mg/mL型I型コラゲターゼを用いて行い、37°Cで2時間の添加剤を125rpmで回転させます。乳腺腫瘍細胞は、3つの短い遠心分離工程によって濃縮することができる。簡単に言えば、細胞懸濁液を15mLの円錐形チューブに移し、遠心分離機を450 x g で7sに移します。上清を吸引し、1xダルベッコのリン酸緩衝生理食塩基(DPBS)の10mLでペレットを再懸濁する。パルス遠心分離をさらに2回繰り返します。これは、チャンク間の違いをランダム化するのに役立ちます。
正常な乳腺上皮の移植は、内在性マウス上皮の存在下で形態学的に正常かつ機能的な管状の木を再生しない。正常上皮移植が62を成長させるためには、内因性マウス上皮(クリアリング)を除去する必要がある。しかし、腫瘍性組織は、無傷の内在性マウス上皮の存在下でも成長することができる。しかし、これは必ずしもそのような抑制シグナルが存在しないことを意味するものではありません。乳腺脂肪パッドの除去は、内因性マウス乳腺上皮と生着物質との相互作用を禁止する特定の実験的プロトコルに必要である。さらに、内在性上皮は、ゲノム、トランスクリプトーム、プロテオーム解析などの下流解析を複雑にする可能性があります。
PDXモデルおよび移植可能なGEMMは臨床サブタイプの異質性およびヒト乳癌の薬物療法への応答を忠実に再現できる。重要なことに、これらのモデルは、限られた数のシリアル通過中に安定した表現型を移植し、維持することが容易である。腫瘍の成長は、キャリパーで容易に測定することができる。PDXモデルと移植可能なGEMMの1つの注意点は、これらのモデルが腫瘍開始の初期段階を再現しないことである。また、PDXモデルは、機能的免疫系との腫瘍の相互作用を欠いている。これらの前臨床モデルは、乳がん生物学を研究し、薬物反応を評価するための貴重なシステムを提供します。各腫瘍モデルのゲノムおよびプロテオミクス情報と薬物応答を組み合わせることで、応答予測および治療抵抗機構のためのバイオマーカーの同定が容易になる。これらのタイプのデータは、患者の転帰を改善するために化学療法または免疫療法と組み合わせて単独で使用できる新しい標的療法につながる可能性があります。

乳癌による死亡の大部分は、従来の治療法1,2に耐性のある再発性疾患に起因する可能性がある。乳癌の腫瘍間および腫瘍内不均一性は、治療抵抗に寄与する。さらに、腫瘍の不均一性は、正確な予後に影響を及ぼし、疾患管理に挑戦する3、4.応答の予測バイオマーカーの同定は、乳癌患者の臨床転帰を有意に改善する。ほとんどの乳癌タイプは免疫療法に反応しない可能性が高い免疫学的に「冷たい」腫瘍であるにもかかわらず、免疫チェックポイント阻害剤は臨床試験2,5で約束を示している。例えば、第III相試験は、アテゾリズマブ(PD-L1に対するモノクローナル抗体)とナブパクリタキセルを組み合わせた予備的証拠を示し、≥1%PD-L1染色6を有する腫瘍におけるナブ・パクリタキセル単独と比較して全体的な生存利益を提供し得る。乳房腫瘍を免疫療法に感作する治療法の開発は、治療レジメンに革命をもたらす。
ヒト乳癌の不均一性と薬物反応を忠実に再現する前臨床モデルは、腫瘍生物学を研究し、標的治療の潜在的なバイオマーカーを同定するために重要である。不死化細胞株は、これらの細胞株が成長しやすく、分子機構を研究するために遺伝的に改変することが容易であるため、乳癌研究に広く使用されています。しかし、インビトロでの長期細胞培養からの選択的な圧力のために、遺伝的ドリフトが経つにつれて起こり、乳癌細胞株は原発性乳房腫瘍7、8、9における収差とは異なる細胞株特異的ゲノム変化を運ぶ可能性がある。
患者由来異種移植片(PDX)腫瘍塊は、ヒト疾患の異質性を再現することができ、起源の腫瘍10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22に組織学的および免疫組織学的に類似している 、23,24,25,26,27,28,29.重要なことに、PDXモデルは、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22によって証明されるように、複数の移植にわたって典型的に安定である、23,24,25,26,27,28,29.PDXモデルは、臨床的に観察されたものに匹敵する治療応答を示す10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24, 25、26、27 、28、29。エストロゲン受容体陽性(ER+)、プロゲステロン受容体陽性(PR+)、上皮成長因子2陽性(ERBB2+、HER2+)およびトリプルネガティブ乳癌(TNBC)PDXモデルが確立されており、内分泌、化学、標的療法を試験するための優れたプラットフォームを提供する。しかし、現在のPDXモデルの主な注意点の1つは、マウスの機能的免疫系の欠如である。
Trp53ホモ接合性ヌル、cMyc、Wnt1、PyMT、またはHer2過剰発現モデルなどの遺伝子組み換えマウスモデル(GEMM)は、無傷の免疫系の文脈における自発的な腫瘍開始、進行および転移の研究を可能にする。しかし、腫瘍の遅延は長く、複数の腕30、31で前臨床試験を行うことは困難です。しかし、GEMMをシンジニック宿主体に移植して、ヒト腫瘍32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、42、44、45を密接に再現する腫瘍を十分な数の腫瘍を生成することができる。 46,47,48,49,50,51,52 ,53,54,55.例えば、p53-null BALB/cマウスからの乳腺上皮を、同種性野生型レシピエントマウスのクリアされた脂肪パッドに移植して原発性腫瘍を形成し、これはさらに同系宿主56,57に移植することができる。p53-ヌル腫瘍は、ヒト腫瘍の異なるサブタイプを再現した。
PDXモデルと移植可能なGEMMの組み合わせは、乳房腫瘍生物学、薬物応答および抗腫瘍免疫を調査するための貴重な前臨床ツールを提供する。現在のプロトコルでは、マウス乳腺脂肪パッドへのPDXおよびGEMM腫瘍断片の異所移植の方法が記載されている。これらのモデルは、シリアル通路に適しており、通常は安定した表現型を保持します。経時経過を越えて遺伝的ドリフトまたは異種性の喪失のリスクを軽減するために、生物学的または形態学的変化が経時29、58に観察される場合には、その後の移植のために、複数の組織断片が各通路で凍結保存される。

<table><tbody><tr><td>1 mg/mL Buprenorphine-SR</td><td>ZooPharm (via BCM veterinarians)</td><td></td><td>Sterile</td></tr><tr><td>26G syringe</td><td>BD</td><td>148232E</td><td>Sterile</td></tr><tr><td>Betadine Scrub</td><td>Fisher</td><td>19-027132</td><td></td></tr><tr><td>Cotton Swabs</td><td>VWR International Laboratory</td><td>89031-272</td><td>Sterile</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Fisher</td><td>MT 10-013-CM</td><td>Sterile</td></tr><tr><td>Electric shaver</td><td>Oster</td><td>78005-050</td><td></td></tr><tr><td>Glass beads sterilizer (Germinator)</td><td>Roboz Surgical Store</td><td>DS-401</td><td></td></tr><tr><td>Lubricant ophthalmic ointment</td><td>Akorn Animal Health</td><td>17478-062-35</td><td></td></tr><tr><td>Micro Dissecting Forceps; Serrated, Angular (regular forceps)</td><td>Roboz Surgical Store</td><td>RS-5139</td><td>Sterile</td></tr><tr><td>Micro Dissecting Spring Scissors (fat pad cutter)</td><td>Roboz Surgical Store</td><td>RS-5658BT</td><td>Sterile</td></tr><tr><td>Micro Forceps (tissue placing forceps)</td><td>Roboz Surgical Store</td><td>RS-5069</td><td>Sterile</td></tr><tr><td>Petri Dish</td><td>Fisher</td><td>08-757- 100D</td><td>Sterile</td></tr><tr><td>Sterile drape</td><td>Sai Infusion Technology</td><td>PSS-SD1</td><td>Sterile</td></tr><tr><td>Surgery scissors</td><td>Roboz Surgical Store</td><td>RS-5960</td><td>Sterile</td></tr><tr><td>Tissue Forceps (claw forceps)</td><td>Roboz Surgical Store</td><td>RS-5158</td><td>Sterile</td></tr><tr><td>Wound clip applier</td><td>BD Autoclip Wound System</td><td>01-804</td><td>Sterile</td></tr><tr><td>Wound clip remover</td><td>BD Autoclip Wound System</td><td>01-804-15</td><td>Sterile</td></tr><tr><td>Wound clips</td><td>BD Autoclip Wound System</td><td>01-804-5</td><td>Sterile</td></tr></tbody></table>

orthotopic transplantation of breast tumors as preclinical models for breast cancer

腫瘍の不均一性と治療応答を忠実に再現する前臨床モデルは、トランスレーショナル乳癌研究にとって重要です。不死化細胞株は、分子機構を研究するために成長し、遺伝的に改変しやすいが、細胞培養からの選択的圧力はしばしば時間の経過とともに遺伝的およびエピジェネティックな変化をもたらす。患者由来の異種移植片(PDX)モデルは、ヒト乳房腫瘍の異質性および薬物反応を忠実に再現する。PDXモデルは、乳房腫瘍生物学および薬物応答の調査を容易にする整形移植後の比較的短い待ち時間を示す。移植可能な遺伝子操作されたマウスモデルは、乳房腫瘍免疫の研究を可能にする。現在のプロトコルは、乳房腫瘍断片を乳腺脂肪パッドに整所的に移植し、続いて薬物治療を行う方法を説明している。これらの前臨床モデルは、乳房腫瘍生物学、薬物反応、バイオマーカー発見および薬剤耐性のメカニズムを調査するための貴重なアプローチを提供する。

図1 は、装具(図1A)と、交位移植の主要な手順(図1B)を示しています。 図2 は、移植PDX腫瘍(MC1)の特徴を示す。MC1モデルの腫瘍断片(1mm3)をSCID/ベージュマウスの#4脂肪パッドに移植した。1か月後、平均腫瘍サイズは約350mm3に達した。腫瘍容積は週2回1ヶ月間監視した。通常、移植された1mm3 の腫瘍断片を用いて、約2週間~8週間で様々なPDXまたはGEMMの触知可能な腫瘍を得る(図2A)。腫瘍サンプルは、形態とシグナル伝達解析のために収集することができます(図2B-D)。H&E染色を行い、病理を解析した(図2B)。IHCは、特定の細胞系(ケラチン19(K19)、上皮細胞、 図2C)、細胞状態(Ki67、増殖、 図2D)または関心のあるシグナル伝達分子のマーカーを監視するために使用された。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61173/61173fig1.jpg"> 図1:手術技術を示す図。(A)整形移植に必要な外科装置。(B)腫瘍幹移植のための乳腺脂肪パッドの暴露を示す代表的な画像。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61173/61173fig1large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61173/61173fig2.jpg"> 図2:移植された腫瘍の特徴付け(A) キャリパーで測定した腫瘍増殖の代表的な動態。腫瘍体積(mm3)=W2 x L/2(W =幅およびL=長さ)。(B) MC1 PDXの病理を示すH&E染色。IHCは、MC1 PDXにおいて上皮マーカーケラチン19(C)および増殖メーカーKi67(D)を示す。スケールバー=20μm、倍率=40倍。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61173/61173fig2large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>

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Orthotopic Transplantation of Breast Tumors as Preclinical Models for Breast Cancer

患者由来異種移植片(PDX)モデルおよび移植可能な遺伝子組み換えマウスモデルは、ヒト疾患を忠実に再現し、基礎的および翻訳的な乳癌研究のための好ましいモデルである。ここで、乳房腫瘍断片を乳腺脂肪パッドに整形移植して腫瘍生物学を研究し、薬物反応を評価する方法について説明する。

乳癌の前臨床モデルとしての乳房腫瘍の移植性

Preclinical models that faithfully recapitulate tumor heterogeneity and therapeutic response are critical for translational breast cancer research. ...

orthotopic-transplantation-breast-tumors-as-preclinical-models-for

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Cancer Research

5.9K ビュー.  Baylor College of Medicine. 患者由来異種移植片(PDX)モデルおよび移植可能な遺伝子組み換えマウスモデルは、ヒト疾患を忠実に再現し、基礎的および翻訳的な乳癌研究のための好ましいモデルである。ここで、乳房腫瘍断片を乳腺脂肪パッドに整形移植して腫瘍生物学を研究し、薬物反応を評価する方法について説明する。

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A Portal Vein Injection Model to Study Liver Metastasis of Breast Cancer

Breast cancer is the leading cause of cancer-related mortality in women worldwide. Liver metastasis is involved in upwards of 30% of cases with breast cancer metastasis, and results in poor outcomes with median survival rates of only 4.8 - 15 months. Current rodent models of breast cancer metastasis, including primary tumor cell xenograft and spontaneous tumor models, rarely metastasize to the liver. Intracardiac and intrasplenic injection models do result in liver metastases, however these models can be confounded by concomitant secondary-site metastasis, or by compromised immunity due to removal of the spleen to avoid tumor growth at the injection site. To address the need for improved liver metastasis models, a murine portal vein injection method that delivers tumor cells firstly and directly to the liver was developed. This model delivers tumor cells to the liver without complications of concurrent metastases in other organs or removal of the spleen. The optimized portal vein protocol employs small injection volumes of 5 - 10 &#956;l, &#8805; 32 gauge needles, and hemostatic gauze at the injection site to control for blood loss. The portal vein injection approach in Balb/c female mice using three syngeneic mammary tumor lines of varying metastatic potential was tested; high-metastatic 4T1 cells, moderate-metastatic D2A1 cells, and low-metastatic D2.OR cells. Concentrations of &#8804; 10,000 cells/injection results in a latency of ~ 20 - 40 days for development of liver metastases with the higher metastatic 4T1 and D2A1 lines, and &#62; 55 days for the less aggressive D2.OR line. This model represents an important tool to study breast cancer metastasis to the liver, and may be applicable to other cancers that frequently metastasize to the liver including colorectal and pancreatic adenocarcinomas.

A surgical procedure was developed to deliver mammary tumor cells to the murine liver via portal vein injection. This model permits investigation of late stages of liver metastasis in a fully immune competent host, including tumor cell extravasation, seeding, survival, and metastatic outgrowth in the liver.

乳癌の肝転移を研究するためのポータル静脈注射モデル

Breast cancer is the leading cause of cancer-related mortality in women worldwide. Liver metastasis is involved in upwards of 30% of cases with breast ...

がん研究

Orthotopic Injection of Breast Cancer Cells into the Mice Mammary Fat Pad

A proper animal model is crucial for a better understanding of diseases. Animal models established by different methods (subcutaneous injections, xenografts, genetic manipulation, chemical reagents induction, etc.) have various pathological characters and play important roles in investigating certain aspects of diseases. Although no single model can totally mimic the whole human disease progression, orthotopic organs disease models with a proper stromal environment play an irreplaceable role in understanding diseases and screening for potential drugs. In this article, we describe how to implant breast cancer cells into the mammary fat pad in a simple, less invasive, and easy-to-handle way, and follow the metastasis to distant organs. With the proper features of primary tumor growth, breast and nipple pathological changes, and a high occurrence of other organs&#39; metastasis, this model maximumly mimics human breast cancer progression. Primary tumor growth in situ, long-distant metastasis, and the tumor microenvironment of breast cancer can be investigated by using this model.

Here, we present a protocol to implant breast cancer cells into the mammary fat pad in a simple, less invasive, and easy-to-handle way, and this mouse orthotopic breast cancer model with a proper mammary fat pad environment can be used to investigate various aspects of cancer.

マウス乳腺の脂肪パッドに乳癌細胞の同所性同種注入

A proper animal model is crucial for a better understanding of diseases. Animal models established by different methods (subcutaneous injections, ...

Studying Triple Negative Breast Cancer Using Orthotopic Breast Cancer Model

Triple-negative breast cancer (TNBC) is an aggressive breast cancer subtype with limited therapeutic options. When compared to patients with less aggressive breast tumors, the 5-year survival rate of TNBC patients is 77% due to their characteristic drug-resistant phenotype and metastatic burden. Toward this end, murine models have been established aimed at identifying novel therapeutic strategies limiting TNBC tumor growth and metastatic spread. This work describes a practical guide for the TNBC orthotopic model where MDA-MB-231 breast cancer cells suspended in a basement membrane matrix are implanted in the fourth mammary fat pad, which closely mimics the cancer cell behavior in humans. Measurement of tumors by caliper, lung metastasis assessment via in vivo and ex vivo imaging, and molecular detection are discussed. This model provides an excellent platform to study therapeutic efficacy and is especially suitable for the study of the interaction between the primary tumor and distal metastatic sites.

This work presets an advanced protocol to accurately assess tumor loading by detection of green fluorescent protein and bioluminescence signals as well as the integration of quantitative molecular detection technique.

交感性乳癌モデルを用いたトリプルネガティブ乳癌の研究

Triple-negative breast cancer (TNBC) is an aggressive breast cancer subtype with limited therapeutic options. When compared to patients with less ...

Modeling Primary Bone Tumors and Bone Metastasis with Solid Tumor Graft Implantation into Bone

Primary bone tumors or bone metastasis from solid tumors result in painful osteolytic, osteoblastic, or mixed osteolytic/osteoblastic lesions. These lesions compromise bone structure, increase the risk of pathologic fracture, and leave patients with limited treatment options. Primary bone tumors metastasize to distant organs, with some types capable of spreading to other skeletal sites. However, recent evidence suggests that with many solid tumors, cancer cells that have spread to bone may be the primary source of cells that ultimately metastasize to other organ systems. Most syngeneic or xenograft mouse models of primary bone tumors involve intra-osseous (orthotopic) injection of tumor cell suspensions. Some animal models of skeletal metastasis from solid tumors also depend on direct bone injection, while others attempt to recapitulate additional steps of the bone metastatic cascade by injecting cells intravascularly or into the organ of the primary tumor. However, none of these models develop bone metastasis reliably or with an incidence of 100%. In addition, direct intra-osseous injection of tumor cells has been shown to be associated with potential tumor embolization of the lung. These embolic tumor cells engraft but do not recapitulate the metastatic cascade. We reported a mouse model of osteosarcoma in which fresh or cryopreserved tumor fragments (consisting of tumor cells plus stroma) are implanted directly into the proximal tibia using a minimally invasive surgical technique. These animals developed reproducible engraftment, growth, and, over time, osteolysis and lung metastasis. This technique has the versatility to be used to model solid tumor bone metastasis and can readily employ grafts consisting of one or multiple cell types, genetically-modified cells, patient-derived xenografts, and/or labeled cells that can be tracked by optical or advanced imaging. Here, we demonstrate this technique, modeling primary bone tumors and bone metastasis using solid tumor graft implantation into bone.

Bone metastasis models do not develop metastasis uniformly or with a 100% incidence. Direct intra-osseous tumor cell injection can result in embolization of the lung. We present our technique modeling primary bone tumors and bone metastasis using solid tumor graft implantation into bone, leading to reproducible engraftment and growth.

固形腫瘍移植による骨原発性骨腫瘍と骨転移のモデリング

Primary bone tumors or bone metastasis from solid tumors result in painful osteolytic, osteoblastic, or mixed osteolytic/osteoblastic lesions. These ...

In Vivo Imaging to Measure Spontaneous Lung Metastasis of Orthotopically-injected Breast Tumor Cells

Metastasis remains the primary cause of cancer-related death. The succession of events that characterize the metastatic cascade presents multiple opportunities for therapeutic intervention, and the ability to accurately model them in mice is critical to evaluate their effects. Here, a step-by-step protocol is presented for the establishment of orthotopic primary breast tumors and the subsequent monitoring of the establishment and growth of metastatic lesions in the lung using in vivo bioluminescence imaging. This methodology allows for the evaluation of treatment or its biological effects along the entire range of metastatic development, from primary tumor escape to outgrowth in the lungs. Breast orthotopic tumors are generated in mice via injection of a luciferase-labeled cell suspension in the 4th mammary gland. Tumors are allowed to grow and disseminate for a specific amount of time and are then surgically resected. Upon resection, spontaneous lung metastasis is detected, and the growth over time is monitored using in vivo bioluminescence imaging. At the desired experimental endpoint, lung tissue can be collected for downstream analysis. The treatment of established, clinically evident metastasis is critical to improve outcomes for stage IV cancer patients, and it can be evaluated through tail vein models of experimental lung metastasis. However, metastatic dissemination occurs early in breast cancer, and many patients have latent, subclinical disseminated disease after surgery. Utilization of spontaneous models such as this one provides the opportunity to study the whole spectrum of the disease, especially the systemic effects driven by treatment of the primary tumor such as pre-metastatic niche priming, and evaluate treatments on dormant and subclinical disease after surgery.

<meta charset="utf8"></head><body>同所性注射された乳房腫瘍細胞の自発的な肺転移を測定するためのin vivoイメージング

The manuscript describes a methodology for the establishment as well as longitudinal growth monitoring of spontaneous lung metastasis from orthotopically-injected breast tumors, amenable to intervention at all stages of the metastatic cascade.

インビボ 同所注射された乳房腫瘍細胞の自然肺転移を測定するためのイメージング

Metastasis remains the primary cause of cancer-related death. The succession of events that characterize the metastatic cascade presents multiple ...

Orthotopic Injection of Breast Cancer Cells into the Mammary Fat Pad of Mice to Study Tumor Growth.

Breast cancer growth can be studied in mice using a plethora of models. Genetic manipulation of breast cancer cells may provide insights into the functions of proteins involved in oncogenic progression or help to discover new tumor suppressors. In addition, injecting cancer cells into mice with different genotypes might provide a better understanding of the importance of the stromal compartment. Many models may be useful to investigate certain aspects of disease progression but do not recapitulate the entire cancerous process. In contrast, breast cancer cells engraftment to the mammary fat pad of mice better recapitulates the location of the disease and presence of the proper stromal compartment and therefore better mimics human cancerous disease. In this article, we describe how to implant breast cancer cells into mice orthotopically and explain how to collect tissues to analyse the tumor milieu and metastasis to distant organs. Using this model, many aspects (growth, angiogenesis, and metastasis) of cancer can be investigated simply by providing a proper environment for tumor cells to grow.

Cancer is a complex disease that is influenced by the tissue surrounding the tumor as well as local pro- and anti-inflammatory mediators. Therefore, orthotropic injection models, rather than subcutaneous models may be useful to study cancer progression in a manner that better mimics human pathology.

腫瘍増殖を研究するためにマウスの乳房脂肪パッド中に乳癌細胞の同所注入。

Breast cancer growth can be studied in mice using a plethora of models. Genetic manipulation of breast cancer cells may provide insights into the ...

医学

<meta charset="utf8"></head><body>乳がん患者由来異種移植片のハイスループット解離と同所性移植

High-Throughput Dissociation and Orthotopic Implantation of Breast Cancer Patient-Derived Xenografts

Patient-derived xenografts (PDXs) provide a clinically relevant method for recapitulating tumor-involved cell types and the tumor microenvironment, which is essential for advancing knowledge of breast cancer (BC). Additionally, PDX models enable the study of BC systemic effects, which is not possible using in vitro models. Traditional methods for implanting BC xenografts typically involve anesthesia and sterile surgical procedures, which are time-consuming, invasive, and limit the scalability of PDX models in BC research. This protocol describes a simple and scalable method for the orthotopic implantation of BC PDXs in mice. The immunodeficient mouse strain NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ (NSG) was used for PDX engraftment. Human BC samples obtained from IRB-consented patients were mechanically and enzymatically dissociated, then resuspended in a solution of basement membrane extract (BME) and RPMI 1640. Animals were restrained by scruffing, and depilatory cream was applied to remove hair from the fat pads at the fourth inguinal nipple, followed by injection. Approximately 2 million cells in a 100 &#181;L suspension were bilaterally injected orthotopically into the mammary fat pads using a 26 G needle. Notably, no anesthetic was required, and the total procedure time was under 5 min, from cell preparation to injection. After a growth period of several months, tumors were excised and processed for authentication. Validation included receptor status assessment using immunohistochemistry with specific antibodies for traditional BC receptors (i.e., ER, PR, HER2). Tumor morphology was confirmed with hematoxylin and eosin (H&amp;E) staining, which was interpreted by a pathologist. Genetic similarity to the patient sample was verified through bulk RNA sequencing and short tandem repeat (STR) analysis. This approach to PDX engraftment and validation supports the rigorous development of models and high-throughput tumor implantation, enabling well-powered studies across various BC subtypes.

This protocol describes an efficient, non-surgical method for the orthotopic implantation of breast cancer patient-derived xenografts in mice. The technique involves enzymatic tumor dissociation followed by direct injection into the mammary fat pads, enabling high-throughput implantation. Comprehensive validation ensures model fidelity, facilitating rigorous studies across various breast cancer subtypes.

乳がん患者由来異種移植片のハイスループット解離と同所性移植

Patient-derived xenografts (PDXs) provide a clinically relevant method for recapitulating tumor-involved cell types and the tumor microenvironment, which ...

乳癌の前臨床モデルとしての乳房腫瘍の移植性

要約

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乳癌の肝転移を研究するためのポータル静脈注射モデル

マウス乳腺の脂肪パッドに乳癌細胞の同所性同種注入

交感性乳癌モデルを用いたトリプルネガティブ乳癌の研究

固形腫瘍移植による骨原発性骨腫瘍と骨転移のモデリング

インビボ同所注射された乳房腫瘍細胞の自然肺転移を測定するためのイメージング

インビボ同所注射された乳房腫瘍細胞の自然肺転移を測定するためのイメージング

腫瘍増殖を研究するためにマウスの乳房脂肪パッド中に乳癌細胞の同所注入。

乳がん患者由来異種移植片のハイスループット解離と同所性移植

乳がん患者由来異種移植片のハイスループット解離と同所性移植

乳がん患者由来異種移植片のハイスループット解離と同所性移植

乳癌の前臨床モデルとしての乳房腫瘍の移植性

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乳癌の肝転移を研究するためのポータル静脈注射モデル

マウス乳腺の脂肪パッドに乳癌細胞の同所性同種注入

交感性乳癌モデルを用いたトリプルネガティブ乳癌の研究

固形腫瘍移植による骨原発性骨腫瘍と骨転移のモデリング

インビボ 同所注射された乳房腫瘍細胞の自然肺転移を測定するためのイメージング

インビボ 同所注射された乳房腫瘍細胞の自然肺転移を測定するためのイメージング

腫瘍増殖を研究するためにマウスの乳房脂肪パッド中に乳癌細胞の同所注入。

乳がん患者由来異種移植片のハイスループット解離と同所性移植

乳がん患者由来異種移植片のハイスループット解離と同所性移植

乳がん患者由来異種移植片のハイスループット解離と同所性移植

インビボ同所注射された乳房腫瘍細胞の自然肺転移を測定するためのイメージング

インビボ同所注射された乳房腫瘍細胞の自然肺転移を測定するためのイメージング