Bu çalışma Ulusal Sağlık Enstitüleri (R37CA228304 ve R01HL146642'den Xi Chen'e, CA148761'den Jeffrey M. Rosen'a), ABD Savunma Bakanlığı (W81XWH-19-1-0524'ten Xi Chen'e, W81XWH-19-1-0035'ten Xiangdong Lv'ye), Amerikan Kanser Derneği'ne (RSG-18-181-01-TBE'den Xi Chen'e) ve Teksas Kanser Önleme ve Araştırma Enstitüsü'ne (RR150009 CPRIT Bilim Adamı Baylor College of Medicine'daki Hasta Kaynaklı Xenograft ve Advanced In Vivo Models Core (RP170691 CPRIT Core Facility Award ve NCI-CA125123 P30 Cancer Center Support Grant'ten finansman).

Hayvanları kullanan tüm protokoller Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından incelenmiş ve onaylanmıştır. Yaklaşık 1−2 mm3 büyüklüğündeki tümör parçaları, Baylor Tıp Fakültesi'ndeki Hasta Türevli Xenograft ve advanced In Vivo Models Core'dan elde edilen uygun şekilde dondurulmuş stoktandır.
1. Kriyoprezer korunmuş meme tümörü parçalarının transplantasyon için hazırlanması
<ol><li>Tümör parçaları ile cryovial sıvı azottan 37 °C su banyosuna aktarın.</li>
	<li>Çözülme sırasında ara sıra hafif bir fiske ile cryovial'ı ajite edin.</li>
	<li>Doku çözüldükten sonra, cryovial'ı su banyosundan alın ve hafif bir ters çevirme ile karıştırın.</li>
	<li>Cryovial'ın dışını kurulayın ve% 70 etanol ile püskürtün. Biyogüvenlik başlığına aktarın.</li>
	<li>Çözülen tümör dokularını 10 mL soğuk Dulbecco'nun modifiye Eagle ortamı (DMEM) ile dolu 15 mL konik bir tüpe aktarın. Tüpü ters çevirerek iyice karıştırın. Doku parçalarının tüpün dibine yerleşmesine izin verin.</li>
	<li>Süpernatantı aspire edin ve 10 mL soğuk DMEM'de yeniden depolanın. Tüpü ters çevirerek iyice karıştırın. Doku parçalarının tüpün dibine yerleşmesine izin verin.</li>
	<li>Süpernatantı aspire edin ve 10 mL soğuk DMEM'de yeniden depolanın. Tüpü buza yerleştirin. NOT: Doku nakil için hazırdır.</li>
</ol>2. Transplantasyon için taze meme tümörünün toplanması ve hazırlanması
<ol><li>Meme tümörü taşıyan fareyi ötenazi edin. NOT: PDX konağı SCID/Bej, NSG veya NRG dişi fareler olabilirken, mevcut çalışmada 3−5 haftalık dişi Balb/c fareleri kullanılmaktadır.</li>
	<li>Ötenaziye tabi farenin tümör bölgesini% 70 etanol ile püskürtün. NOT: Kriyostoraj veya ekim için tümör parçalarının kirlenmesine neden olabilecek tümör örneği ile saçlardan kaçınmaya çalışın.</li>
	<li>Tümörü çevreleyen cildi çimdiklemek ve kaldırmak için tırtıklı tokmaklarla, kısa bir kesi yapmak için makas kullanın.</li>
	<li>Tüm tümörü konak fareden ayırmak için tümörü makasla deriden ayırın. Tümörün dış yüzeyinden kalan fare yağ yastığı dokusunu kesin. Tümörü 5 mL soğuk DMEM ile dolu 15 mL konik bir tüpe yerleştirin. NOT: Daha büyük tümörlerin nekrotik çekirdek içermesi muhtemel olduğundan, tümörleri maksimum 1 cm çapında kullanın.</li>
	<li>Biyogüvenlik başlığında, parçalanmış tümörü kurumasını önlemek için yeterli DMEM içeren steril 10 cm Petri kabına aktarın.</li>
	<li>Aseptik koşullarda neşter veya bıçak ile tümörü 1 mm3 parçaya bölün. NOT: Neşter veya bıçak, kullanımdan önce biyogüvenlik başlığındaki UV altında en az 20 dakika maruz kalmalıdır.</li>
	<li>Tümör parçalarını soğuk DMEM ile dolu 15 mL konik bir tüpe aktarın. Tüpü buza yerleştirin. NOT: Doku nakil için hazırdır. Adım 2.4'ten parçalanan tümör parçaları olabilir, 1) protein ve RNA / DNA ekstraksiyonu için sıvı nitrojende donmuş snap, 2) hematoksilin ve eozin (H&E) ve immünofizokimya (IHC) analizi için% 4 paraformaldehit (PFA) veya% 10 nötr tamponlu formalin (NBF) ile sabitlenmiş veya 3) 1.25 mL donma ortamında (%10 dimetil sülfit [DMSO], %40 DMEM ve %50 fetal sığır serumu [FBS]), bir gecede -80 °C'lik bir dondurucuda yavaş dondurma ve daha sonra uzun süreli depolama için sıvı nitrojene aktarılarak.</li>
</ol>3. Hayvanı ameliyata hazırlayın
<ol><li>Hayvan ağrısı yönetimi için, subkutan olarak buprenorfin sürekli salınımını ameliyattan 60 dakika önce 1 mg / kg dozda enjekte edin veya 72 saat analjezik kapsama alanı için kurumun kılavuzunu izleyin.</li>
	<li>Cerrahi süiti aseptik ameliyatlar için kurumsal yönergelere göre ayarlayın.</li>
	<li>4 haftalık bir dişiyi izofluran anestezi makinesinin indüksiyon odasında ~11.25 mL/s oranında uyuşturun. Fareyi prosedür alanına, küçük bir yüz maskesiyle anestezi alacağı steril (silikon kauçuk) ameliyat tahtasına aktarın. Fareyi sırtına koyun ve bacakları doğal konumlarında bantleyin. NOT: PDX için SCID/Bej, NSG veya NRG, GEMM nakil modelleri için balb/c kullanılır.</li>
	<li>Kuruluğu önlemek için gözlere oftalmik merhem uygulayın.</li>
	<li>Uygun sedasyon seviyesini parmakla kıstırarak onaylayın. NOT: Hayvanın hiçbir yanıtı/hareketi, hayvanın yeterince uyuşturuldığını ve ameliyata hazır olduğunu gösterir.</li>
	<li>Fareyi alt karın bölgesinde, özellikle ameliyatın yapılacağı dördüncü meme ucunun etrafındaki bölgede tıraş edin.</li>
	<li>Dairesel bir hareket kullanarak ve ameliyat bölgesinin merkezinden başlayarak, povidone-iyot cerrahi scrub ile dış kenarlara doğru çalışın, ardından% 70 izopropil etanol pedi ile povidone-iyot çıkarılması. İki kez daha tekrarlayın.</li>
</ol>4. Tümör parçalarının dördüncü (kasık) meme yağ yastığına nakli
<ol><li>Kesi bölgesi dışında hayvanın vücudunu örtmek için steril bir cerrahi örtü kullanın. NOT: Kesiyi yapmadan önce uygun sedasyon seviyesini parmakla kıstırarak onaylayın.</li>
	<li>Tırtıklı asaların kullanılması cildi 4 numaralı meme ucuna sıkıştırır ve kaldırır.</li>
	<li>Künt tarafı aşağıdayken, #4 meme ucundan başa doğru kısa (yaklaşık 1 cm), parazitik kesi yapmak için makas kullanın.</li>
	<li>Pamuk uçlu bir aplikatör kullanarak, cildi kesiğin medial tarafındaki peritondan ayırın.</li>
	<li>Kesiğin yan tarafını tutarken, aynı bezi kullanarak 4 numaralı meme yağ yastığını deriden hafifçe soyun.</li>
	<li>Yağ yastığı ayrıldıktan sonra, cildi hayvanın vücuduna yakın 27 G'lık bir iğne ile sabitlayın.</li>
	<li>Endojen fare meme epitelinin yağ yastığını temizlemek deneysel olarak gerekliyse aşağıdaki adımları uygulayın.<ol>
<li>Tırtıklı tokaları kullanarak, yağ yastığını vücuttan yavaşça uzatın ve bezdeki ana damarların kesişim noktalarının altında bulunan kasık lenf düğümünü bulun (tokaların bezi tutacağı yere yakın).</li>
		<li>Damarları dikkatlice lenf düğümüne medial ve üçgen bir alan oluşturan dördüncü ve beşinci yağ pedlerine katılan yağlara dağlayın. NOT: Bu adım için oksijen kaynağını geçici olarak kapatın.</li>
		<li>Mikro diseksiyon makası kullanarak, yağ yastığının lenf düğümünü içeren bölümü çıkarılana kadar her koterize damarı teker teker kesin (her kesimden sonra kanama olmamasını sağlamak için).</li>
		<li>"Temizlenmiş" yağ pedi dokusunu atın.</li>
	</ol></li>
	<li>Dördüncü meme yağ yastığını künt ayırma askıları kullanarak tutun. Diğer taraftan, açılı ince tokmakların kapalı ucunu kalan kabın üzerindeki yağ yastığının ortasına ve periton duvarına yakın bir şekilde yerleştirin. Küçük bir cep yapmak için yavaşça tostiki açın. Açılı ince asaları yağ yastığından çıkarın.</li>
	<li>Açılı ince kümes uçlarını kullanarak, bir parça tümör parçası alın ve cebe yerleştirin.</li>
	<li>Tümör parçasını yağ yastığı cebine bırakmak içinps uçlarını yavaşça açın.</li>
	<li>Açılı ince kanatları dikkatlice çekin. NOT: Tümör parçasının, tostu çekerken meme yağ yastığının cebinde kaldığını doğrulamak için cebe bakın. Deneyler veya bankacılık için fazla tümör dokusu gerektiğinde tümörler her iki kontralateral yağ pedine de yerleştirildiğinde. Kontrasepteral tümörler arasındaki bilinen etkileşimler nedeniyle çift taraflı nakilli hayvanlar tedavi çalışmaları için önerilmez. Alternatif olarak, implantasyon işlemi için bir trokar cihazı kullanılabilir.</li>
	<li>Kesi tabanından başlayarak, pençe ve tırtıklı toparlama kullanarak her iki taraftaki cildi toplayın. İki tarafı bir araya getirin ve cildi yara klipsi uygulamasına hazırlamak için hafifçe kaldırın. Kesiğin kenarlarını pençe forsepsleri ile sıkıştırın ve üstte sürekli bir yüzey oluşturmak için kenarları birleştirin.</li>
	<li>İki tarafı tırtıklı tokalarla bir arada tutarak, kesiğin ortasına bir yara klipsi yerleştirmek için yara klipsi aplikatörunu kullanın. Gerekirse, kapalı ve güvenli tutmak için kesi uçlarına doku yapıştırıcısı uygulayın.</li>
	<li>Hayvanı ısınan bir yüzeyde bulunan temiz bir kafese yerleştirin. Postürjik dönemde kanama, dehiscence belirtileri ve ağrı nedir izleyin. Hayvan birkaç dakika içinde ayağa kalkmalı ve hareket etmelidir.</li>
	<li>Ameliyattan sonra en az 3 gün boyunca kesi bölgesine ve hayvanların genel sağlığına çok dikkat edin. Ağrı yönetimi için kurumsal yönergeleri izleyin.</li>
	<li>Bir sonraki nakile devam etmeden önce cerrahi aletleri cam boncuk sterilizatörde 10 sn temizler. Kullanmadan önce aletlerin soğumasını bekleyin.</li>
	<li>Tüm fareler nakledilene kadar 4.1−4.15 adımlarını tekrarlayın. NOT: Su veya yavaş salınım peletleri ile sağlanabilen ER+ tümörler için östrojen takviyesi gereklidir59.</li>
</ol>5. İlaç tedavisine yanıt olarak tümör büyümesinin izlenmesi
NOT: Yerleşik nakledilebilir PDX'lerin ve p53-null tümörlerin palpable tümörlerinin, intrinsik tümör büyüme oranlarına bağlı olarak ameliyat sonrası gelişmesi 2 hafta ile 8 hafta arasında sürer.
<ol><li>Haftada iki kez kaliper kullanarak tümörleri iki boyutta ölçün. Formülü kullanarak birimi hesaplayın: Tümör hacmi (mm3)= W2 x L/2 burada W genişlik ve L tümörün uzunluğudur.</li>
	<li>Tümör hacmi 150−300 mm3'eulaştığında ilaç tedavisine başlayın. NOT: İlaçların özelliğine bağlı olarak, ilaçların teslimi için oral gavage veya intraperitoneal enjeksiyon kullanılabilir.</li>
	<li>Tümör örneklerini toplayın ve çeşitli amaçlar için IHC boyama60,protein ve RNA/DNA izolasyonu ve immün fenotipleme61 gerçekleştirin. Kan toplayın ve immün fenotipleme gerçekleştirin veya farmakokinetik / farmakodinamik çalışmalar için kullanın.</li>
</ol>

MTL, StemMed, Ltd.'de sınırlı bir ortağın kurucusu ve genel ortağı stemmed holdings'in kurucusu ve yöneticisidir. MTL, Tvardi Therapeutics, Inc.'in kurucusu ve özkaynak sahibidir ve StemMed, Ltd.'nin telafi edilmiş bir çalışanıdır.

Hayvanlar arasında tümör büyümesindeki varyasyonları azaltmak için, tümör dokusunun transplantasyon için 1 mm3 parçaya kesilmesi kritik öneme sahiptir. Yumuşak doku büyüyen modellerle çalışmak daha zordur ve tümör parçalarının biraz daha büyük kesilmesi gerekir (1−2 mm3). Dokuyu meme yağ yastığı cebine yerleştirirken, birden fazla küçük tümöre veya garip şekilli tümörlere neden olacağından, dokuyu birden fazla parçaya bölmemeye dikkat edin.
<p class="j...

Meme kanseri ölümlerinin çoğu konvansiyonel tedavilere dirençli tekrarlayan hastalığa atfedilebilir1,2. Meme kanserlerinin tümörler arası ve tümör içi heterojenliği tedavi direncine katkıda bulunur. Ayrıca, tümör heterojenliği doğru prognoza engel olabilir ve hastalık yönetimine meydan okuyabilir3,4. Yanıtın tahmine dayalı biyobelirteçlerinin tanımlanması, meme kanseri olan hastaların klinik sonuçlarını önemli ölçüde iyileştirecektir. Meme kanseri türlerinin çoğu immünoterapiye tepkisiz olması muhtemel immünolojik olarak 'soğuk' tümörler olsa da, immün kontrol noktası inhibitörleri klinik çalışmalarda umut vaat etmişlerdir2,5. Örneğin, faz III denemesi, hastalıksız sağkalımda (DFS) iyileşme olduğunu ve atezolizumab'ın (PD-L1'e karşı monoklonal antikor) nab-paclitaxel ile birlikte% ≥1 PD-L1 boyama6olan tümörlerde tek başına nab-paclitaxel ile karşılaştırıldığında genel bir sağkalım yararı sağlayabileceğini göstermiştir. Meme tümörlerini immünoterapiye duyarlı hale getiren tedavilerin geliştirilmesi tedavi rejimlerinde devrim yapacaktır.
İnsan meme kanseri heterojenliğini ve ilaç yanıtını sadık bir şekilde nükseden preklinik modeller, tümör biyolojisini incelemek ve hedefe yönelik tedavi için potansiyel biyobelirteçleri tanımlamak için kritik öneme sahiptir. Ölümsüzleştirilmiş hücre hatları meme kanseri araştırmaları için yaygın olarak kullanılmaktadır, çünkü bu hücre çizgilerinin büyümesi kolaydır ve moleküler mekanizmaları incelemek için genetik olarak modifiye edilir. Bununla birlikte, uzun süreli hücre kültürü in vitrosundan kaynaklanan seçici basınç nedeniyle, zamanla genetik sürüklenme meydana gelebilir ve meme kanseri hücre çizgileri primer meme tümörlerindeki sapmalardan farklı hücre hattına özgü genomik değişiklikler taşıyabilir7,8,9.
Hasta türevi ksinograft (PDX) tümör parçaları insan hastalığının heterojenliğini yeniden yakalayabilir ve histolojik ve immünohistokimyasal olarak 10 ,11 , 12,13,14,15,16, 17,18,19,20 , 21,22 ,23,24,25,26,27,28,29. Daha da önemlisi, PDX modelleri histoloji, transkriptom, proteom ve genomik analiz 10 , 11 , 12 ,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22ile kanıtlanan birden fazla transplantasyonda fenotipik olarak stabildir. ,23,24,25,26,27,28,29. PDX modelleri klinik olarak gözlenenlerle karşılaştırılabilir tedavi yanıtları gösterir10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24, 25,26,27,28,29. Östrojen reseptörü pozitif (ER+), progesteron reseptör pozitif (PR+), epidermal büyüme faktörü 2 pozitif (ERBB2+, HER2+) ve üçlü negatif meme kanseri (TNBC) PDX modelleri oluşturulmuş dır ve endokrin, kemoterapi ve hedefe yönelik tedavileri test etmek için mükemmel bir platform sağlar. Bununla birlikte, şu anda PDX modellerinin ana uyarılarından biri, farede işlevsel bir bağışıklık sisteminin olmamasıdır.
Trp53 homozygous null, cMyc, Wnt1, PyMT veya Her2 overexpression modelleri gibi genetik olarak tasarlanmış fare modelleri (GEMM), bozulmamış bir bağışıklık sistemi bağlamında spontan tümör başlatma, ilerleme ve metastaz çalışmasına izin verir. Bununla birlikte, tümör gecikmesi uzundur, bu da birden fazla kolla preklinik denemelerin yapılmasını zorlaştırır30,31. Bununla birlikte, GEMM, insan tümörlerini yakından rekapitula eden yeterli sayıda tümör oluşturmak için singeneik konaklara nakledilebilir32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42,43,44,45, 46,47,48,49,50,51,52,53,54,55. Örneğin, bir p53-null BALB / c faresinden meme epitel, singeneik vahşi tip alıcı farelerin temizlenmiş yağ pedlerine nakledilerek birincil tümörler oluşturulmuştur, bu da singeneik konaklara daha fazla nakledilebilir56,57. P53-null tümörler insan tümörlerinin farklı alt tiplerini yeniden nükset etti.
PDX modelleri ve nakledilebilir GEMM kombinasyonu, meme tümörü biyolojisi, ilaç yanıtı ve anti-tümör bağışıklığını araştırmak için değerli preklinik araçlar sağlar. Mevcut protokolde, PDX ve GEMM tümör parçalarının fare meme yağ yastığına ortotopik nakli yöntemi açıklanmıştır. Bu modeller seri pasajlar için uygundur ve genellikle kararlı bir fenotip tutar. Zaman içinde pasajlarda genetik sürüklenme veya heterojenlik kaybını azaltmak için, biyolojik veya morfolojik değişikliklerin zaman içinde gözlenmesi durumunda sonraki transplantasyon için her pasajda birden fazla doku parçası kriyoprezerserved edilir29,58.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 mg/mL Buprenorphine-SR</td>
			<td>ZooPharm (via BCM veterinarians)</td>
			<td></td>
			<td>Sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>26G syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>148232E</td>
			<td>Sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Betadine Scrub</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>19-027132</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton Swabs</td>
			<td>VWR International Laboratory</td>
			<td>89031-272</td>
			<td>Sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>MT 10-013-CM</td>
			<td>Sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electric shaver</td>
			<td>Oster</td>
			<td>78005-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass beads sterilizer (Germinator)</td>
			<td>Roboz Surgical Store</td>
			<td>DS-401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lubricant ophthalmic ointment</td>
			<td>Akorn Animal Health</td>
			<td>17478-062-35</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Dissecting Forceps; Serrated, Angular (regular forceps)</td>
			<td>Roboz Surgical Store</td>
			<td>RS-5139</td>
			<td>Sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Dissecting Spring Scissors (fat pad cutter)</td>
			<td>Roboz Surgical Store</td>
			<td>RS-5658BT</td>
			<td>Sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Forceps (tissue placing forceps)</td>
			<td>Roboz Surgical Store</td>
			<td>RS-5069</td>
			<td>Sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri Dish</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>08-757- 100D</td>
			<td>Sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile drape</td>
			<td>Sai Infusion Technology</td>
			<td>PSS-SD1</td>
			<td>Sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgery scissors</td>
			<td>Roboz Surgical Store</td>
			<td>RS-5960</td>
			<td>Sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Forceps (claw forceps)</td>
			<td>Roboz Surgical Store</td>
			<td>RS-5158</td>
			<td>Sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wound clip applier</td>
			<td>BD Autoclip Wound System</td>
			<td>01-804</td>
			<td>Sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wound clip remover</td>
			<td>BD Autoclip Wound System</td>
			<td>01-804-15</td>
			<td>Sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wound clips</td>
			<td>BD Autoclip Wound System</td>
			<td>01-804-5</td>
			<td>Sterile</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

orthotopic transplantation of breast tumors as preclinical models for breast cancer

Tümör heterojenliğini ve terapötik yanıtı sadık bir şekilde nükseden preklinik modeller transilyapi meme kanseri araştırmaları için kritik öneme sahiptir. Ölümsüzleştirilmiş hücre hatlarının büyümesi kolaydır ve moleküler mekanizmaları incelemek için genetik olarak modifiye edilir, ancak hücre kültüründen gelen seçici basınç genellikle zaman içinde genetik ve epigenetik değişikliklere yol açar. Hasta kaynaklı ksinograft (PDX) modelleri, insan meme tümörlerinin heterojenliğini ve ilaç yanıtını sadık bir şekilde yeniden özetler. PDX modelleri, meme tümörü biyolojisinin araştırılmasını ve ilaç yanıtını kolaylaştıran ortotopik transplantasyon sonrası nispeten kısa bir gecikme süresi sergiler. Genetik olarak tasarlanmış nakledilebilir fare modelleri meme tümörü bağışıklığının incelenmesini sağlar. Mevcut protokol, meme tümörü parçalarını meme yağ pedi içine ortotopik olarak nakletme yöntemini ve ardından ilaç tedavilerini açıklar. Bu preklinik modeller meme tümörü biyolojisi, ilaç yanıtı, biyobelirteç keşfi ve ilaç direnci mekanizmalarını araştırmak için değerli yaklaşımlar sağlar.

Şekil 1'de ortopedik transplantasyonun ekipmanı (Şekil 1A) ve anahtar prosedürleri (Şekil 1B) göstermektedir. Şekil 2'de nakledilen PDX tümörünün (MC1) karakterizasyonu gösterilmiştir. MC1 modelinin tümör parçaları(1 mm 3),SCID/Bej farelerin 4 numaralı yağ yastığına nakledildi. Bir ay sonra, ortalama tüm...

Watch this Scientific Journal Video about Orthotopic Transplantation of Breast Tumors as Preclinical Models for Breast Cancer at JoVE.com

Orthotopic Transplantation of Breast Tumors as Preclinical Models for Breast Cancer

Hasta kaynaklı ksinograft (PDX) modelleri ve nakledilebilir genetik olarak tasarlanmış fare modelleri insan hastalığına sadık kalınarak rekapitulate edilir ve temel ve çevirisel meme kanseri araştırmaları için tercih edilen modellerdir. Burada, tümör biyolojisini incelemek ve ilaç yanıtını değerlendirmek için meme tümörü parçalarını meme yağ yastığına ortotopik olarak nakleden bir yöntem açıklanmaktadır.

Meme Kanseri için Preklinik Modeller Olarak Meme Tümörlerinin Ortopedik Transplantasyonu

Preclinical models that faithfully recapitulate tumor heterogeneity and therapeutic response are critical for translational breast cancer research. ...

orthotopic-transplantation-breast-tumors-as-preclinical-models-for

Research

JoVE Journal

Cancer Research

5.8K Görüntüleme.  Baylor College of Medicine. Hasta kaynaklı ksinograft (PDX) modelleri ve nakledilebilir genetik olarak tasarlanmış fare modelleri insan hastalığına sadık kalınarak rekapitulate edilir ve temel ve çevirisel meme kanseri araştırmaları için tercih edilen modellerdir. Burada, tümör biyolojisini incelemek ve ilaç yanıtını değerlendirmek için meme tümörü parçalarını meme yağ yastığına ortotopik olarak nakleden bir yöntem açıklanmaktadır.

Video: Orthotopic Transplantation of Breast Tumors as Preclinical Models for Breast Cancer

Utilizing Functional Genomics Screening to Identify Potentially Novel Drug Targets in Cancer Cell Spheroid Cultures

The identification of functional driver events in cancer is central to furthering our understanding of cancer biology and indispensable for the discovery of the next generation of novel drug targets. It is becoming apparent that more complex models of cancer are required to fully appreciate the contributing factors that drive tumorigenesis in vivo and increase the efficacy of novel therapies that make the transition from pre-clinical models to clinical trials.
Here we present a methodology for generating uniform and reproducible tumor spheroids that can be subjected to siRNA functional screening. These spheroids display many characteristics that are found in solid tumors that are not present in traditional two-dimension culture. We show that several commonly used breast cancer cell lines are amenable to this protocol. Furthermore, we provide proof-of-principle data utilizing the breast cancer cell line BT474, confirming their dependency on amplification of the epidermal growth factor receptor HER2 and mutation of phosphatidylinositol-4,5-biphosphate 3-kinase (PIK3CA) when grown as tumor spheroids. Finally, we are able to further investigate and confirm the spatial impact of these dependencies using immunohistochemistry.

Identifying novel drug targets that transition from pre-clinical testing to human trials is a scientific priority. To that end, here we describe a functional genomics approach for examining the impact of gene depletion on cancer cell line spheroids, which more appropriately model human cancers in vivo.

İşlevsel Genomik Tarama kullanılması Kanser Hücre Sfero Kültürleri Potansiyel Yeni İlaç Hedefleri Belirlemek İçin

The identification of functional driver events in cancer is central to furthering our understanding of cancer biology and indispensable for the discovery ...

Kanser Araştırmaları

Ultrasonographic Evaluation of Breast Cancer-related Lymphedema

Lymphedema is one of the most common complications after breast cancer surgery. There are many diagnostic tools for lymphedema, but no standard method yet exists. Progressive Resistance Exercise (PRE) is expected to improve lymphedema without additional swelling. This study showed the therapeutic effects of PRE on lymphedema by using ultrasonography to measure the change in thickness of the muscle and subcutaneous tissue. The thickness of subcutaneous tissue decreased more in the PRE group than in the non-PRE group. Ultrasonography is widely used in many clinics because of its easy accessibility, safety, and inexpensiveness. Ultrasound is one of the best tools for diagnosing and determining treatment efficacy on breast cancer-related lymphedema (BCRL).

This study utilized ultrasonography for diagnosis and follow-up tests to confirm treatment efficacy of Progressive Resistance Exercise (PRE) in breast cancer-related lymphedema (BCRL). Ultrasonography can be applied effectively to ensure diagnosis and treatment of lymphedema.

Meme Kanseri ile ilgili Lenfödem Ultrasonografik Olarak Değerlendirilmesi

Lymphedema is one of the most common complications after breast cancer surgery. There are many diagnostic tools for lymphedema, but no standard method yet ...

Development of a Human Preclinical Model of Osteoclastogenesis from Peripheral Blood Monocytes Co-cultured with Breast Cancer Cell Lines

The crosstalk between tumor cells and bone cells in the bone microenvironment is crucial to understanding the mechanism of bone metastasis formation. We developed an in vitro fully human preclinical model of a co-culture of breast cancer cells and monocytes undergoing differentiation towards osteoclasts. We optimized a model of osteoclastogenesis starting from a sample of peripheral blood collected from healthy donors. Peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) were first separated by density gradient centrifugation, seeded at a high density and induced to differentiate by adding two growth factors (GFs): receptor activator of nuclear factor-&#954;B ligand (RANKL) and macrophage colony-stimulating factor (MCSF). The cells were left in culture for 14 days and then fixed and analyzed by downstream analysis. In osteolytic bone metastases, one of the effects of cancer cell arrival in bone is the induction of osteoclastogenesis. We thus challenged our model with co-cultures of breast cancer cells to study the differentiation power of cancer cells with respect to GFs. A straightforward way of studying cancer cell-osteoclast interaction is to perform indirect co-cultures based on the use of conditioned medium collected from breast cancer cell cultures and mixed with fresh medium. This mixture is then used to induce osteoclast differentiation. We also optimized a method of direct co-culture in which cancer cells and monocytes undergoing differentiation share the medium and exchange secreted factors. This is a significant improvement over the original indirect co-culture method as researchers can observe the reciprocal interactions of the two cell types and perform downstream analyses for both cancer cells and osteoclasts. This method enables us to study the effect of drugs on the metastatic bone microenvironment and to seed cell lines other than those derived from breast cancer. The model can also be used to study other diseases such as osteoporosis or other bone conditions.

This protocol describes development of an in vitro human preclinical model of osteoclastogenesis from peripheral blood monocytes cultured with breast cancer cell lines to mimic the cancer cell-osteoclast interaction. The model could be used to further our understanding of bone metastasis formation and improve therapeutic options.

Osteoclastogenesis periferik kan monosit kültürlü meme kanseri hücre hatları ile birlikte gelen bir insan preklinik modelinin geliştirilmesi

The crosstalk between tumor cells and bone cells in the bone microenvironment is crucial to understanding the mechanism of bone metastasis formation. We ...

The Application of 1% Methylene Blue Dye As a Single Technique in Breast Cancer Sentinel Node Biopsy

In this study, we injected 1% methylene blue dye (MBD) into the subareolar or peritumoral space of the breast. In the case of breast conserving surgery (BCS), a separate incision in the lower axilla hairline was made to find the sentinel nodes (SNs). In mastectomy, the SNs were identified through the same mastectomy incision. The SNs were described as blue nodes or nodes with lymphatic blue channels. An anatomical landmark in the axilla was used to facilitate SNs identification. The SNs metastases were evaluated by intraoperative frozen section analysis and histopathology examination as it is a gold standard. Here, we described the MBD as the lone technique in breast cancer sentinel node biopsy (SNB) which could be useful when radioisotope tracer or patent or isosulfan blue dye (PBD) cannot be provided.

In Indonesia, sentinel node biopsy (SNB) is not routinely performed for breast cancer surgery because of the limitation to provide radioisotope tracer and isosulfan or patent blue dye (PBD). To overcome this obstacle, we applied 1% methylene blue dye (MBD) as a single agent to map the sentinel nodes (SNs).

Meme kanseri Sentinel düğüm biyopsi tek bir tekniği olarak 1% metilen mavi boya uygulaması

In this study, we injected 1% methylene blue dye (MBD) into the subareolar or peritumoral space of the breast. In the case of breast conserving surgery ...

Orthotopic Injection of Breast Cancer Cells into the Mice Mammary Fat Pad

A proper animal model is crucial for a better understanding of diseases. Animal models established by different methods (subcutaneous injections, xenografts, genetic manipulation, chemical reagents induction, etc.) have various pathological characters and play important roles in investigating certain aspects of diseases. Although no single model can totally mimic the whole human disease progression, orthotopic organs disease models with a proper stromal environment play an irreplaceable role in understanding diseases and screening for potential drugs. In this article, we describe how to implant breast cancer cells into the mammary fat pad in a simple, less invasive, and easy-to-handle way, and follow the metastasis to distant organs. With the proper features of primary tumor growth, breast and nipple pathological changes, and a high occurrence of other organs&#39; metastasis, this model maximumly mimics human breast cancer progression. Primary tumor growth in situ, long-distant metastasis, and the tumor microenvironment of breast cancer can be investigated by using this model.

Here, we present a protocol to implant breast cancer cells into the mammary fat pad in a simple, less invasive, and easy-to-handle way, and this mouse orthotopic breast cancer model with a proper mammary fat pad environment can be used to investigate various aspects of cancer.

Fareler meme yağ yastığı içine meme kanser hücrelerinin Orthotopic enjeksiyon

A proper animal model is crucial for a better understanding of diseases. Animal models established by different methods (subcutaneous injections, ...

Obtaining Cancer Stem Cell Spheres from Gynecological and Breast Cancer Tumors

Cancer stem cells (CSC) are a small population with self-renewal and plasticity which are responsible for tumorigenesis, resistance to treatment and recurrent disease. This population can be identified by surface markers, enzymatic activity and a functional profile. These approaches per se are limited, due to phenotypic heterogeneity and CSC plasticity. Here, we update the sphere-forming protocol to obtain CSC spheres from breast and gynecological cancers, assessing functional properties, CSC markers and protein expression. The spheres are obtained with single-cell seeding at low density in suspension culture, using a semi-solid methylcellulose medium to avoid migration and aggregates. This profitable protocol can be used in cancer cell lines but also in primary tumors. The tridimensional non-adherent suspension culture thought to mimic the tumor microenvironment, particularly the CSC-niche, is supplemented with epidermal growth factor and basic fibroblast growth factor to ensure CSC signaling. Aiming for robust identification of CSC, we propose a complementary approach, combining functional and phenotypic evaluation. Sphere-forming capacity, self-renewal and sphere projection area establish CSC functional properties. Additionally, characterization comprises flow cytometry evaluation of the markers, represented by CD44+/CD24- and CD133, and Western blot, considering ALDH. The presented protocol was also optimized for primary tumor samples, following a sample digestion procedure, useful for translational research.

The aim of this methodology is to identify cancer stem cells (CSC) in cancer cell lines and primary human tumor samples with the sphere-forming protocol, in a robust manner, using functional assays and phenotypic characterization with flow cytometry and Western blot.

Jinekolojik ve Meme Kanseri Tümörlerinden Kanser Kök Hücre Kürelerinin Alınması

Cancer stem cells (CSC) are a small population with self-renewal and plasticity which are responsible for tumorigenesis, resistance to treatment and ...

Studying Triple Negative Breast Cancer Using Orthotopic Breast Cancer Model

Triple-negative breast cancer (TNBC) is an aggressive breast cancer subtype with limited therapeutic options. When compared to patients with less aggressive breast tumors, the 5-year survival rate of TNBC patients is 77% due to their characteristic drug-resistant phenotype and metastatic burden. Toward this end, murine models have been established aimed at identifying novel therapeutic strategies limiting TNBC tumor growth and metastatic spread. This work describes a practical guide for the TNBC orthotopic model where MDA-MB-231 breast cancer cells suspended in a basement membrane matrix are implanted in the fourth mammary fat pad, which closely mimics the cancer cell behavior in humans. Measurement of tumors by caliper, lung metastasis assessment via in vivo and ex vivo imaging, and molecular detection are discussed. This model provides an excellent platform to study therapeutic efficacy and is especially suitable for the study of the interaction between the primary tumor and distal metastatic sites.

This work presets an advanced protocol to accurately assess tumor loading by detection of green fluorescent protein and bioluminescence signals as well as the integration of quantitative molecular detection technique.

Ortotopik Meme Kanseri Modeli Kullanarak Üçlü Negatif Meme Kanseri Eğitimi

Triple-negative breast cancer (TNBC) is an aggressive breast cancer subtype with limited therapeutic options. When compared to patients with less ...

Generation of Orthotopic Pancreatic Tumors and Ex vivo Characterization of Tumor-Infiltrating T Cell Cytotoxicity

In vivo models of pancreatic cancer provide invaluable tools for studying disease dynamics, immune infiltration and new therapeutic strategies. The orthotopic murine model can be performed on large cohorts of immunocompetent mice simultaneously, is relatively inexpensive and preserves the cognate tissue microenvironment. The quantification of T cell infiltration and cytotoxic activity within orthotopic tumors provides a useful indicator of an antitumoral response.
This protocol describes the methodology for surgical generation of orthotopic pancreatic tumors by injection of a low number of syngeneic tumor cells resuspended in 5 &#181;L basement membrane directly into the pancreas. Mice bearing orthotopic tumors take approximately 30 days to reach endpoint, at which point tumors can be harvested and processed for characterization of tumor-infiltrating T cell activity. Rapid enzymatic digestion using collagenase and DNase allows a single-cell suspension to be extracted from tumors. The viability and cell surface markers of immune cells extracted from the tumor are preserved; therefore, it is appropriate for multiple downstream applications, including flow-assisted cell sorting of immune cells for culture or RNA extraction, flow cytometry analysis of immune cell populations. Here, we describe the ex vivo stimulation of T cell populations for intracellular cytokine quantification (IFN&#947; and TNF&#945;) and degranulation activity (CD107a) as a measure of overall cytotoxicity. Whole-tumor digests were stimulated with phorbol myristate acetate and ionomycin for 5 h, in the presence of anti-CD107a antibody in order to upregulate cytokine production and degranulation. The addition of brefeldin A and monensin for the final 4 h was performed to block extracellular transport and maximize cytokine detection. Extra- and intra-cellular staining of cells was then performed for flow cytometry analysis, where the proportion of IFN&#947;+, TNF&#945;+ and CD107a+ CD4+ and CD8+ T cells was quantified.
This method provides a starting base to perform comprehensive analysis of the tumor microenvironment.

Generation of Orthotopic Pancreatic Tumors and Ex vivo Characterization of Tumor-Infiltrating T Cell Cytotoxicity

This protocol describes the surgical generation of orthotopic pancreatic tumors and the rapid digestion of freshly isolated murine pancreatic tumors. Following digestion, viable immune cell populations can be used for further downstream analysis, including ex vivo stimulation of T cells for intracellular cytokine detection by flow cytometry.

Ortotopik Pankreas Tümörlerinin Üretimi ve Tümör Efiltrasyonu T Hücre Sitotoksisitesinin Ex vivo Karakterizasyonu

In vivo models of pancreatic cancer provide invaluable tools for studying disease dynamics, immune infiltration and new therapeutic strategies. The ...

Modeling Breast Cancer in Human Breast Tissue using a Microphysiological System

Breast cancer (BC) remains a leading cause of death for women. Despite more than $700 million invested in BC research annually, 97% of candidate BC drugs fail clinical trials. Therefore, new models are needed to improve our understanding of the disease. The NIH Microphysiological Systems (MPS) program was developed to improve the clinical translation of basic science discoveries and promising new therapeutic strategies. Here we present a method for generating MPS for breast cancers (BC-MPS). This model adapts a previously described approach of culturing primary human white adipose tissue (WAT) by sandwiching WAT between adipose-derived stem cell sheets (ASC)s. Novel aspects of our BC-MPS include seeding BC cells into non-diseased human breast tissue (HBT) containing native extracellular matrix, mature adipocytes, resident fibroblasts, and immune cells; and sandwiching the BC-HBT admixture between HBT-derived ASC sheets. The resulting BC-MPS is stable in culture ex vivo for at least 14 days. This model system contains multiple elements of the microenvironment that influence BC including adipocytes, stromal cells, immune cells, and the extracellular matrix. Thus BC-MPS can be used to study the interactions between BC and its microenvironment. 
We demonstrate the advantages of our BC-MPS by studying two BC behaviors known to influence cancer progression and metastasis: 1) BC motility and 2) BC-HBT metabolic crosstalk. While BC motility has previously been demonstrated using intravital imaging, BC-MPS allows for high-resolution time-lapse imaging using fluorescence microscopy over several days. Furthermore, while metabolic crosstalk was previously demonstrated using BC cells and murine pre-adipocytes differentiated into immature adipocytes, our BC-MPS model is the first system to demonstrate this crosstalk between primary human mammary adipocytes and BC cells in vitro.

This protocol describes the construction of an in vitro microphysiological system for studying breast cancer using primary human breast tissue with off the shelf materials.

Mikrofizyolojik Sistem Kullanarak İnsan Meme Dokusunda Meme Kanseri Modellemesi

Breast cancer (BC) remains a leading cause of death for women. Despite more than $700 million invested in BC research annually, 97% of candidate BC drugs ...

Modeling Brain Metastasis Via Tail-Vein Injection of Inflammatory Breast Cancer Cells

Metastatic spread to the brain is a common and devastating manifestation of many types of cancer. In the United States alone, about 200,000 patients are diagnosed with brain metastases each year. Significant progress has been made in improving survival outcomes for patients with primary breast cancer and systemic malignancies; however, the dismal prognosis for patients with clinical brain metastases highlights the urgent need to develop novel therapeutic agents and strategies against this deadly disease. The lack of suitable experimental models has been one of the major hurdles impeding advancement of our understanding of brain metastasis biology and treatment. Herein, we describe a xenograft mouse model of brain metastasis generated via tail-vein injection of an endogenously HER2-amplified cell line derived from inflammatory breast cancer (IBC), a rare and aggressive form of breast cancer. Cells were labeled with firefly luciferase and green fluorescence protein to monitor brain metastasis, and quantified metastatic burden by bioluminescence imaging, fluorescent stereomicroscopy, and histologic evaluation. Mice robustly and consistently develop brain metastases, allowing investigation of key mediators in the metastatic process and the development of preclinical testing of new treatment strategies.

We describe a xenograft mouse model of breast cancer brain metastasis generated via tail-vein injection of an endogenously HER2-amplified inflammatory breast cancer cell line.

İnflamatuar Meme Kanseri Hücrelerinin Kuyruk-Ven Enjeksiyonu ile Beyin Metastazının Modellenmesi

Metastatic spread to the brain is a common and devastating manifestation of many types of cancer. In the United States alone, about 200,000 patients are ...