Ce travail a été soutenu par les National Institutes of Health (R37CA228304 et R01HL146642 à Xi Chen, CA148761 à Jeffrey M. Rosen), le Département de la Défense des États-Unis (W81XWH-19-1-0524 à Xi Chen, W81XWH-19-1-0035 à Xiangdong Lv), l’American Cancer Society (RSG-18-181-01-TBE à Xi Chen) et le Cancer Prevention and Research Institute of Texas (RR150009 CPRIT Scholar in Cancer Research Award à Xi Chen), la xénogreffe dérivée du patient et les modèles in vivo avancés Core au Baylor College of Medicine (financement du RP170691 CPRIT Core Facility Award et de la subvention de soutien du centre de cancérologie NCI-CA125123 P30).

Tous les protocoles utilisant des animaux ont été examinés et approuvés par le Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux (IACUC). Les fragments tumoraux, d’une taille d’environ 1−2 mm3, proviennent de stocks congelés de manière viable obtenus à partir de la xénogreffe dérivée du patient et du noyau de modèles in vivo avancés du Baylor College of Medicine.
1. Préparation de fragments de tumeur mammaire cryoconservés pour la transplantation
<ol><li>Transférer le cryovial avec des fragments de tumeur de l’azote liquide dans un bain-marie à 37 °C.</li>
	<li>Agiter le cryovial avec un léger coup occasionnel pendant la décongélation.</li>
	<li>Une fois le tissu décongelé, sortez le cryovial du bain-marie et mélangez par inversion douce.</li>
	<li>Sécher l’extérieur du cryovial et vaporiser avec de l’éthanol à 70%. Transférez-le sur une hotte de biosécurité.</li>
	<li>Transférer les tissus tumoraux décongelés dans un tube conique de 15 mL rempli de 10 mL de milieu Eagle modifié (DMEM) froid de Dulbecco. Bien mélanger en inversant le tube. Laissez les fragments de tissu se déposer au fond du tube.</li>
	<li>Aspirer le surnageant et le resussaisir dans 10 mL de DMEM froid. Bien mélanger en inversant le tube. Laissez les fragments de tissu se déposer au fond du tube.</li>
	<li>Aspirer le surnageant et le resussaisir dans 10 mL de DMEM froid. Placez le tube sur de la glace. REMARQUE: Le tissu est prêt pour la transplantation.</li>
</ol>2. Collecte et préparation de la tumeur mammaire fraîche pour la transplantation
<ol><li>Euthanasier la souris porteuse de tumeur du sein. REMARQUE: L’hôte PDX peut être des souris femelles SCID / Beige, NSG ou NRG tandis que dans l’étude actuelle, des souris femelles Balb / c âgées de 3 à 5 semaines sont utilisées.</li>
	<li>Vaporiser la région tumorale de la souris euthanasiée avec 70% d’éthanol. REMARQUE: Essayez d’éviter les cheveux avec l’échantillon de tumeur qui pourraient causer la contamination des fragments de tumeur pour le cryostorage ou la transplantation.</li>
	<li>Avec une pince dentelée pour pincer et soulever la peau entourant la tumeur, utilisez des ciseaux pour faire une courte incision.</li>
	<li>Séparez la tumeur de la peau avec les ciseaux pour disséquer toute la tumeur de la souris hôte. Coupez tout tissu de coussinet adipeux de souris restant de la surface externe de la tumeur. Placez la tumeur dans un tube conique de 15 mL rempli de 5 mL de DMEM froid. REMARQUE: Utilisez des tumeurs d’une taille maximale de 1 cm de diamètre, car les tumeurs plus grandes sont susceptibles de contenir des noyaux nécrotiques.</li>
	<li>Dans une hotte de biosécurité, transférer la tumeur disséquée dans une boîte de Petri stérile de 10 cm contenant suffisamment de DMEM pour éviter le dessèchement.</li>
	<li>Couper la tumeur en 1 mm3 fragments avec scalpel ou lame dans des conditions aseptiques. REMARQUE: Le scalpel ou la lame doit être exposé sous UV dans la hotte de biosécurité pendant au moins 20 minutes avant utilisation.</li>
	<li>Transférer les fragments tumoraux dans un tube conique de 15 mL rempli de DMEM froid. Placez le tube sur de la glace. REMARQUE: Le tissu est prêt pour la transplantation. Les fragments tumoraux disséqués de l’étape 2.4 peuvent être, 1) congelés dans de l’azote liquide pour l’extraction de protéines et d’ARN / ADN, 2) fixés avec 4% de paraformaldéhyde (PFA) ou 10% de for formel tamponné neutre (NBF) pour l’analyse de l’hématoxyline et de l’éosine (H & E) et de l’immunohistochimie (IHC), ou 3) cryoconservés dans un milieu de congélation de 1,25 mL (10% de diméthylsulfoxyde [DMSO], 40 % de DMEM et 50 % de sérum fœtal bovin [FBS]) par congélation lente dans un congélateur à -80 °C pendant la nuit, puis transfert dans de l’azote liquide pour un stockage à long terme.</li>
</ol>3. Préparer l’animal à la chirurgie
<ol><li>Pour la gestion de la douleur chez les animaux, injecter par voie sous-cutanée de buprénorphine à libération prolongée 60 minutes avant la chirurgie à une dose de 1 mg / kg ou suivre le guide de l’établissement pendant 72 h de couverture analgésique.</li>
	<li>Mettre en place le bloc opératation selon les directives institutionnelles pour les chirurgies aseptiques.</li>
	<li>Anesthésier une femelle de 4 semaines dans une chambre d’induction de l’appareil d’anesthésie à l’isoflurane à raison d’environ 11,25 mL / h. Transférez la souris dans la zone d’intervention, sur la planche de chirurgie stérile (caoutchouc de silicone), où elle recevra une anesthésie à travers un petit masque facial. Mettez la souris sur le dos et collez les jambes dans leurs positions naturelles. REMARQUE: SCID / Beige, NSG ou NRG sont utilisés pour PDX et Balb / c est utilisé pour les modèles de greffe GEMM.</li>
	<li>Appliquez une pommade ophtalmique sur les yeux pour prévenir la sécheresse.</li>
	<li>Confirmez le niveau approprié de sédation par pincement des orteils. REMARQUE: Aucune réponse / mouvement de l’animal indique que l’animal est suffisamment anesthésique et prêt pour la chirurgie.</li>
	<li>Rasez la souris sur le bas-ventre, en particulier la région autour du quatrième mamelon où la chirurgie aura lieu.</li>
	<li>En utilisant un mouvement circulaire et en commençant au centre du site chirurgical, travaillez vers les bords extérieurs avec un gommage chirurgical à la povidone-iode, suivi de l’élimination de la povidone-iode avec un tampon à 70% d’isopropyléthanol. Répétez deux fois de plus.</li>
</ol>4. Transplantation de fragments tumoraux dans le quatrième coussinet adipeux mammaire (inguinal)
<ol><li>Utilisez un drap chirurgical stérile pour couvrir le corps de l’animal, à l’exception du site d’incision. REMARQUE: Confirmez le niveau approprié de sédation par pincement des orteils avant de faire l’incision.</li>
	<li>À l’aide de pinces dentelées, pincez et soulevez la peau au niveau du mamelon n ° 4.</li>
	<li>Avec le côté émoussé vers le bas, utilisez des ciseaux pour faire une courte incision parasagittale (environ 1 cm), du mamelon n ° 4 vers la tête.</li>
	<li>À l’aide d’un applicateur à pointe de coton, séparez la peau du péritoine du côté médial de l’incision.</li>
	<li>Tout en tenant le côté latéral de l’incision, pelez doucement le tampon adipeux mammaire n ° 4 de la peau en utilisant le même écouvillon.</li>
	<li>Une fois le coussinet adipeux séparé, épinglez la peau avec une aiguille de 27 G près du corps de l’animal.</li>
	<li>S’il est expérimentalement nécessaire de nettoyer le coussinet graisseux de l’épithélium mammaire endogène de la souris, effectuez les étapes suivantes.<ol>
<li>À l’aide de la pince dentelée, étendez doucement le coussinet adipeux loin du corps et localisez le ganglion lymphatique inguinal, qui se trouve sous les points d’intersection des principaux vaisseaux de la glande (près de l’endroit où le forceps tiendra la glande).</li>
		<li>Cautériser soigneusement les vaisseaux médiaux au ganglion lymphatique et la graisse rejoignant les quatrième et cinquième coussinets de graisse qui forment une zone triangulaire. REMARQUE: Éteignez temporairement la source d’oxygène pour cette étape.</li>
		<li>À l’aide de ciseaux à micro-dissection, coupez chaque vaisseau cautérisé un à la fois (pour vous assurer qu’il n’y a pas de saignement après chaque coupure) jusqu’à ce que la section du coussinet adipeux qui contient le ganglion lymphatique soit enlevée.</li>
		<li>Jetez le tissu du coussinet adipeux « nettoyé ».</li>
	</ol></li>
	<li>Tenez le quatrième coussin de graisse mammaire à l’aide de pinces de séparation émoussées. Avec l’autre main, insérez la pointe fermée de la pince fine inclinée au milieu du coussinet adipeux au-dessus du vaisseau restant et près de la paroi du péritoine. Ouvrez lentement les pinces pour faire une petite poche. Retirez les pinces fines inclinées du coussinet adipeux.</li>
	<li>À l’aide de la pince fine inclinée, prenez un morceau de fragment de tumeur et insérez-le dans la poche.</li>
	<li>Ouvrez lentement les pointes de la pince pour libérer le fragment de tumeur dans la poche du coussinet adipeux.</li>
	<li>Retirez soigneusement les pinces fines inclinées. REMARQUE: Regardez la poche pour confirmer que le fragment de tumeur reste dans la poche du coussinet adipeux mammaire lors du retrait de la pince. Les tumeurs peuvent être implantées dans les deux coussinets graisseux controlatéraux lorsque l’excès de tissu tumoral est nécessaire pour des expériences ou des opérations bancaires. Les animaux avec des greffes recto-verso ne sont pas recommandés pour les études de traitement en raison des interactions connues entre les tumeurs controlatérales. Alternativement, un dispositif de trocart peut être utilisé pour le processus d’implantation.</li>
	<li>En partant de la base de l’incision, collectez la peau de chaque côté à l’aide de la griffe et de la pince dentelée. Rapprochez les deux côtés et soulevez légèrement pour préparer la peau à l’application du clip de plaie. Décurez les bords de l’incision avec la pince à griffes et pincez les bords ensemble pour former une surface continue au sommet.</li>
	<li>En tenant les deux côtés ensemble avec une pince dentelée, utilisez l’applicateur de clip de plaie pour placer un clip de plaie au centre de l’incision. Si nécessaire, appliquez de l’adhésif tissulaire aux extrémités de l’incision afin de les garder fermées et sécurisées.</li>
	<li>Placez l’animal dans une cage propre qui se trouve sur une surface chauffante. Surveillez les saignements, les signes de déhiscence et la douleur pendant la période postchirurgicale. L’animal doit être debout et se déplacer dans les minutes qui ont suivi la réchirurgie.</li>
	<li>Portez une attention particulière au site d’incision et à la santé globale des animaux pendant au moins 3 jours après la chirurgie. Suivez les directives institutionnelles pour la gestion de la douleur.</li>
	<li>Nettoyez les outils chirurgicaux pendant 10 s dans un stérilisateur de perles de verre avant de poursuivre la prochaine greffe. Attendez que les outils refroidissent avant de les utiliser.</li>
	<li>Répétez les étapes 4.1-4.15 jusqu’à ce que toutes les souris soient transplantées. REMARQUE: Une supplémentation en œstrogènes est nécessaire pour les tumeurs ER+, qui peuvent être fournies par l’eau ou des pastilles à libération lente59.</li>
</ol>5. Surveillance de la croissance tumorale en réponse au traitement médicamenteux
REMARQUE: Les tumeurs palpables des PDX transplantables établis et des tumeurs p53-null prennent entre 2 semaines et 8 semaines à se développer après la chirurgie, en fonction des taux de croissance tumorale intrinsèques.
<ol><li>Mesurez les tumeurs en deux dimensions à l’aide d’étriers deux fois par semaine. Calculez le volume à l’aide de la formule suivante : Volume tumoral (mm3)= L2 x L/2 où W est la largeur et L est la longueur de la tumeur.</li>
	<li>Commencer le traitement médicamenteux lorsque le volume de la tumeur atteint 150−300 mm3. REMARQUE: Selon la propriété des médicaments, le gavage oral ou l’injection intrapéritonéale peut être utilisé pour délivrer les médicaments.</li>
	<li>Prélever des échantillons de tumeurs et effectuer la coloration IHC60,l’isolement des protéines et de l’ARN / ADN et le phénotypage immunitaire61 à diverses fins. Prélever du sang et effectuer un phénotypage immunitaire ou l’utiliser pour des études pharmacocinétiques / pharmacodynamiques.</li>
</ol>

MTL est le fondateur d’un commanditaire de StemMed, Ltd. et fondateur et gestionnaire de StemMed Holdings, son commandité. MTL est l’un des fondateurs et des actionnaires de Tvardi Therapeutics, Inc. LED est un employé rémunéré de StemMed, Ltd.

Pour réduire les variations de la croissance tumorale entre les animaux, il est essentiel de couper le tissu tumoral en fragmentsde 1 mm 3 pour la transplantation. Les modèles qui développent des tissus mous sont plus difficiles à travailler et les fragments tumoraux doivent être coupés légèrement plus grands (1−2 mm3). Lorsque vous placez le tissu dans la poche du coussin adipeux mammaire, veillez à ne pas diviser le tissu en plusieurs morceaux, car cela entraînerait de multiples petite...

La plupart des décès par cancer du sein peuvent être attribués à une maladie récurrente résistante aux thérapies conventionnelles1,2. L’hétérogénéité inter- et intra-tumorale des cancers du sein contribue à la résistance au traitement. De plus, l’hétérogénéité tumorale peut empiétiser sur un pronostic précis et remettre en question la prise en charge de la maladie3,4. L’identification de biomarqueurs prédictifs de la réponse améliorera considérablement les résultats cliniques des patientes atteintes d’un cancer du sein. Même si la plupart des types de cancer du sein sont des tumeurs immunologiquement « froides » qui ne répondent probablement pas à l’immunothérapie, les inhibiteurs du point de contrôle immunitaire se sont révélés prometteurs dans les essais cliniques2,5. Par exemple, un essai de phase III a montré une amélioration de la survie sans maladie (DFS) et des preuves préliminaires que l’atezolizumab (anticorps monoclonal contre PD-L1) associé au nab-paclitaxel peut fournir un bénéfice de survie globale par rapport au nab-paclitaxel seul dans les tumeurs présentant une coloration PD-L1 à ≥1%6. Le développement de thérapies qui sensibilisent les tumeurs mammaires à l’immunothérapie révolutionnera les schémas thérapeutiques.
Les modèles précliniques qui récapitulent fidèlement l’hétérogénéité du cancer du sein humain et la réponse aux médicaments sont essentiels pour étudier la biologie tumorale et identifier les biomarqueurs potentiels pour un traitement ciblé. Les lignées cellulaires immortalisées sont largement utilisées pour la recherche sur le cancer du sein, car ces lignées cellulaires sont faciles à cultiver et à modifier génétiquement pour étudier les mécanismes moléculaires. Cependant, en raison de la pression sélective de la culture cellulaire à long terme in vitro, une dérive génétique peut se produire au fil du temps et les lignées cellulaires du cancer du sein peuvent comporter des altérations génomiques spécifiques à la lignée cellulaire qui sont distinctes des aberrations dans les tumeurs mammaires primaires7,8,9.
Les morceaux tumoraux de xénogreffe dérivés du patient (PDX) sont capables de récapituler l’hétérogénéité de la maladie humaine et sont histologiquement et immunohistochimiquement similaires à la tumeur d’origine10,11,12,13,14,15, 16,17,18,19,20,21,22 ,23,24,25,26,27,28,29. Il est important de savoir que les modèles PDX sont phénotypiquement stables sur plusieurs transplantations, comme en témoignent l’histologie, le transcriptome, le protéome etl’analysegénomique 10,11,12,13,14,15,16,17,18 ,19,20,21,22 ,23,24,25,26,27,28,29. Les modèles PDX montrent des réponses au traitement comparables à celles observées cliniquement10,11,12,13, 14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24, 25,26,27,28,29. Des modèles PDX pour les modèles PDX positifs aux récepteurs des œstrogènes (ER+),positifs aux récepteurs de la progestérone (PR+),positifs au facteur de croissance épidermique 2 (ERBB2+,HER2+)et triple négatifs du cancer du sein (CSTN) ont été établis et constituent une excellente plate-forme pour tester les thérapies endocriniennes, chimio et ciblées. Cependant, l’une des principales mises en garde des modèles PDX à l’heure actuelle est l’absence d’un système immunitaire fonctionnel chez la souris.
Les modèles murins génétiquement modifiés (GEMM), tels que les modèles de surexpression Trp53 homozygotes null, cMyc, Wnt1, PyMT ou Her2, permettent d’étudier l’initiation, la progression et les métastases tumorales spontanées dans le contexte d’un système immunitaire intact. Cependant, la latence tumorale est longue, ce qui rend difficile la réalisation d’essais précliniques avec plusieurs bras30,31. Cependant, GEMM peut être transplanté sur des hôtes syngéniques pour générer un nombre suffisant de tumeurs qui récapitulent étroitement les tumeurs humaines32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42,43,44,45, 46,47,48,49,50,51,52,53,54,55. Par exemple, l’épithélium mammaire d’une souris BALB/c p53-null a été transplanté dans les coussinets graisseux nettoyés de souris receveuses syngéniques de type sauvage pour former des tumeurs primaires, qui peuvent être transplantées dans des hôtes syngéniques56,57. Les tumeurs p53-null ont récapitulé différents sous-types de tumeurs humaines.
La combinaison de modèles PDX et de GEMM transplantables fournit des outils précliniques précieux pour étudier la biologie des tumeurs mammaires, la réponse aux médicaments et l’immunité antitumorale. Dans le protocole actuel, une méthode de transplantation orthotopique de fragments tumoraux PDX et GEMM dans le coussinet adipeux mammaire de la souris est décrite. Ces modèles se prêtent à des passages en série et conservent généralement un phénotype stable. Pour atténuer le risque de dérive génétique ou de perte d’hétérogénéité entre les passages au fil du temps, plusieurs fragments de tissus sont cryoconservés à chaque passage pour une transplantation ultérieure dans le cas où des changements biologiques ou morphologiques sont observés au fil du temps29,58.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 mg/mL Buprenorphine-SR</td>
			<td>ZooPharm (via BCM veterinarians)</td>
			<td></td>
			<td>Sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>26G syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>148232E</td>
			<td>Sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Betadine Scrub</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>19-027132</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton Swabs</td>
			<td>VWR International Laboratory</td>
			<td>89031-272</td>
			<td>Sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>MT 10-013-CM</td>
			<td>Sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electric shaver</td>
			<td>Oster</td>
			<td>78005-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass beads sterilizer (Germinator)</td>
			<td>Roboz Surgical Store</td>
			<td>DS-401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lubricant ophthalmic ointment</td>
			<td>Akorn Animal Health</td>
			<td>17478-062-35</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Dissecting Forceps; Serrated, Angular (regular forceps)</td>
			<td>Roboz Surgical Store</td>
			<td>RS-5139</td>
			<td>Sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Dissecting Spring Scissors (fat pad cutter)</td>
			<td>Roboz Surgical Store</td>
			<td>RS-5658BT</td>
			<td>Sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Forceps (tissue placing forceps)</td>
			<td>Roboz Surgical Store</td>
			<td>RS-5069</td>
			<td>Sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri Dish</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>08-757- 100D</td>
			<td>Sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile drape</td>
			<td>Sai Infusion Technology</td>
			<td>PSS-SD1</td>
			<td>Sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgery scissors</td>
			<td>Roboz Surgical Store</td>
			<td>RS-5960</td>
			<td>Sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Forceps (claw forceps)</td>
			<td>Roboz Surgical Store</td>
			<td>RS-5158</td>
			<td>Sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wound clip applier</td>
			<td>BD Autoclip Wound System</td>
			<td>01-804</td>
			<td>Sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wound clip remover</td>
			<td>BD Autoclip Wound System</td>
			<td>01-804-15</td>
			<td>Sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wound clips</td>
			<td>BD Autoclip Wound System</td>
			<td>01-804-5</td>
			<td>Sterile</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

orthotopic transplantation of breast tumors as preclinical models for breast cancer

Les modèles précliniques qui récapitulent fidèlement l’hétérogénéité tumorale et la réponse thérapeutique sont essentiels pour la recherche translationnelle sur le cancer du sein. Les lignées cellulaires immortalisées sont faciles à cultiver et à modifier génétiquement pour étudier les mécanismes moléculaires, mais la pression sélective de la culture cellulaire conduit souvent à des altérations génétiques et épigénétiques au fil du temps. Les modèles de xénogreffes dérivées du patient (PDX) récapitulent fidèlement l’hétérogénéité et la réponse médicamenteuse des tumeurs mammaires humaines. Les modèles PDX présentent une latence relativement courte après la transplantation orthotopique qui facilite l’étude de la biologie de la tumeur mammaire et de la réponse aux médicaments. Les modèles murins génétiquement modifiés transplantables permettent l’étude de l’immunité tumorale du sein. Le protocole actuel décrit la méthode de transplantation orthotopique de fragments de tumeur mammaire dans le coussinet adipeux mammaire, suivie de traitements médicamenteux. Ces modèles précliniques fournissent des approches précieuses pour étudier la biologie des tumeurs du sein, la réponse aux médicaments, la découverte de biomarqueurs et les mécanismes de résistance aux médicaments.

La figure 1 montre l’équipement (Figure 1A) et les principales procédures ( Figure1B) de la transplantation orthotopique. La figure 2 montre la caractérisation d’une tumeur PDX transplantée (MC1). Des fragments tumoraux (1 mm3)du modèle MC1 ont été transplantés dans le coussinet de graisse n ° 4 de souris SCID / B...

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Orthotopic Transplantation of Breast Tumors as Preclinical Models for Breast Cancer

Les modèles de xénogreffes dérivées de patients (PDX) et les modèles murins génétiquement modifiés transplantables récapitulent fidèlement les maladies humaines et sont des modèles préférés pour la recherche fondamentale et translationnelle sur le cancer du sein. Ici, une méthode est décrite pour transplanter orthotopiquement des fragments de tumeur mammaire dans le coussinet adipeux mammaire afin d’étudier la biologie tumorale et d’évaluer la réponse médicamenteuse.

Transplantation orthotopique de tumeurs mammaires comme modèles précliniques pour le cancer du sein

Preclinical models that faithfully recapitulate tumor heterogeneity and therapeutic response are critical for translational breast cancer research. ...

orthotopic-transplantation-breast-tumors-as-preclinical-models-for

Research

JoVE Journal

Cancer Research

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Vidéo: Orthotopic Transplantation of Breast Tumors as Preclinical Models for Breast Cancer

Utilizing Functional Genomics Screening to Identify Potentially Novel Drug Targets in Cancer Cell Spheroid Cultures

The identification of functional driver events in cancer is central to furthering our understanding of cancer biology and indispensable for the discovery of the next generation of novel drug targets. It is becoming apparent that more complex models of cancer are required to fully appreciate the contributing factors that drive tumorigenesis in vivo and increase the efficacy of novel therapies that make the transition from pre-clinical models to clinical trials.
Here we present a methodology for generating uniform and reproducible tumor spheroids that can be subjected to siRNA functional screening. These spheroids display many characteristics that are found in solid tumors that are not present in traditional two-dimension culture. We show that several commonly used breast cancer cell lines are amenable to this protocol. Furthermore, we provide proof-of-principle data utilizing the breast cancer cell line BT474, confirming their dependency on amplification of the epidermal growth factor receptor HER2 and mutation of phosphatidylinositol-4,5-biphosphate 3-kinase (PIK3CA) when grown as tumor spheroids. Finally, we are able to further investigate and confirm the spatial impact of these dependencies using immunohistochemistry.

Identifying novel drug targets that transition from pre-clinical testing to human trials is a scientific priority. To that end, here we describe a functional genomics approach for examining the impact of gene depletion on cancer cell line spheroids, which more appropriately model human cancers in vivo.

Utilisant la génomique fonctionnelle de dépistage pour identifier les cibles de médicaments potentiellement nouveaux dans Cancer Cell Cultures Spheroid

The identification of functional driver events in cancer is central to furthering our understanding of cancer biology and indispensable for the discovery ...

Recherche

Recherche en cancérologie

Ultrasonographic Evaluation of Breast Cancer-related Lymphedema

Lymphedema is one of the most common complications after breast cancer surgery. There are many diagnostic tools for lymphedema, but no standard method yet exists. Progressive Resistance Exercise (PRE) is expected to improve lymphedema without additional swelling. This study showed the therapeutic effects of PRE on lymphedema by using ultrasonography to measure the change in thickness of the muscle and subcutaneous tissue. The thickness of subcutaneous tissue decreased more in the PRE group than in the non-PRE group. Ultrasonography is widely used in many clinics because of its easy accessibility, safety, and inexpensiveness. Ultrasound is one of the best tools for diagnosing and determining treatment efficacy on breast cancer-related lymphedema (BCRL).

This study utilized ultrasonography for diagnosis and follow-up tests to confirm treatment efficacy of Progressive Resistance Exercise (PRE) in breast cancer-related lymphedema (BCRL). Ultrasonography can be applied effectively to ensure diagnosis and treatment of lymphedema.

Échographique Évaluation du lymphœdème lié au cancer du sein-

Lymphedema is one of the most common complications after breast cancer surgery. There are many diagnostic tools for lymphedema, but no standard method yet ...

Invasive Behavior of Human Breast Cancer Cells in Embryonic Zebrafish

In many cases, cancer patients do not die of a primary tumor, but rather because of metastasis. Although numerous rodent models are available for studying cancer metastasis in vivo, other efficient, reliable, low-cost models are needed to quickly access the potential effects of (epi)genetic changes or pharmacological compounds. As such, we illustrate and explain the feasibility of xenograft models using human breast cancer cells injected into zebrafish embryos to support this goal. Under the microscope, fluorescent proteins or chemically labeled human breast cancer cells are transplanted into transgenic zebrafish embryos, Tg (fli:EGFP), at the perivitelline space or duct of Cuvier (Doc) 48 h after fertilization. Shortly afterwards, the temporal-spatial process of cancer cell invasion, dissemination, and metastasis in the living fish body is visualized under a fluorescent microscope. The models using different injection sites, i.e., perivitelline space or Doc are complementary to one another, reflecting the early stage (intravasation step) and late stage (extravasation step) of the multistep metastatic cascade of events. Moreover, peritumoral and intratumoral angiogenesis can be observed with the injection into the perivitelline space. The entire experimental period is no more than 8 days. These two models combine cell labeling, micro-transplantation, and fluorescence imaging techniques, enabling the rapid evaluation of cancer metastasis in response to genetic and pharmacological manipulations.

Here, we describe xenograft zebrafish models using two different injection sites, i.e., perivitelline space and duct of Cuvier, to investigate the invasive behavior and to assess the intravasation and extravasation potential of human breast cancer cells, respectively.

Comportement invasif des cellules cancéreuses du sein humain dans Embryonic Zebrafish

In many cases, cancer patients do not die of a primary tumor, but rather because of metastasis. Although numerous rodent models are available for studying ...

Development of a Human Preclinical Model of Osteoclastogenesis from Peripheral Blood Monocytes Co-cultured with Breast Cancer Cell Lines

The crosstalk between tumor cells and bone cells in the bone microenvironment is crucial to understanding the mechanism of bone metastasis formation. We developed an in vitro fully human preclinical model of a co-culture of breast cancer cells and monocytes undergoing differentiation towards osteoclasts. We optimized a model of osteoclastogenesis starting from a sample of peripheral blood collected from healthy donors. Peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) were first separated by density gradient centrifugation, seeded at a high density and induced to differentiate by adding two growth factors (GFs): receptor activator of nuclear factor-&#954;B ligand (RANKL) and macrophage colony-stimulating factor (MCSF). The cells were left in culture for 14 days and then fixed and analyzed by downstream analysis. In osteolytic bone metastases, one of the effects of cancer cell arrival in bone is the induction of osteoclastogenesis. We thus challenged our model with co-cultures of breast cancer cells to study the differentiation power of cancer cells with respect to GFs. A straightforward way of studying cancer cell-osteoclast interaction is to perform indirect co-cultures based on the use of conditioned medium collected from breast cancer cell cultures and mixed with fresh medium. This mixture is then used to induce osteoclast differentiation. We also optimized a method of direct co-culture in which cancer cells and monocytes undergoing differentiation share the medium and exchange secreted factors. This is a significant improvement over the original indirect co-culture method as researchers can observe the reciprocal interactions of the two cell types and perform downstream analyses for both cancer cells and osteoclasts. This method enables us to study the effect of drugs on the metastatic bone microenvironment and to seed cell lines other than those derived from breast cancer. The model can also be used to study other diseases such as osteoporosis or other bone conditions.

This protocol describes development of an in vitro human preclinical model of osteoclastogenesis from peripheral blood monocytes cultured with breast cancer cell lines to mimic the cancer cell-osteoclast interaction. The model could be used to further our understanding of bone metastasis formation and improve therapeutic options.

Développement d’un humain modèle préclinique de Osteoclastogenesis de Monocytes du sang périphérique conjointement mis en culture avec des lignées cellulaires de Cancer du sein

The crosstalk between tumor cells and bone cells in the bone microenvironment is crucial to understanding the mechanism of bone metastasis formation. We ...

The Application of 1% Methylene Blue Dye As a Single Technique in Breast Cancer Sentinel Node Biopsy

In this study, we injected 1% methylene blue dye (MBD) into the subareolar or peritumoral space of the breast. In the case of breast conserving surgery (BCS), a separate incision in the lower axilla hairline was made to find the sentinel nodes (SNs). In mastectomy, the SNs were identified through the same mastectomy incision. The SNs were described as blue nodes or nodes with lymphatic blue channels. An anatomical landmark in the axilla was used to facilitate SNs identification. The SNs metastases were evaluated by intraoperative frozen section analysis and histopathology examination as it is a gold standard. Here, we described the MBD as the lone technique in breast cancer sentinel node biopsy (SNB) which could be useful when radioisotope tracer or patent or isosulfan blue dye (PBD) cannot be provided.

In Indonesia, sentinel node biopsy (SNB) is not routinely performed for breast cancer surgery because of the limitation to provide radioisotope tracer and isosulfan or patent blue dye (PBD). To overcome this obstacle, we applied 1% methylene blue dye (MBD) as a single agent to map the sentinel nodes (SNs).

L'application de 1% de méthylène Blue Dye comme une technique unique dans le cancer du sein Sentinel Node Biopsie

In this study, we injected 1% methylene blue dye (MBD) into the subareolar or peritumoral space of the breast. In the case of breast conserving surgery ...

Orthotopic Injection of Breast Cancer Cells into the Mice Mammary Fat Pad

A proper animal model is crucial for a better understanding of diseases. Animal models established by different methods (subcutaneous injections, xenografts, genetic manipulation, chemical reagents induction, etc.) have various pathological characters and play important roles in investigating certain aspects of diseases. Although no single model can totally mimic the whole human disease progression, orthotopic organs disease models with a proper stromal environment play an irreplaceable role in understanding diseases and screening for potential drugs. In this article, we describe how to implant breast cancer cells into the mammary fat pad in a simple, less invasive, and easy-to-handle way, and follow the metastasis to distant organs. With the proper features of primary tumor growth, breast and nipple pathological changes, and a high occurrence of other organs&#39; metastasis, this model maximumly mimics human breast cancer progression. Primary tumor growth in situ, long-distant metastasis, and the tumor microenvironment of breast cancer can be investigated by using this model.

Here, we present a protocol to implant breast cancer cells into the mammary fat pad in a simple, less invasive, and easy-to-handle way, and this mouse orthotopic breast cancer model with a proper mammary fat pad environment can be used to investigate various aspects of cancer.

Orthotopique l’Injection de cellules cancéreuses du sein dans les coussinets adipeux mammaire de souris

A proper animal model is crucial for a better understanding of diseases. Animal models established by different methods (subcutaneous injections, ...

Obtaining Cancer Stem Cell Spheres from Gynecological and Breast Cancer Tumors

Cancer stem cells (CSC) are a small population with self-renewal and plasticity which are responsible for tumorigenesis, resistance to treatment and recurrent disease. This population can be identified by surface markers, enzymatic activity and a functional profile. These approaches per se are limited, due to phenotypic heterogeneity and CSC plasticity. Here, we update the sphere-forming protocol to obtain CSC spheres from breast and gynecological cancers, assessing functional properties, CSC markers and protein expression. The spheres are obtained with single-cell seeding at low density in suspension culture, using a semi-solid methylcellulose medium to avoid migration and aggregates. This profitable protocol can be used in cancer cell lines but also in primary tumors. The tridimensional non-adherent suspension culture thought to mimic the tumor microenvironment, particularly the CSC-niche, is supplemented with epidermal growth factor and basic fibroblast growth factor to ensure CSC signaling. Aiming for robust identification of CSC, we propose a complementary approach, combining functional and phenotypic evaluation. Sphere-forming capacity, self-renewal and sphere projection area establish CSC functional properties. Additionally, characterization comprises flow cytometry evaluation of the markers, represented by CD44+/CD24- and CD133, and Western blot, considering ALDH. The presented protocol was also optimized for primary tumor samples, following a sample digestion procedure, useful for translational research.

The aim of this methodology is to identify cancer stem cells (CSC) in cancer cell lines and primary human tumor samples with the sphere-forming protocol, in a robust manner, using functional assays and phenotypic characterization with flow cytometry and Western blot.

Obtenir des sphères de cellules souches cancéreuses à partir de tumeurs gynécologiques et du cancer du sein

Cancer stem cells (CSC) are a small population with self-renewal and plasticity which are responsible for tumorigenesis, resistance to treatment and ...

Studying Triple Negative Breast Cancer Using Orthotopic Breast Cancer Model

Triple-negative breast cancer (TNBC) is an aggressive breast cancer subtype with limited therapeutic options. When compared to patients with less aggressive breast tumors, the 5-year survival rate of TNBC patients is 77% due to their characteristic drug-resistant phenotype and metastatic burden. Toward this end, murine models have been established aimed at identifying novel therapeutic strategies limiting TNBC tumor growth and metastatic spread. This work describes a practical guide for the TNBC orthotopic model where MDA-MB-231 breast cancer cells suspended in a basement membrane matrix are implanted in the fourth mammary fat pad, which closely mimics the cancer cell behavior in humans. Measurement of tumors by caliper, lung metastasis assessment via in vivo and ex vivo imaging, and molecular detection are discussed. This model provides an excellent platform to study therapeutic efficacy and is especially suitable for the study of the interaction between the primary tumor and distal metastatic sites.

This work presets an advanced protocol to accurately assess tumor loading by detection of green fluorescent protein and bioluminescence signals as well as the integration of quantitative molecular detection technique.

Étudier le cancer du sein triple négatif à l’aide d’un modèle orthotopique de cancer du sein

Triple-negative breast cancer (TNBC) is an aggressive breast cancer subtype with limited therapeutic options. When compared to patients with less ...

Generation of Orthotopic Pancreatic Tumors and Ex vivo Characterization of Tumor-Infiltrating T Cell Cytotoxicity

In vivo models of pancreatic cancer provide invaluable tools for studying disease dynamics, immune infiltration and new therapeutic strategies. The orthotopic murine model can be performed on large cohorts of immunocompetent mice simultaneously, is relatively inexpensive and preserves the cognate tissue microenvironment. The quantification of T cell infiltration and cytotoxic activity within orthotopic tumors provides a useful indicator of an antitumoral response.
This protocol describes the methodology for surgical generation of orthotopic pancreatic tumors by injection of a low number of syngeneic tumor cells resuspended in 5 &#181;L basement membrane directly into the pancreas. Mice bearing orthotopic tumors take approximately 30 days to reach endpoint, at which point tumors can be harvested and processed for characterization of tumor-infiltrating T cell activity. Rapid enzymatic digestion using collagenase and DNase allows a single-cell suspension to be extracted from tumors. The viability and cell surface markers of immune cells extracted from the tumor are preserved; therefore, it is appropriate for multiple downstream applications, including flow-assisted cell sorting of immune cells for culture or RNA extraction, flow cytometry analysis of immune cell populations. Here, we describe the ex vivo stimulation of T cell populations for intracellular cytokine quantification (IFN&#947; and TNF&#945;) and degranulation activity (CD107a) as a measure of overall cytotoxicity. Whole-tumor digests were stimulated with phorbol myristate acetate and ionomycin for 5 h, in the presence of anti-CD107a antibody in order to upregulate cytokine production and degranulation. The addition of brefeldin A and monensin for the final 4 h was performed to block extracellular transport and maximize cytokine detection. Extra- and intra-cellular staining of cells was then performed for flow cytometry analysis, where the proportion of IFN&#947;+, TNF&#945;+ and CD107a+ CD4+ and CD8+ T cells was quantified.
This method provides a starting base to perform comprehensive analysis of the tumor microenvironment.

Generation of Orthotopic Pancreatic Tumors and Ex vivo Characterization of Tumor-Infiltrating T Cell Cytotoxicity

This protocol describes the surgical generation of orthotopic pancreatic tumors and the rapid digestion of freshly isolated murine pancreatic tumors. Following digestion, viable immune cell populations can be used for further downstream analysis, including ex vivo stimulation of T cells for intracellular cytokine detection by flow cytometry.

Génération de tumeurs pancréatiques orthopiques et caractérisation ex vivo de la cytotoxicité des cellules T infiltrantes

In vivo models of pancreatic cancer provide invaluable tools for studying disease dynamics, immune infiltration and new therapeutic strategies. The ...

Modeling Breast Cancer in Human Breast Tissue using a Microphysiological System

Breast cancer (BC) remains a leading cause of death for women. Despite more than $700 million invested in BC research annually, 97% of candidate BC drugs fail clinical trials. Therefore, new models are needed to improve our understanding of the disease. The NIH Microphysiological Systems (MPS) program was developed to improve the clinical translation of basic science discoveries and promising new therapeutic strategies. Here we present a method for generating MPS for breast cancers (BC-MPS). This model adapts a previously described approach of culturing primary human white adipose tissue (WAT) by sandwiching WAT between adipose-derived stem cell sheets (ASC)s. Novel aspects of our BC-MPS include seeding BC cells into non-diseased human breast tissue (HBT) containing native extracellular matrix, mature adipocytes, resident fibroblasts, and immune cells; and sandwiching the BC-HBT admixture between HBT-derived ASC sheets. The resulting BC-MPS is stable in culture ex vivo for at least 14 days. This model system contains multiple elements of the microenvironment that influence BC including adipocytes, stromal cells, immune cells, and the extracellular matrix. Thus BC-MPS can be used to study the interactions between BC and its microenvironment. 
We demonstrate the advantages of our BC-MPS by studying two BC behaviors known to influence cancer progression and metastasis: 1) BC motility and 2) BC-HBT metabolic crosstalk. While BC motility has previously been demonstrated using intravital imaging, BC-MPS allows for high-resolution time-lapse imaging using fluorescence microscopy over several days. Furthermore, while metabolic crosstalk was previously demonstrated using BC cells and murine pre-adipocytes differentiated into immature adipocytes, our BC-MPS model is the first system to demonstrate this crosstalk between primary human mammary adipocytes and BC cells in vitro.

This protocol describes the construction of an in vitro microphysiological system for studying breast cancer using primary human breast tissue with off the shelf materials.

Modélisation du cancer du sein dans le tissu mammaire humain à l’aide d’un système microphysiologique

Breast cancer (BC) remains a leading cause of death for women. Despite more than $700 million invested in BC research annually, 97% of candidate BC drugs ...